CC BY
69
УДК 579.252.55:615.332:579.25
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ
МАРКИРОВАНИЕ
ЛАКТОБАКТЕРИЙ,
ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ПРИ
ПРОИЗВОДСТВЕ
КИСЛОМОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ
B. И. Семенихин, д. биол. н.,
C. А. Юрик, к. биол. н., Ю. А. Горбунов, с. н. с., А. Н. Иркитова, к. биол. н. ГНУ ИЭВСиДВ, ГНУ СибНИИС
UDC 579.252.55:615,332:579.25 MOLECULAR AND GENETIC MARKING Of LAKTOBAKTERIA USED IN THE PRODUCTION OF FERMENTED MILK PRODUCTS
на основе референтных синтетические праймеры Lacid1F и и Stt2R,
Semenikhin V.I., Dr. Biol.Sci., Yurik S. A., Cand. Biol.Sci.,.Gorbunov Y.A. IEVSFE RAAS; Irkitova A. N., Cand. Biol.Sci. SNIIS RAAS
There are developed based on the analysis of the genomes of reference strains synthetic oligo-nucleotide primers Lbul4F and Lbul5R, Lacid1F and Lacid2R, Stt1F and Stt2R, possessed specificity and allowed effectively to carry out the identification of strains and cultures of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus and Streptococcus thermophilus in starter cultures and finished fermented dairy products. The specificity of the test DNA fragments by sequencing and comparison by method of alignment with other фрагментов ДНК published sequences of complete
genomes reference strains of these cultures is confirmed.
Разработаны анализа геномов штаммов
олигонуклеотидные Lbul4F и Lbul5R, Lacid2R, Stt1F обладающие специфичностью и позволяющие эффективно
проводить идентификацию
штаммов и культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus и
Streptococcus thermophilus как в заквасочных культурах, так и готовых кисломолочных продуктах. Подтверждена специфичность тестируемых путем секвенирования и
сравнения методом выравнивания с другими опубликованными последовательностями полных геномов референтных штаммов данных культур Ключевые слова: культура, Lactobacillus
штамм, delbrueckii
Lactobacillus
Key words: strain, culture, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus,
PCR,
subsp. bulgaricus,
acidophilus, Streptococcus Streptococcus thermophilus,
thermophilus, ПЦР, праймер primer
Лактобактерии - одна из многочисленных групп микроорганизмов, которые используются в пищевой промышленности при переработке молока и входят в составы бактериальных заквасок. При изготовлении кисломолочных продуктов чаще используют композиции заквасок из следующих лактобактерий - Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus,
Streptococcus thermophilus и Lactobacillus acidophilus. Эти молочнокислые бактерии интенсивно используются в пищевой промышленности и входят в состав бактериальных концентратов для приготовления йогурта, ряженки, варенцов, сметаны, ацидофилина и других ацидофильных напитков. Названные бактерии обладают антагонистической активностью к патогенной, условно-патогенной и технически-вредной микрофлоре.
От качества применяемых стартерных заквасок зависит и качество получаемого продукта при переработке молока. До настоящего времени основным способом типирования штаммов лактококков и лактобацилл является способ микробиологических исследований [1].
Для определения видовой принадлежности лактобацилл применяется ПЦР, с помощью которой осуществляется синтез генов 16S rRNA. Затем ампликоны подвергают гидролизу эндонуклеазами. Фрагменты ДНК анализируют с использованием импульсного гель-электрофореза (PFGE). Данный подход идентификации позволяет определить род лактобацил [2].
Другим вариантом идентификации Streptococcus thermophilus является способ генотипирования по гену 16S rRNA. При этом осуществляется синтез и секвенирование последовательности гена 16S rRNA. Затем проводится сравнение последовательности данного гена с последовательностями, характерными для Streptococcus thermophilus из базы данных GenBank[3].
При определении видовой принадлежности Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus применяется способ генотипирования, включающий синтез ДНК межгенной вставки 16S-23S rRNA с последующим гидролизом ее 11 эндонуклеазами и сравнение полученных паттернов с референтными штаммами. Этот прием позволяет различать почти все изолируемые культуры на уровне вида, но не подвида [4].
К недостаткам данных способов можно отнести необходимость проведения гидролиза и секвенирование ампликонов, сравнение каждого с базой данных GenBank и в результате - длительность процесса тестирования и высокую стоимость.
Целью наших исследований было разработать способ маркирования нуклеотидных последовательностей при помощи специфических синтетических олигонуклеотидных праймеров в ПЦР с использованием в качестве молекулярной мишени ДНК генов, характерных соответственно только для Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, для Streptococcus thermophilus и для Lactobacillus acidophilus.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследованию были подвергнуты культуры, выделенные в разные годы в лаборатории микробиологии ГБНУ СибНИИС
Россельхозакадемии (г. Барнаул). Для выделения ДНК использовали модифицированный нами фенольный метод депротеинизации ДНК из
суспензии штаммов и культур, выращенных на средах Бликфельдта и MRS.
Определение нуклеотидных последовательностей генов, характерных соответственно только для Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, для Streptococcus thermophilus и для Lactobacillus acidophilus, проводили методом выравнивания, а для анализа праймеров по уровню свободной энергии использовали программу OLIGO 4.0. Химический синтез праймеров осуществляли амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U (Biosset Ltd, Новосибирск).
Постановку ПЦР проводили на амплификаторах "Бис" М-105. О результатах судили по размеру синтезированного фрагмента ДНК, мигрирующего в 1,0%-ном геле агарозы при силе тока 35-40 мА. В качестве маркера использовали ДНК pBLSKII(+), гидролизованную MspI. Полученные результаты документировали с помощью цифровой фотокамеры. Результат ПЦР считали положительным, если продукт реакции соответствовал ожидаемому размеру фрагмента ДНК.
Секвенирование ампликонов выполнили по двум цепочкам ДНК, используя общепринятые методики Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук [5] и Максама-Гилберта [6].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ Выбор генов, характерных для соответствующих штаммов, проводили на основе анализа полных геномов референтных штаммов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: ATCC11842, ATCC BAA-365, ND02 и 2038; Streptococcus thermophilus: LMG18311, CNRZ1066 и LMD9 и Lactobacillus acidophilus NCFM, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank Search.html). По результатам поиска были выбраны и синтезированы
олигонуклеотидные праймеры для Lbul4F и Lbul5R , Stt1F и Stt2R, Lacid1 F и Lacid2R. Концентрацию специфических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяли спектрометрическим методом.
При выделении ДНК из бактериальной культуры клетки осаждали в бляшку центрифугированием в течение 1-2 мин. при 5000-7000 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, 50 мкл культуры добавляли к 300 мкл модифицированного раствора фенола, перемешивали и выдерживали при +95°С в течение 5 минут. Затем проводили экстракцию хлороформом. Осаждение ДНК из водной фазы осуществляли этанолом, затем высушивали и растворяли в 30-50 мкл автоклавированной бидистиллированной воды.
Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 25 мкл, используя 10Х стандартный буфер рН 8,8; соответствующие праймеры; 2,5 мМ dNTP, 0,5 е.а. Taq-ДНК полимеразы; 2 мкл пробы ДНК. Программа амплификации состояла из 42 циклов, в том числе по одному циклу прогревание при 95°С и досинтез при 72°С. Отжиг праймеров проходил при 60°С.
Результаты исследований по определению специфичности реакции ПЦР с праймерами Lbul4F- Lbul5R, Lacid1F-Lacid2R и Stt1 F-Stt2R
Наименование культуры ПЦР с праймерами
Lbul4F-Lbul5R Lacid1 F-Lacid2R Stt1 F-Stt2R
Staphylococcus albus — — —
Staphylococcus aureus — — —
Streptococcus epidermitis — — —
Streptococcus pyogenes — — —
Escherihia coli — — —
Lactococcus lactis subsp. lactis С9182 — — —
Lactococcus lactis subsp. cremoris 3М-5 — — —
Lactobac. delbrueckii subsp. bulgaricus 630 + — —
Lactobac. delbr. subsp. bulgaricus 37/402и + — —
Lactobac. delbr. subsp. bulgaricus 317/402в + — —
Lactobac. acidophilus La 5 — + —
Lactobac. acidophilus Lacid 2/5 изолят — + —
Lactobac. acidophilus Lacid 3/5 изолят — + —
Streptococcus termophilus 28-2 — — +
Streptococcus thermophilus 1244 — — +
Streptococcus thermophilus 1254 — — +
Дистиллированная вода - — —
Продукты ПЦР визуализировали методом электрофореза в трис-боратном буфере с бромистым этидием. Гель просматривали на трансиллюминаторе с длиной волны 254 нм. Результат ПЦР считали положительным, если продукт ПЦР соответствовал размеру фрагмента ДНК, синтезированного праймерами Lbul4F и Lbul5R для L. delbrueckii subsp. bulgaricus в 409 н. п., Lacid1F и Lacid2R для L. acidophilus в 412 н. п. и Stt1F и Stt2R для Str. thermophilus в 665 н. п.
Результаты исследований по определению специфичности реакции с соответствующими праймерами, представленные в сводной таблице, показывают, что положительные анализы продуктов ПЦР получали только тогда, когда в качестве матрицы использовали ДНК, фрагмент которой характерен только для L. delbrueckii subsp. bulgaricus или L. acidophilus, или Str. thermophilus. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий.
Для подтверждения специфичности тестируемого в ПЦР фрагмента ДНК наработали фрагменты ДНК на матрицах L. delbrueckii subsp. bulgaricus шт. 630, L. acidophilus шт. La-5 и Str. thermophilus шт. 1244 и осуществили секвенирование и выравнивание с опубликованными последовательностями. Установили их совпадение с
опубликованными нуклеотидными последовательностями референтных штаммов.
Таким образом разработаны на основе анализа геномов референтных штаммов синтетические олигонуклеотидные праймеры Lbul4F и Lbul5R, Lacid1F и Lacid2R , Stt1F и Stt2R, обладающие специфичностью и позволяющие эффективно проводить идентификацию штаммов и культур Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus как в заквасочных культурах, так и готовых кисломолочных продуктах.
Литература
1. Ботина, С. Г. Штаммы S. thermophilus, ферментирующие галактозу /С. Г. Ботина //Молочная промышленность. - 2008. - № 4. - С. 59.
2. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование / Т.Маниатис , Э.Фрич , Д.Сэмбрук - М.: Мир, 1984. - С. 157-240.
3. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. - Т. 2. - Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльмса. - М.: Мир. - 1997. - С. 560-566.
4. Guan, L. L. Detection of Lactobacillus Acidophilus species in the gut of chickens / L. L. Guan, K.E. Hagen, T.L. Grayson et al. // Zootecnica internacional. - 2007. - 02 January - № 35. - P. 450455.
5. Maxam, F.M., Gilbert W. In: Methods in Ensymology. - 1980. - Vol. 65. - Part. I. - P. 499-550.
6. Moreira, J. L. Identification to the species level of Lactobacillus isolated in probiotic prospecting studies of human, animal or food origin by 16S-23S rRNA restriction profiling / J. L. S Moreira , R. M Mota , M. F Horta et al. // BMC Microbiology. - 2005. - vol. 5. - № 15. - С. 1-9.
