CC BY
25
ВЕСТНИК ГЕМАТОЛОГИИ, том XVIII, № 2, 2022
В.В. Саломашкина\ О.С. Пшеничникова1, Ф.Г. Перина2, В.Л. Сурин1 МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕМОФИЛИИ А В РОССИИ
1 ФГБУ «Национальныймедицинский исследовательский центр гематологии», Москва
2 ГАУЗ СО «Областная детская клиническая больница», Екатеринбург
Введение. Гемофилия А (ГА) - распространенное Х-сцепленное генетическое заболевание (около 1 на 5000 мужчин), обусловленное отсутствием или дефектами фактора свертываемости крови FVIII, кодируемого геном F8. Генетические нарушения, приводящие к ГА, в большинстве своем уникальны за исключением двух часто повторяющихся инверсий в области интронов 22 (^22) и 1 (ту1), обуславливающих около 50% и 5% случаев тяжелой ГА, соответственно.
Цель. Определение спектра мутаций в гене F8, характерного для больных ГА в России, и оптимизация на его основе алгоритма молекулярной диагностики этого заболевания.
Материалы и методы. Материал от больных ГА и представителей их семей был собран в рамках многолетней работы по молекулярной диагностике ГА в России. Тотальную ДНК выделяли из цельной крови и сухих пятен крови с помощью фенол-хлороформного метода. При поиске мутаций в гене F8 у больных с тяжелой формой ГА сначала проверяли наличие инверсий ^22 и ^1, после чего для тех, у кого они не были выявлены, проводили секвенирование по методу Сэнгера всех экзонов и экзон-интронных сочленений гена F8. У пациентов со средней и легкой формами ГА сразу начинали поиск мутаций секвени-рованием. Протяженные делеции определяли по устойчивому отсутствию амплификации отдельных экзонов при успешной амплификации других.
Результаты. В исследование были включены 275 семей, затронутых ГА. Семьи были представлены пробандами (250), облигатными носительницами заболевания в случаях, когда материал от пробандов был недоступен (21), а также в четырех случаях - женщинами, больными Га. Форма ГА была известна для 249 семей, большинство из них имело тяжелую форму ГА (N=220, 88%), в то время как больных с легкой и средней формами было значительно меньше (N=6 (3%) и N=23 (9%), соответственно). В 84 случаях (30% выборки) было известно о наличии семейной истории ГА, в остальных случаях данных о других больных ГА в составе семьи не было. Для 270 пациентов из 275 нам удалось выявить нарушения в гене F8, оставшиеся пять пациентов страдали тяжелой формой ГА, однако секвенирование всех функционально значимых участков гена F8 не выявило никаких отклонений от нормы; также у них не были обнаружены ^22 и ^1. Таким образом, согласно нашим данным, сочетание проверки на ^22 и с секвенированием по методу Сэнге-
ра позволяет успешно идентифицировать генное нарушение в 98% случаев ГА. В тех случаях, когда нарушение не было выявлено, ГА может вызываться глубокими интронными мутациями, нестандартными инверсиями и дупликациями фрагментов гена. В исследованной выборке пациентов было выявлено 137 случаев ту22; для 123 из них установлена тяжёлая форма ГА, т.е. частота ^22 составила 56% от числа случаев тяжелой ГА в выборке, что соответствует литературным данным. Было выявлено 9 случаев и 3 случая ^1, сопряженной с делецией или дупликацией прилежащих регионов. Помимо частых инверсий, выявлено 96 различных генетических нарушений, 90 из них представляли собой точечные дефекты (миссенс-мутации, микроделеции, микроинсерции, Ме1 варианты), 61 из которых не были ранее описаны в мировой литературе. Также выявлено пять больших делеций (1,8% от общей выборки или 2,3% от числа больных с тяжелой Га) с удалением от одного до восьми экзонов; в трех случаях из пяти в формирование делеции был вовлечен интрон 6, в двух оставшихся - интрон 22. У одного из пациентов было выявлено генетическое нарушение неясной природы, включающее разрыв в экзоне 14; возможно, имела место крупная инверсия. Только 12 мутаций, помимо частых инверсий, встречались более одного раза, остальные нарушения были уникальны. У семи из восьми пациентов из Свердловской области с легкой формой ГА была выявлена замена р^634А^ в экзоне 12, уникальная для этого региона. Также несколько раз встретились инсерции и делеции нуклеотидов в составе по-лиадениновых трактов в экзоне 14, найденные суммарно в 10 семьях. Из четырех женщин, имевших клинические проявления ГА, в трех случаях нам удалось выявить мутацию в сочетании с асимметричной инактивацией Х-хромосомы. В одном случае были выявлены две мутации.
Выводы. Определенные нами частоты встречаемости инверсий ^22 и соответствуют описанным для других популяций. Частота мутаций, не выявляемых сочетанием поиска ^22 и и секвенированием по Сэнгеру составляет 2%. Частота больших делеций среди больных с тяжелой формой ГА также составляет около 2%. Для пациентов с легкой формой ГА, происходящих из Уральского региона, секвенирование экзона 12 представляется целесообразным первым шагом.
С. И. Сафиуллина, Н. Г. Евтюгина, И. А. Андрианова, Р. Р. Хисматуллин, О. А. Кравцова, А. И. Хабирова, А. Г. Даминова, А. Д. Пешкова, Р. И. Литвинов
СЕМЕЙНЫЙ СЛУЧАЙ МУТАЦИИ ГЕНА MYH9, СВЯЗАННОЙ С НАРУШЕНИЕМ СТРУКТУРЫ И
ФУНКЦИИ ТРОМБОЦИТОВ
ФГАОУВО "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Институт фундаментальной медицины и биологии, Казань
Введение. Мутации в гене MYH9, кодирующего субъединицу немышечного миозина IIA, нарушают динамику цитоскелета в мегакариоцитах, вызывая макротромбоцитопению, часто с кровотечением, механизм которого связан с тромбоцитами, но до конца не ясен.
Цель. Изучить структуру и функциональное состояние тромбоцитов у членов семьи с документированной мутацией гена MYH9.
Методы. Обследованы пробанд, ее сестра и их мать с признаками семейной макротробоцитопении и геморрагического синдрома. Гематологическое обследование включало ОАК, мазок крови, проточную цитометрию тромбоцитов (экспрессия
Р-селектина и активного интегрина а11Ьр3 до и после ТВДР-индуцированной активации), кинетику ретракции сгустков крови, а также сканирующую и трансмиссионную электронную микроскопию тромбоцитов. Генетический анализ основан на секвенировании экзонов гена MYH9.
Результаты. Несмотря на тромбоцитопению (36х 109/л у пробанда, 55х 109/л у сестры, 83х 109/л у матери), на момент обследования ни у кого из пациенток не было кровоточивости, хотя в анамнезе были обильные менструации, спонтанные эк-химозы и послеродовые кровотечения. В мазках периферической крови обследованных присутствовали тромбоциты большого и гигантского размеров. В единичных сегментоядерных
