CC BY
63
гативное влияние формалина и его производных на пригодность нуклеиновых кислот к анализу. Основные повреждения ДНК, вызываемые формальдегидом, могут быть классифицированы как следующие: 1) инициация денатурации ДНК вследствие разрыва межцепочечных водородных связей; 2) присоединение к аминогруппам азотистых оснований оксиметильных групп (-CH2OH), приводящее к образованию метиленовых мостиков между соседними основаниями; 3) образование перекрестных сшивок ДНК с гистонами; 4) фрагментация ДНК, образование одноцепочечных разрывов. Для преодоления негативных последствий воздействия формальдегида используется ряд методов, позволяющих получить пригодную к анализу ДНК. Нами проанализированы некоторые из таких приемов и предложены алгоритмы работы с тканями, фиксированными в формалине длительное время.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
При работе с гистологическими блоками -в большинстве стандартных подходов - от парафина освобождаются с применением ряда последовательных обработок ксилолом и этиловым спиртом. Широко распространенная процедура, достаточно затратная по времени, включает вредные для здоровья человека агенты. В предлагаемой нами методике используются такие свойства нуклеиновых кислот, как устойчивость к высокой температуре (100 °C и более) и щелочной среде (pH 11 и выше). Указанные физико-химические условия достигались погружением вырезанного из парафинового блока фрагмента ткани, весом примерно 2-3 мг, в буфер на основе TRIS pH 11 и кипячением на водяной бане в течение 25 минут. После переноса фрагмента ткани в новую пробирку дальнейшие этапы получения ДНК были классическими: обработка в течение 18 часов при 56 °C протеиназой К в присутствии дитиотреитола, фенол-хлороформная экстракция, концентрирование переосаждением изопропиловым спиртом с использованием в качестве соосадителя ацетата аммония. В случае нахождения тканей и фрагментов органов в формалине в депарафинизации биологического материала не было необходимости. Нами были проанализированы некоторые из приемов и найден алгоритм работы с тканями, находившимися долгое время в формалине. Методика заключается в применении специального буфера с глицином, в котором тонкие срезы ткани инкубируются в течение 3 суток. Глицин в данном случае препятствует взаимодействию ДНК с высвобождающимся из ткани формальдегидом, связывая последний. После такой обработки размягченная ткань служила источником для органической экстракции геномной ДНК. Полученные препараты обычно (уже после нескольких часов нахождения в 10 % формалине) представляли собой относительно деградированную ДНК, однако с наличием высокомолекулярных фрагментов. Опыт показывает, что вымачивание ткани в воде или в буфере без добавления глицина не способствует увеличению количества пригодной к амплификации ДНК. Таким образом, при работе с обработанными формалином тканями решаются две основные задачи: добиться максимального выхода ДНК из исследуемого фрагмента биологического материала и одновременно создать условия для нейтрализации освобождающегося формальдегида и его производных. Следует отметить, что на этапе амплификации, достаточно строго стандартизированном в судебной генетике, остается немного возможностей внесения модификаций с целью получения позитивного результата генотипиро-вания поврежденной ДНК. Поэтому основное внимание
нами уделялось этапам предобработки формалинизи-рованных тканей и нейтрализации освобождающегося в процессе лизиса тканей формальдегида.
ВЫВОДЫ
На основании практического опыта работы с биологическими материалами (фрагментами органов и тканей человека), находившимися или доставленными на исследование в формалине, предложена оптимизированная методика получения ДНК, пригодной к дальнейшему мультилокусному фрагментному анализу и секвенирова-нию. Методика включает в себя этапы пробоподготовки формалинизированных тканей и экстракцию геномной ДНК. Предложенные модификации стандартных протоколов повышают эффективность получения ДНК в количественном и качественном аспектах.
молекулярно-генетическая идентификация неопознанных останков. опыт работы ленинградского областного бюросмэ
к.б.н. А. Г. Смоляницкий, А. И. Смоляницкая • Бюро судебно-медицинской экспертизы Ленинградской области (нач. - к.м.н., доц. В. Н. Лебедев)
• Аннотация: Статья касается идентификации неопознанных останков с помощью молеку-лярно-генетического анализа. Рассмотрены возможности генотипирования сложных биологических объектов, особенности прямой
и непрямой идентификации. Отмечена необходимость оснащения судебно-генетического подразделения, занимающегося идентификацией неопознанных лиц, широким спектром технологий анализа ДНК.
• Ключевые слова: идентификация, неопознанные тела, ДНК-профиль, скелетированные останки
ВВЕДЕНИЕ
Задача идентификации неопознанных тел, в том числе скелетированных, разрушенных воздействием внешней среды или техногенных факторов, с развитием молеку-лярно-генетической экспертизы получила уникальный инструмент успешного решения. Для целей индивидуализации, как правило, используются генотипы предполагаемых родственников неустановленного лица либо сохранившийся биологический материал пропавшего без вести человека, удовлетворяющего версии дознания. В настоящее время сравнительный анализ ДНК не ограничивается близкими родственниками по вертикали, да и возможности прямого сравнительного анализа биологических материалов значительно выросли. Все большую роль играет установление ряда фенотипических характеристик неопознанного лица по данным, полученным при изучении структуры ДНК. Так, с высокой надежностью определяется цвет волос, радужной оболочки глаз, кожи человека. Анализ определенных последовательностей ядерной и митохондриальной ДНК дает представление об этническом происхождении человека, относя его к одной из 4 расовых групп.
Нами обобщен многолетний опыт идентификационных исследований, проводимых в Ленинградском областном БСМЭ, предложены алгоритмы экспертной работы, намечены основные недостатки и направления взаимодействия с правоохранительными структурами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Проведен анализ выполненных отделением экспертиз и исследований идентификации погибших неопознанных лиц. По данным последних пяти лет, 280 из 526 экспертиз предполагали необходимость исследования костных останков. Это объясняется характером событий, при которых возникает необходимость в идентификационных исследованиях. Как правило, в разряд неопознанных попадают погибшие люди, останки которых частично или полностью скелетированы, фрагментированы, находятся в сильной степени обгорания либо длительное время пребывали в воде. Такие останки часто малопригодны для классических медико-криминалистических остеологических исследований, однако могут стать основой для установления развернутого генетического профиля. Данная задача ставится перед экспертом-генетиком, в том числе в тех ситуациях, когда версий о принадлежности останков конкретному человеку не выдвинуто.
В ряде случаев идентификационные характеристики настолько утрачены, что требуется по фрагментам костей определить принадлежность останков человеку или животному. Установление видовой принадлежности объектов биологического происхождения - одна из традиционных задач судебно-биологической и медико-криминалистической экспертиз. Однако иммунологические способы решения этой задачи имеют ряд недостатков. Морфологические подходы также не всегда приводят к успешной идентификации вида, трудоемки, требуют больших временных затрат. Нами применяется метод определения видовой принадлежности по специфичному участку митохондриальной ДНК (№кашига е! а1., 2009). Метод позволяет в формате автоматизированного анализа установить природу объекта, конкретизировав вывод в случае с образцом животного происхождения -до вида. Выполнен ряд экспертиз с применением данной техники.
Детерминация половой принадлежности, а также выявление максимального числа фенотипических признаков погибшего человека, служат неоценимым указанием направления поиска при установлении личности. Не всегда возможно традиционными методами установить половую принадлежность останков. Генетический анализ позволяет решить эту задачу как в рамках мо-нолокусного, так и в составе мультилокусного анализа. После появления версии о том, кому могут принадлежать останки погибшего человека, необходимо найти и представить на экспертизу сравнительные материалы. Решение судебно-медицинской задачи установления личности неопознанного лица в большинстве случаев основывается на реализации схемы непрямой идентификации, когда в качестве идентифицирующих объектов используются биологические образцы от родственников погибшего. Важное значение имеет наличие в арсенале генетического подразделения полного спектра методов анализа ДНК, что обеспечивает широкие возможности идентификации неопознанного лица по вертикальным и горизонтальным родственным связям. При отсутствии образцов близких родственников (родители, дети), сохраняется возможность анализа по мужской линии (отец, дед, прадед и их братья) и по женской ветви (мать, бабка, прабабка).
Эксперту стоит обратить внимание органов дознания на необходимость поиска биологических материалов, сохранившихся по месту проживания идентифицируемого человека (личные вещи: зубная щетка, бритвенный станок, бритвенная машинка, расческа, мундштук и др.), а также в архивах медицинских учреждений (гистологические парафиновые блоки и др.). Такие объекты оказыва-
ются пригодны для прямого отождествления с неопознанным человеком, что, в комплексе с анализом родственных связей, может сыграть ключевую роль в идентификации личности.
ВЫВОДЫ
Выделены условия эффективной работы генетического подразделения, связанной с задачей идентификации личности погибших неопознанных людей. Главные среди них - наличие опыта работы со «сложными» биологическими материалами, комплектация подразделения высокотехнологичным оборудованием и разнообразным арсеналом систем генетического анализа, постоянная консультационная работа с правоохранительными органами, ведущими дела по установлению личности и розыску пропавших без вести лиц.
реализация единого научно-методического подхода к проведению молекулярно-генетических экспертиз и формирование отечественной
экспертной школы в области судебной генетики
д.б.н. И. А. Шилов, к.м.н. Е. Ю. Земскова, д.б.н., проф. П. Л. Иванов
• ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор - д.м.н. А. В. Ковалев)
• Аннотация: Основой стандартизации судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертных исследований является использование апробированных методик с неукоснительным соблюдением конкретной технологии анализа. Этот принцип, положенный в основу профессиональной подготовки судебно-медицинских экспертов-генетиков, способствовал унификации производства молекулярно-генетических экспертиз в Российской Федерации и созданию отечественной экспертной школы в области судебной генетики.
• Ключевые слова: судебно-медицинская мо-лекулярно-генетическая экспертиза, дополнительная профессиональная подготовка судебно-медицинских экспертов-генетиков, единый научно-методический подход
ВВЕДЕНИЕ
Судебно-медицинское экспертное исследование с применением молекулярно-генетических методов анализа представляет собой сложный многостадийный процесс. Нет необходимости говорить о том, что любые методические нарушения при выполнении генетической экспертизы могут приводить к неправильным выводам и, как следствие, к судебным ошибкам.
Правильное и полноценное оснащение «рабочего места» эксперта-генетика в каждой лабораторной зоне -один из ключевых моментов для функционирования молекулярно-генетической лаборатории. Оно должно осуществляться в соответствии с единым научно-методическим подходом к проведению молекулярно-генети-ческих экспертиз, разработанным в последние годы сотрудниками отдела молекулярно-генетических экспертиз (исследований) РЦСМЭ Минздрава России. Суть этого подхода состоит в стандартизации реагентной и приборной базы, чтобы сложная и многостадийная методика
