CC BY
6
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2022
Алексеева А.Е., Бруснигина Н.Ф., Гординская Н.А., Махова М.А., Колесникова Е.А.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЗИСТОМА И ВИРУЛОМА КАРБАПЕНЕМ-УСТОЙЧИВЫХ КЛИНИЧЕСКИХ ШТАММОВ KLEBSIELLA PNEUMONIAE
ФБУН «Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора, 603950, Нижний Новгород, Россия
Представлена характеристика структуры резистома и вирулома четырёх клинических карбапенем-устойчивым штаммов Klebsiella pneumoniae. Два штамма принадлежали к сиквенс-типу ST395, один штамм - ST2262, один штамм - к новому сик-венс-типу 5816. У всех штаммов клебсиелл в структуре хромосомы определены гены фимбрий, энтеробактина, в-лактамаз типа SHV, устойчивости к фосфомицину fosA и транспорта фторхинолонов oqxAB. Вирулом штаммов ST395 - NNKP315 и NNKP343 обогащён детерминантами иерсинеобактина и аэробактина, гены последнего расположены в структуре плаз-мид IncHIlB (IncHI1B/FIB), высокогомологичн^гх плазмидам вирулентности pLVPK и pK2044. В составе плазмидной ДНК этих штаммов, несущей репликоны IncR, IncL, IncQ, выявлен набор генов резистентности: blaOXA 8 bla l5, blaOXA ,, blamMtl, aac(6')-Ib-cr, qnrSl, catAl, catB3, tet(A), sull, dfrAl и др. В результате анализа in silico сделано предположение о локализации гена blaOA 48у штамма NNKP3l5 в структуре плазмиды IncHIlB, которая содержит также гены аминогликозидаз в составе интегрона первого класса In822. В генах пориновыгх белков OmpK35, OmpK36, OmpK37 обнаружены мутации, вносящие дополнительный вклад в проявление устойчивости к карбапенемам. В вирулом штамма NNKPl6 (ST2262) входят хромосомные гены системы утилизации железа kfuABC, в вирулом штамма NNKPl5 (ST58l6) - гены капсульного полисахарида kvgAS и микроцина E492. В структуре резистома K. pneumoniae NNKPl6 не выявлено дополнительным детерминант устойчивости, у штамма NNKPl5 обнаружен только ген blaCTX-M-l5. Отсутствие приобретённым генов резистентности, по-видимому, обусловлено наличием системы CRISPR-Cas типа I-E. Множественная лекарственная устойчивость исследуемым штаммов связана с мутациями, выявленными в структуре маркёрным генов, в частности, пориновыгх белков OmpK36 и OmpK37, активностью эффлюксным систем. У обоих штаммов выявлено наличие стоп-кодона в последовательности регуляторного гена ramR, что потенциально может обеспечивать гиперэкспрессию эффлюкс-белков AcrAB.
Ключевые слова: Klebsiella pneumoniae; полногеномное секвенирование; факторы резистентности и патоген-ности; CTX-M-l5; OXA-48; плазмиды; CRISPR-Cas.
Для цитирования: Алексеева А.Е., Бруснигина Н.Ф., Гординская Н.А., Махова М.А., Колесникова Е.А. Молекулярно-генети-ческая характеристика резистома и вирулома карбапенем-устойчивых клинических штаммов Klebsiella pneumoniae. Клиническая лабораторная диагностика. 2022; 67 (3): 186-192. DOI: https://dx.doi.oig/10.51620/0869-2084-2022-67-3-186-192 Для корреспонденции: Алексеева Анна Евгеньевна, канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаб. метагеномики и мол. индикации патогенов; e-mail: [email protected]
Благодарности. Авторы выражают благодарность сотрудникам Института Пастера (Париж) за курирование и поддержку базы данных BIGSdb-Pasteur (http://bigsdb.pasteur.fr/). Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Поступила 04.10.2021 Принята к печати 28.10.2021 Опубликовано 25.03.2022
AlekseevaA.E., BrusniginaN.F., GordinskayaN.A., MakhovaM.A., KolesnikovaE.A.
MOLECULAR GENETIC CHARACTERISTICS OF RESISTOME AND VIRULOME OF CARBAPENEM-
RESISTANT KLEBSIELLA PNEUMONIAE CLINICAL STRAINS
Nizhny Novgorod scientific and research institute of epidemiology and microbiology name acad. I.N. Blokhina of the Rospotrebnadzor, Nizhny Novgorod, 603950, Russia
The characteristics of resistome and virulome structure of four carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae clinical strains are present in the work. Two strains belonged to the sequence-type ST395, one strain - ST2262, one strain - to the new sequence-type 58l6. The genes of fimbriae, enterobactin, beta-lactamase SHV type, resistance to fosfomycin fosA and transport of fluoroquinolones oqxAB in all Klebsiella strains chromosome structure were identified. The determinants ofyersineobactin and aerobactin are enriched the virulome of ST395 NNKP3l5 andNNKP343 strains. The aerobactin genes are located on IncHIlB plasmids (IncHIlB/FIB) which highly homologous to the virulence pLVPK andpK2044 plasmids. IncR, IncL, IncQ plasmids carrying blaOXA48, blaCIX-M_l5, blaOXA l, blamMtl, qnrSl, tetA, sull, dfrAl, aac(6 ')-Ib-cr, catAl, catB3 etc. were identified in these strains. As a result of in silico analysis, an assumption about the localization of the blaOXA-48 in the structure of the IncHIlB plasmid of NNKP3l5 strain was made. This plasmid also contains the aminoglycosidases genes inserted into a class l integron In822. The mutations were found in the porin proteins OmpK35, OmpK36 and OmpK37 genes, which increases the carbapenem resistance. The virulome of NNKPl6 (ST2262) strain additionally includes of the iron utilization system kfuABC chromosomal genes, and the virulome of NNKPl5 (ST58l6) strain contains of the capsular polysaccharide kvgAS and microcin E492 genes. Additional determinants of resistance were not identified in the resistome structure of K. pneumoniae NNKPl6 and only the blaCTX-M-l5 gene was found in the NNKPl5 strain. The absence of acquired resistance genes seems to be due to the presence of the type I-E CRISPR-Cas system. Multiple drug resistance of the studied strains is associated with mutations identified in the gene structure of porin proteins OmpK36 and OmpK37, as well as the activity of efflux systems. It was showed the stop codon formation in the nucleotide sequence of the regulatory gene ramR to both strains, which can potentially provide overexpression of AcrAB efflux proteins.
Key words: Klebsiella pneumonia; whole genome sequencing; resistome; virulome; CTX-M-l5; OXA-48; plasmids; CRISPR-Cas.
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
For citation: Alekseeva A.E., Brusnigina N.F., Gordinskaya N.A., Makhova M.A., Kolesnikova E.A. Molecular genetic characteristics of resistome and virulome of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae clinical strains. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2022; 67(3): 186-192 (in Russ.). DOI: https://dx.doi.org/10.51620/0869-2084-2022-67-3-186-192
For correspondence: AlekseevaA.E., Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher of Laboratory of Metagenomics and Molecular Indication of Pathogens; e-mail: [email protected] Information about authors:
Alekseeva A.E., https://orcid.org/0000-0001-6482-0268; Brusnigina N.F., https://orcid.org/0000-0003-4582-5623; Gordinskaya N.A., https://orcid.org/0000-0002-4146-0332; Makhova M.A., https://orcid.org/0000-0002-9443-0030; Kolesnikova E.A., https://orcid.org/0000-0002-0859-4339.
Acknowledgments. The authors thank the Institut Pasteur teams for the curation and maintenance of BIGSdb-Pasteur databases at http://bigsdb.pasteur.fr/
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Funding. The study had no sponsorship.
Received 04.10.2021 Accepted 28.10.2021 Published 25.03.2022
Введение. Klebsiella pneumoniae относится к группе условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), широко распространена, встречается в различных объектах окружающей среды, входит в состав микробиома человека и животных [1]. За последние два десятилетия интерес к изучению свойств полирезистентных штаммов K. pneumoniaе возрос в связи с увеличением их доли как этиологического агента в структуре инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП) [2, 3]. K. pneumoniaе включены в группу ESKAPEE, объединяющую наиболее проблемных для мирового здравоохранения возбудителей (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter species, Escherichia coli) [3, 4]. Реализация патогенного потенциала данных видов бактерий в условиях лечебного учреждения связана, в первую очередь, с их способностью быстро эволюционировать и адаптироваться к воздействию антимикробных препаратов (АМП) и дезинфицирующих средств, главным образом, за счёт приобретения дополнительных генов, локализованных на мобильных элементах [3, 4]. Некоторые исследователи рассматривают штаммы K. pneumoniae как ключевое звено в распространении генов антибиотико-резистентности среди других клинически значимых видов грамотрицательных бактерий [3].
Использование современных высокопроизводительных технологий глубокого секвенирования позволяет расшифровать молекулярно-генетические механизмы резистентности, лежащие в основе формирования устойчивых клонов, и разработать подходы, направленные на сдерживание темпов распространения полирезистентных клинических штаммов УПМ, включая Klebsiella pneumoniae.
Цель работы - молекулярно-генетическая характеристика факторов патогенности и антибиотикорезистент-ности клинических штаммов K. pneumoniae, характеризующихся множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ), включая карбапенемы.
Материал и методы. В исследование включены четыре карбапенем-устойчивые штамма K. pneumoniaе, выделенные от больных, находящихся на стационарном лечении. Штаммы NNKP315, NNKP343 выделены от взрослых больных с ожоговой болезнью, другие
два штамма - от пациентов детского возраста - изолят NNKP15 из мочи ребёнка с циститом; изолят NNKP16 - из фекалий ребёнка с подозрением на внутриутробную инфекцию. Колумбийский агар, содержащий 5% бараньей крови (Sredoff, СПб), использован для культивирования чистых культур бактерий. Исследование на чувствительность штаммов к различным классам АМП осуществляли на анализаторе Multiscan FC (Thermo Scientific, США). С помощью SENSILA-test (Erba Mannheim, United Kingdom) проводили оценку антибио-тикорезистентности на основании критериев EUCAST 2021, результаты представлены в табл. 1.
На секвенаторе MiSeq (Illumina, США) проведено полногеномное секвенирование исследуемых штаммов K. pneumoniae с использованием набора MiSeq reagent kit v3 (150 циклов) (Illumina, США). С помощью набора АмплиПрайм ДНК-сорб-В (ЦНИИЭ, Россия) выделена ДНК из чистых культур бактерий. Подготовка библиотеки ДНК для секвенирования осуществлена с помощью набора NebNext Ultra II FS DNA Library Preparation kit. Сборка полученных чтений de novo проведена с использованием web-сервиса Assembly: алгоритмы SPAdes и plasmid SPAdes, расположенные на сервере PATRIC (https://patricbrc.org/app/Assembly2). Собранные последовательности аннотированы с помощью сервиса PGAP (NCBI) [5] и сервера RAST (https://rast.nmpdr.org/).
Для типирования штаммов, определения детерминант антибиотикорезистентности и патогенности, использованы базы данных Klebsiella PasteurMLST database (https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella. html), CARD (https://card.mcmaster.ca/home), сервис ResFinder 4.1 (https://cge.cbs.dtu.dk//services/ResFinder/). C помощью алгоритма eBURST определены клональ-ные группы [6]. Для выявления высокогомологичных последовательностей использован web-сервис BLASTN (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). С целью ти-пирования по группам несовместимости плазмидной ДНК in silico использована программа PlasmidFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/). С помощью web-сервисов Integrall (http://integrall.bio.ua.pt/), IS-finder (https://www-is.biotoul.fr/), CRISPRCasFinder (https://crisprcas.i2bc.paris-saclay.fr/CrisprCasFinder/) усташвлено наличие интегронов, IS-элементов, последовательностей CRISPR Cas.
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
Результаты. На основании результатов аннотирования контигов, собранных из коротких чтений, получена общая молекулярно-генетическая характеристика исследуемых штаммов K. pneumoniae (табл. 2).
При типировании исследуемых штаммов с помощью схемы Multilocus Sequence Typing (MLST) [7] у штамма NNKP15 выявлен новый аллельный вариант гена phoE, который депонирован в базу данных Klebsiella Pasteur-MLST под номером 571 и присвоен новый сиквенс-
Таблица 1 Антибиотикограмма штаммов K. pneumoniae
Препарат Штамм K.pneumoniae
NNKP15 NNKP16 NNKP315 NNKP343
Ампициллин R R R R
Ампициллин/ R S R R
сульбактам
Пиперациллин R R R R
Пиперациллин/ R S R R
тазобактам
Амикацин R R S R
Гентамицин R S R R
Тетрациклин R R - -
Тигециклин S S S R
Ципрофлоксацин R R R R
Цефазолин R R R R
Цефотаксим R R R R
Цефуроксим R R R R
Цефтазидим R R R R
Цефтазидим/ R R R R
клавуланат
Цефепим R R R R
Имипенем R R R R
Меропенем R R S R
Эртапенем R R R R
Триметоприм/ S S R R
сульфаметоксазол
Азтреонам R R R R
Фурадонин R - - -
Полимиксин Е - - S S
(колистин)
Примечание. S - чувствителен, R - устойчив, «-» - для тестирования штамма не использован.
тип (ST) - 5816. Полученные с помощью программы eBURST результаты определения клональных комплексов, в которые входят сиквенс-типы исследуемых штаммов представлены на рисунке.
Вирулом штаммов K.pneumoniae NNKP15 и NNKP16 содержит детерминанты патогенности только хромосомной локализации. У исследуемых штаммов NNKP315 и NNKP343, принадлежащих ST395, обнаружены гены белка-сидерофора аэробактина, которые расположены в структуре последовательности, принадлежащей плазмидной ДНК и несущей репликон IncHIlB (штамм NNKP315) и IncHI№/FIB (штамм NNKP343). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей плазмидной ДНК, выявленных у исследуемых штаммов, и последовательностей плазмид pLVPK (AY378100.1) и pK2044 (AP006726.1), определяющих гипервирулентные свойства штаммов K.pneumoniae CG43 [8] и NTUH-K2044 [9], показал их высокое структурное сходство. Отличием является отсутствие у штаммов NNKP315 и NNKP343 участков, ответственных за устойчивость к серебру и меди, синтез белка-сидерофора сальмохелина.
Для резистома исследуемых штаммов характерно наличие хромосомных генов Р-лактамаз типа SHV, детерминант устойчивости к фторхинолонам oqxAB и фосфо-мицину fosA. Штамм K. pneumoniae NNKP16 не обладает дополнительными детерминантами устойчивости ни в структуре хромосомы, ни в структуре плазмиды.
Детерминанта глобально распространенной цефало-спориназы CTX-M-15 группы Р-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) определена у трёх штаммов клебсиелл. Анализ in silico показал, что у штаммов NNKP315 и NNKP343 ген blaCTX_M_15 локализован в структуре плаз-миды резистентности IncR. Отбор контигов проводился относительно референсной последовательности плаз-миды unnamedl (CP063020.1) штамма K.pneumoniae CriePir75, выделенного в Москве в 2017 г. [10]. В последовательность плазмиды объединены контиги, несущие гены bla _p bla_p bla l5, qnrSl, tetA, sull, dfrAl, aac(6')-Ib-cr, catAl, catB3. При сравнительном анализе с использованием BLASTN установлено, что нуклео-тидные последовательности плазмиды IncR штаммов NNKP3l5 и NNKP343 являются высокогомологичными последовательностям IncR плазмид штаммов K. pneumoniae, выделенным на территории России: в Москве, Московской области [10], в Нижнем Новгороде
[11]. У штамма NNKP15 определить расположение гена blaCTXM1s не удалось, поскольку нуклеотидная последовательность контига, включающего blaCTXM1s, высокогомологична как последовательностям, входящим в состав плазмид IncFII, так и плазмид IncN.
У штаммов K pneumoniae NNKP315 и NNKP343 выявлен ген эпидемически-значимой OXA-48 кар-бапенемазы, расположенный в составе транспозона Tn1999 [12]. У штамма NNKP343 ген blaOJM 48 ассоциирован с плазмидной ДНК, несущей репликон IncL. У штамма NNKP315 репликон IncL отсутствует, однако из набора контигов, принадлежащих плазмидной ДНК данного штамма, отобраны последовательности высокогомологичные участку плазмиды pOXA-48 штамма K. pneumoniae Kp11978 (JN626286.1) общей длиной
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
22706 п.н. По-видимому, участок ДНК, содержащий ген blaQXA 48, входит в состав плазмиды другой группы несовместимости. Поиск с помощью сервиса BLASTN позволил выявить последовательность плазмиды unnamed2 (CP062994.1) группы несовместимости HI1B, содержащей ген blaOXA 48. Плазмида обнаружена у штамма K. pneumoniae CriePir200 ST336, выделенного в Москве 2018 году [10]. В результате выравнивания плазмидных контигов штамма NNKP315 относительно плазмиды unnamed2 получена последовательность общей длиной 288 тыс. п. н. с уровнем покрытия 99% и идентичностью почти 100%. На основании полученных результатов сделано предположение, что участок, содержащий ген blaOXA48 штамма NNKP315, входит в состав плазмиды IncHIlB. В структуру данной плазмиды, по-видимому,
Таблица 2
Молекулярно-генетическая характеристика штаммов K. pneumoniae
Метрические показатели
Штамм K. pneumoniae
NNKP315
NNKP343
NNKP15
NNKP16
Размер генома Количество тРНК Количество рРНК Количество белок-кодирующих последовательностей Количество CRISPR-Cas (тип)
Репликоны плазмид
Сиквенс-тип/К-тип
Детерминанты
патогенности
Детерминанты
антибиотико-
резистентности
5690644 49 4
5514 1 (тип IV-A)
IncHI1B(pNDM-MAR), IncR
395/K39 Фимбрии (mrkABCDFIJ), энтеробактин (entABCDEFS, fepABCDG, fes) иерсине-обактин (fyuA, irpl, irp2, ybtAEPOSTUX), аэробактин (iutAiucABCD)
blaSHV-11, blaOXA-48, blaCTX-M-15, blaOXA-1, blaTEM-1B
ant(2 ")-Ia, ant(3 ")-Ia, aac(6')-Ib-cr
oqxAB, qnrSl, aac(6')-Ib-cr
fosA AcatB3, catAl tet(A) dfrAl macAB, mdfA sull
5752029 47 3
5565
Только CRISPR без Cas белков
IncHIlB(pNDM-Mar), FIB (pNDM-Mar), IncL, IncR, IncQl, ColpVC 395/K39 Фимбрии (mrkABCDFHIJ), энтеробактин (entABCDEFS, fepABCDG, fes), иерсине-обактин (fyuA, irpl, irp2, ybtAEPOSTUX), аэробактин (iutAiucABCD)
5614635 58 4
5325
1 (тип I-E)
IncFIB(K), IncFII, IncFII(K), IncN
5816 (новый)/К3 Фимбрии (mrkABCD-FHIJ), энтеробактин (entABCDEFS, fepABCDG, fes), капсульный полисахарид (kvgAS), микроцин E492 (mceABCDEGHIJ)
Бета-лактамазы
blaSHV-11, blaOXA-48, blaCTX-M-15, blaOXA-1, blaTEM-1B
blaSHV-1, blaCTX-M-15
5406160 57 4
5145 1 (тип I-E)
IncFII(pKP91)-подобный
2262/K64
Фимбрии (mrkABCD-FHIJ), энтеробактин (entABCDEFS, fepABCDG, fes), ABC-система утилизации железа (kfuABC)
blaSHV-108
Аминогликозидазы
aac(6')-Ib-cr, aph(3')-VIa, Aaph(6)-Id
Устойчивость к фторхинолонам
oqxAB, qnrS1, aac(6')-Ib-cr oqxAB, qnrS1
Устойчивость к фосфомицину fosA fosA
Устойчивость к хлорамфениколу AcatB3, catA1 нет
Устойчивость к тетрациклинам tet(A) нет
Устойчивость к триметоприму dfrA1 нет
Устойчивость к макролидам macAB, mdfA macAB
Устойчивость к сульфаниламидам
oqxAB
fosA
macAB
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
входит также участок, включающий интегрон первого класса с кассетными генами амингликозидаз ant(2 ")-Ia и ant(3")-Ia, который присутствует в нуклеотидной последовательности референсной плазмиды unnamed 2.
Резистом штамма NNKP343 включает детерминанты aph(3')-VIa и Aaph(6)-Id, располагающиеся в плаз-мидной нуклеотидной последовательности, несущей репликон IncQ, высокогомологичной последовательностям целых IncQ плазмид p3 (CP048948.1) штамма K. pneumoniae 20467 (ST377) и unnamed4 (CP062990.1) штамма K. pneumoniae CriePir26 (ST377) [10], выделенных в Москве в 2018 и 2017 гг. соответственно.
В структуре генома всех исследуемых штаммов клеб-сиелл присутствуют гены, кодирующие эффлюксные белки, принадлежащие различным семействам, в частности, белки семейства RND - AcrABCDZR, MdtABC, EefABC, OqxAB [13], у штаммов NNKP315 и NNKP343 обнаружен ген, кодирующий белок KexD [14]. Гены эффлюксных белков семейства MATE - KdeA, KmrA, MdtK, EmmdR [15]; семейства SMR - KpnEF, SugE [15]; семейства MFS - EmrABD [16] присутствуют в геноме всех исследуемых штаммов. У K. pneumoniae NNKP15 и NNKP16 обнаружена мутация в структуре регулятор-ного гена ramR, приводящая к формированию раннего стоп-кодона. У штаммов NNKP315 и NNKP343 выявлены изменения в регуляторном гене acrR, сопровождающиеся аминокислотными заменами (P161R, G164A, F172S, R173G, L195V, F197I, K201M).
Структуры CRISPR-Cas определены у трёх исследуемых штаммов K. pneumoniae. У штаммов NNKP15 и NNKP16 эти последовательности находятся в составе хромосомной ДНК и относятся к типу I-E согласно классификации [17]. У штаммов NNKP315 и NNKP343 CRISPR структуры обнаружены в последовательностях, входящих в состав плазмиды IncHI1B (HI1B/FIB). У штамма NNKP315 обнаружена структура CRISPR вместе с Cas белками и относится к типу IV-A3 [18]. У штамма NNKP343 выявлен только участок CRISPR, в генетическом окружении которого белки Cas отсутствуют, однако обнаружен хромосомный ген, кодирующий Cas6/ Cse3/CasE типа I-E.
Последовательности генома штаммов K. pneumoniae депонированы в базу данных DDBJ/ENA/GenBank под номерами: JAHCSK000000000.1 (NNKP15), JAHCSJ000000000.1 (NNKP16), JACCIF000000000.1 (NNKP343), JACCIG000000000.1 (NNKP315).
Обсуждение. Установлено, что исследуемые кар-бапенем-устойчивые штаммы принадлежат разным сиквенс-типам. Представители сиквенс-типа ST395 являются одними из наиболее эпидемически распространённых как на территории России [10, 19], так и европейских стран [20, 21]. В Европе происходит постепенная смена доминирования глобальной клональной линии CG258 и формирование сложной поликлональ-ной структуры карбапенем-устойчивых штаммов, включающей различные сиквенс-типы (ST101, ST307, ST348, ST395, ST392, ST405 и др.) [20, 21]. Сиквенс-тип 2262, к которому принадлежит штамм NNKP16, является редко встречаемым. В базе данных Klebsiella PasteurMLST database имеется информация только об одном штамме -LWC04, выделенном в 2016 г. в Китае. Упоминается изолят K. pneumoniae ST2262/K54, обладающий свойствами гипервирулентных штаммов [22]. Что касается клональной группы, в которую входит новый ST5816, она объединяет редко встречаемые сиквенс-типы, выяв-
ляемые из различных биологических материалов человека, из образцов окружающей среды, согласно данным Klebsiella PasteurMLST database.
Общим признаком всех исследуемых штаммов является наличие хромосомных генов blaSHV, oqxAB, fosA. У штаммов присутствуют различные аллельные варианты генов ß-лактамаз SHV. Геном штамма NNKP16 содержит ген blaSHV-108 - b-лактамазы широкого спектра действия, который впервые выявлен у штаммов клеб-сиелл в 1999 г. в Португалии [23]. На 1 июня 2021 г. в базу данных GenBank депонировано 44 штамма клеб-сиелл, несущих данный ген, что свидетельствует о его низком уровне распространенности. Аллельные варианты blaSHV-1 и blaSHV-11 не относятся к БЛРС, но являются одними из наиболее распространённых среди K. pneumoniae [19].
Структура вирулома штаммов, принадлежащих различным сиквенс-типам, имеет значительные отличия по набору и локализации детерминант патогенности. Штамм NNKP15 обладает дeтерминантами kvgAS и ми-кроцина E492, которые ранее выявлялись только в структуре генома гипервирулентных штаммов K. pneumoniae, ассоциированных с абсцессом печени [24]. В 2019 г. зарегистрированы случаи выявления этих генов у представителей классических K. pneumoniae ST405 в Италии [25]. Геном штамма NNKP16 содержит маркёры ABC-системы утилизации железа kfuABC, часто обнаруживаемой у штаммов K. pneumoniae с высокоинвазивны-ми свойствами [26]. У штаммов NNKP315 и NNKP343, являющихся представителями эволюционной линии классических штаммов клебсиелл, обнаружено наличие плазмиды вирулентности IncHI1B (IncHI1B/FIB), данный факт не является исключительным случаем и отмечался ранее [10, 11, 19].
Сравнительный анализ структуры резистома исследуемых штаммов показал, что K. pneumoniae NNKP315 и NNKP343 сиквенс-типа 395 обладают значительно большим разнообразием детерминант устойчивости по сравнению со штаммами NNKP15 и NNKP16, что объясняет высокую эпидемическую значимость представителей ST395 в развитии ИСМП. Только у K.pneumoniae NNKP16 в отличие от других исследуемых штаммов не выявлено дополнительных детерминант устойчивости, что связано с отсутствием плазмид, несущих соответствующие гены. Ген цефалоспориназы CTX-M-15, который выявлен у трёх штаммов K. pneumoniae, является наиболее распространённым среди ß-лактамаз группы CTX-M. У двух штаммов сиквенс-типа 395 этот ген располагается в структуре последовательностей плазмиды IncR, высокогомологичной последовательностям соответствующих плазмид штаммов клебсиелл, выделенных на географически близкой территории. У штамма K. pneumoniae NNKP15 не удалось определить локализацию гена blaCTXM1s, который может быть ассоциирован и с плазмидами IncFII и IncN, репликоны которых обнаружены в структуре плазмидной ДНК. Обе плазмиды обладают широким кругом хозяев, способствуя распространению генов, кодирующих ферменты CTX-M среди других представителей семейства Enterobacteriaceae [27, 28].
Ген карбапенемазы OXA-48 выявлен только у представителей сиквенс-типа 395. На территории России случаи обнаружения представителей данного сиквенс-типа среди OXA-48 позитивных штаммов K. pneumoniae все чаще находят отражение в научных статьях [10, 11, 19]. У штаммов NNKP315 и NNKP343 имеются разли-
чия в локализации гена blaOXA У штамма NNKP343 ген blaQXA_48 ассоциирован с плазмидой IncL, что согласуется с результатами исследований [29], свидетельствующими, что плазмиды IncL являются основными носителями гена OXA-48 карбапенемазы. У штамма NNKP3l5 согласно результатам in silico участок, несущий гены карбапенемазы OXA-48 и интегрона In822 с набором кассетных генов аминогликозидаз входит в структуру плазмиды IncHI1B. Сведения об аналогичных случаях обнаружения гена blaOXA48 в структуре плазмид IncHI1B отсутствуют. В литературе описаны примеры комбинации в составе одной плазмиды участков ДНК высокогомологичных последовательностям других плазмид. У штамма K. pneumoniae Kp Goe-39795 обнаружена плаз-мида pKp_Goe_795-l (CP018460) длиной 232 тыс. п. н., в структуре которой установлены высокогомологичные участки нуклеотидным последовательностям пяти плаз-мид [30].
Возникновение мутаций в структуре генов, кодирующих белки пориновых каналов OmpK35, OmpK36, OmpK37, сопровождается изменениями проницаемости, формируя устойчивость к карбапенемам и цефало-споринам штаммов клебсиелл [31, 32]. Такие мутации обнаружены у всех исследуемых штаммов, однако наибольшее значение они имеют для формирования карба-пенем-резистентности штаммами NNKPl5 и NNKPl6, не обладающими карбапенемазной активностью.
Синергетический эффект на развитие полирезистентных свойств штаммов бактерий, включая K. pneumoniae, оказывает активность транспортных эффлюкс-систем [15]. В структуре геномов всех исследованных штаммов выявлены гены белков систем эффлюкса, принадлежащих различным семействам. Наиболее важную роль в формировании резистентности играют белки семейства RND, обладающие широкой субстратной специфичностью [13]. Отличительной чертой штаммов NNKP3l5 и NNKP343 является присутствие гена, кодирующего белок KexD и ответственного за транспорт макролидов и тетрациклина [14]. Наличие у этих штаммов аминокислотных замен в структуре регуляторного белка AcrR приводит к сверхпродукции белка AcrA, входящего в состав трёхкомпонентой эффлюксной помпы AcrAB-TolC, и снижению чувствительности к фторхинолонам [33]. У штаммов NNKPl5 и NNKPl6 обнаружена мутация в структуре гена ramR, кодирующего белок RamR -негативный регулятор экспресоти белков AcrAB, что может способствовать сверхпродукции этих белков [34] и формированию полирезистентных свойств штаммами NNKPl5 и NNKPl6.
Последовательности CRISPR-Cas, присутствующие в геноме штаммов K. pneumoniae, являются адаптивной иммунной системой бактерий, позволяющей ограничивать приобретение внешних генетических элементов, соблюдая баланс между потребностью в получении полезных характеристик за счёт горизонтального переноса генов и необходимостью защиты от заражения бактериофагом [17, 35]. По-видимому, вследствие наличия CRISPR-Cas структуры штамм NNKPl6 не обладает генами патогенности и резистентности, локализованными на мобильных элементах. У штамма NNKP3l5 участок CRISPR-Cas обнаружен в последовательностях, входящих в состав плазмиды IncHI1B, что согласуется с данными о наличии строгой ассоциации структур CRISPR-Cas данного типа с плазмидами группы несовместимости HI1B (HI1B/FIB) [36]. В составе спейсеров
КЛИНИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
обнаружены последовательности, высокогомологичные участкам плазмидной ДНК, что, по-видимому, обеспечивает преимущество во внутриклеточной межплаз-мидной конкуренции [37]. У штамма NNKP343 выявлен только участок CRISPR без белков Cas. У CRISPR-Cas IV типа модуль генов, кодирующих Cas-белки рядом с CRISPR, может отсутствовать [37]. Для функционирования системы IV типа могут быть использованы хромосомные Cas-белки типа I-E. Нами у штамма NNKP343 обнаружен ген, кодирующий Cas6/Cse3/CasE типа I-E.
Заключение. Результаты исследований свидетельствуют о разнообразии популяционной структуры карбапенем-устойчивых госпитальных штаммов K. pneumoniae. Все исследуемые штаммы K. pneumoniae, обладая схожим фенотипом устойчивости, имеют существенные отличия по генотиповой принадлежности, набору детерминант резистентности и патогенности. Получены новые данные о продолжающейся эволюции штаммов K. pneumoniae, относящихся к эпидемически значимому сиквенс-типу 395. Показано, что карбапенем-устойчивостью могут обладать штаммы K. pneumoniae, принадлежащие к редко встречающимся сиквенс-типам и характеризующиеся низким разнообразием маркёров резистентности, что связано с присутствием системы CRISPR-Cas. В формирование полирезистентности данных штаммов оказались вовлечены альтернативные механизмы, ассоциированные с мутационной изменчивостью соответствующих маркёрных генов и активностью эффлюкс-систем.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-10, 12-37 см. REFERENCES)
11. Алексеева А.Е., Бруснигина Н.Ф., Гординская Н.А. Мобилом клинических карбапенем-устойчивых изолятов Klebsi-ella pneumoniae. Генетика. 2020; 56(3): 272-81. DOI: 10.31857/ S0016675820030030.
REFERENCES
1. Yang Y., Higgins C.H., Rehman I., Galvao K.N., Brito I.L., Bicalho M.L. et al. Genomic diversity, virulence, and antimicrobial resistance of Klebsiella pneumoniae strains from cows and humans. Appl. Environ. Microbiol. 2019; 85(6). DOI: 10.1128/AEM.02654-18.
2. Pendleton J.N., Gorman S.P., Gilmore B.F. Clinical relevance of the ESKAPE pathogens. Expert. Rev. Anti. Infect. Ther. 2013; 11(3): 297-30. D0I:10.1586/eri.13.12.
3. Wyres K.L., Holt K.E. Klebsiella pneumoniae as a key trafficker of drug resistance genes from environmental to clinically important bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 2018; 45: 131-9. DOI: 10.1016/j. mib.2018.04.004.
4. Partridge S.R., Kwong S.M., Firth N., Jensen S.O. Mobile genetic elements associated with antimicrobial resistance. Clin. Microbiol. Rev. 2018; 31(4): e00088-17. DOI: 10.1128/CMR.00088-17.
5. Tatusova T., DiCuccio M., Badretdin A., Chetvernin V., Nawrocki E.P., Zaslavsky L. et al. NCBI prokaryotic genome annotation pipeline. Nucleic Acids Res. 2016; 44(14): 6614-24. DOI: 10.1093/nar/ gkw569.
6. Francisco A.P., Bugalho M., Ramirez M., Carrijo J.A. Global optimal eBURST analysis of multilocus typing data using a graphic matroid approach. BMC Biol. 2009; 10: 152. DOI: 10.1186/14712105-10-152.
7. Diancourt L., Passet V., Verhoef J., Grimont P.A., Brisse S. Multilocus Sequence Typing of Klebsiella pneumoniae nosocomial isolates. J. Clin. Microbiol. 2005; 43: 4178-82. DOI: 10.1128/ JCM.43.8.4178-4182.2005.
8. Chen Y.T., Chang H.Y., Lai Y.C., Pan C.C., Tsai S.F., Peng H.L. Sequencing and analysis of the large virulence plasmid pLVPK
CLINICAL MOLECULAR STUDIES
of Klebsiella pneumoniae CG43. Gene. 2004; 337: 189-98. DOI: 10.1016/j.gene.2004.05.008.
9. Wu K.M., Li L.H., Yan J.J., Tsao N., Liao T.L., Tsai H.C. et al. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiella pneumoniae NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis. J. Bacteriol. 2009; 191(14): 4492-01. DOI: 10.1186/s13756-019-0596-1.
10. Shelenkov A., Mikhaylova Y., Yanushevich Y., Samoilov A., Petrova L., Fomina V. et al. Molecular typing, characterization of antimicrobial resistance, virulence profiling and analysis of whole-genome sequence of clinical Klebsiella pneumoniae isolates. Antibiotics (Basel). 2020; 9(5): 1-15. DOI: 10.3390/antibiotics9050261.
11. Alekseeva A.E., Brusnigina N.F., Gordinskaya N.A The mobilome of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae clinical isolates. Genetika. 2020; 56(3): 280-8. DOI:10.1134/S1022795420030035. (in Russian)
12. Poirel L., Bonnin R.A., Nordmann P. Genetic features of the widespread plasmid coding for the carbapenemase OXA-48. An-timicrob. Agents Chemother. 2012; 56 (1): 559-62. DOI: 10.1128/ AAC.05289-11.
13. Colclough A.L., Alav I., Whittle E.E., Pugh H.L., Darby E.M., Le-good S.W. et al. RND efflux pumps in Gram-negative bacteria; regulation, structure and role in antibiotic resistance. Future Microbiol. 2020; 15: 143-57. DOI: 10.2217/fmb-2019-0235.
14. Ogawa W., Onishi M., Ni R., Tsuchiya T., Kuroda T. Functional study of the novel multidrug efflux pump KexD from Klebsiella pneumoniae. Gene. 2012; 498(2): 177-82. DOI: 10.1016/j. gene.2012.02.008.
15. Du D., Wang-Kan X., Neuberger A., van Veen H.W., Pos K.M., Piddock L.J.V. et al. Multidrug efflux pumps: structure, function and regulation. Nat. Rev. Microbiol. 2018; 16(9): 523-39. DOI:10.1038/ s41579-018-0048-6.
16. Kumar S., Mukherjee M.M., Varela M.F. Modulation of bacterial multidrug resistance efflux pumps of the major facilitator superfami-ly. Int. J. Bacteriol. 2013; 2013: 204141. DOI:10.1155/2013/204141.
17. Makarova K.S., Wolf Y.I., Iranzo J., Shmakov S.A., Alkhnbashi O.S., Brouns S.J.J. et al. Evolutionary classification of CRISPR-Cas systems: a burst of class 2 and derived variants. Nat. Rev. Microbiol. 2020; 18(2): 67-3. DOI: 10.1038/ s41579-019-0299-x.
18. Newire E., Aydin A.., Juma S., Enne V.I., Roberts A.P. Identification of a Type IV-A CRISPR-Cas System located exclusively on IncHI1B/IncFIB plasmids in Enterobacteriaceae. Front. Microbiol. 2020; 11: 1937. DOI: 10.3389/fmicb.2020.01937.
19. Fursova N.K., Astashkin E.I., Gabrielyan N.I., Novikova T.S., Fedyukina G.N., Kubanova et al. Emergence of five genetic lines ST395 NDM-1, ST13 OXA-48, ST3346 OXA-48, ST39 CTX-M-14, and novel ST3551 OXA-48 of multidrug-resistant clinical Klebsiella pneumoniae in Russia. Microb. Drug Resist. 2020; 26(8): 924-33. DOI: 10.1089/mdr.2019.0289.
20. Maida C., Bonura C., Geraci D., Graziano G., Carattoli A., Rizzo A. et al. Outbreak of ST395 KPC-Producing Klebsiella pneumoniae in a Neonatal Intensive Care Unit in Palermo, Italy. Infect. ControlHosp. Epidemiol. 2018; 39(4): 496-8. DOI:10.1017/ ice.2017.267.
21. Muggeo A., Guillard T., Klein F., Reffuveille F., François C., Ba-bosan A. et al. Spread of Klebsiella pneumoniae ST395 non-susceptible to carbapenems and resistant to fluoroquinolones in NorthEastern France. J. Glob. Antimicrob. Resist. 2018; 13: 98-103. DOI: 10.1016/j.jgar.2017.10.023.
22. Li L., Yuan Z., Chen D., Xie X., Zhang B. Clinical and microbiological characteristics of invasive and hypervirulent Klebsiella pneumoniae infections in a teaching hospital in China. Infect. Drug Resist. 2020; 13: 4395-403. DOI: 10.2147/IDR.S282982.
23. Mendonça N., Ferreira E., Louro D. Antibiotic Resistance Surveillance Program in Portugal (ARSIP) Participants, Caniça M. Molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility of extended- and broad-spectrum beta-lactamase-producing Klebsiella pneumoniae
isolated in Portugal. Int. J. Antimicrob. Agents. 2009; 34(1): 29-37. DOI: 10.1016/j.ijantimicag.2008.11.014.
24. Marcoleta A.E., Berríos-Pastén C., Nuñez G., Monasterio O., Lagos R. Klebsiella pneumoniae asparagine tDNAs are integration hotspots for different genomic islands encoding Microcin E492 production determinants and other putative virulence factors present in hypervirulent strains. Front. Microbiol. 2016; 7(849). DOI: 10.3389/fmicb.2016.00849.
25. Fasciana T., Gentile B., Aquilina M., Ciammaruconi A., Mascarella C., Anselmo A. et al. Co-existence of virulence factors and antibiotic resistance in new Klebsiella pneumoniae clones emerging in south of Italy. BMC Infect. Dis. 2019; 19: 2019. DOI: 10.1186/ s12879-019-4565-3.
26. Ma L.C., Fang C.T., Lee C.Z., Shun C.T., Wang J.T. Genomic heterogeneity in Klebsiella pneumoniae strains is associated with primary pyogenic liver abscess and metastatic infection. J. Infect. Dis. 2005; 192(1): 117-28. DOI: 10.1086/430619.
27. Novais A., Cantón R., Moreira R., Peixe L., Baquero F., Coque T.M. Emergence and dissemination of Enterobacteriaceae isolates producing CTX-M-1-like enzymes in Spain are associated with IncFII (CTX-M-15) and broad-host-range (CTX-M-1, -3, and -32) plasmids. Antimicrob. Agents Chemother. 2007; 51(2): 796-9. DOI: 10.1128/AAC.01070-06.
28. Dolejska M., Villa L., Hasman H., Hansen L., Carattoli A. Characterization of IncN plasmids carrying blaCTX-M-1 and qnr genes in Escherichia coli and Salmonella from animals, the environment and humans. J. Antimicrob. Chemother. 2013; 68(2): 333-9. DOI: 10.1093/jac/dks387.
29. Carattoli A., Seiffert S.N., Schwendener S., Perreten V., Endimiani
A. Differentiation of IncL and IncM plasmids associated with the spread of clinically relevant antimicrobial resistance. PLoS ONE. 2015; 10(5): e0123063. DOI: 10.1371/journal. pone.0123063.
30. Schwanbeck J., Bohne W., Hasdemir U., Groß U., Pfeifer Y., Bunk
B. et al. Detection of a new resistance-mediating plasmid chimera in a blaOXA-48-positive Klebsiella pneumoniae strain at a German University Hospital. Microorganisms. 2021; 9(4): 720. DOI: 10.3390/microorganisms9040720.
31. Uz Zaman T., Aldrees M., Al Johani S.M., Alrodayyan M., Al-dughashem F.A., Balkhy H.H. Multi-drug carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae infection carrying the OXA-48 gene and showing variations in outer membrane protein 36 causing an outbreak in a tertiary care hospital in Riyadh, Saudi Arabia. Int. J. Infect. Dis. 2014; 28: 186-92. DOI: 10.1016/j.ijid.2014.05.021.
32. Ruiz E., Ocampo-Sosa A.A., Rezusta A., Revillo M.J., Román E., Torres C. et al. Acquisition of carbapenem resistance in multiresis-tant Klebsiella pneumoniae strains harbouring blaCTX-M-15, qnrSl and aac(6')-Ib-cr genes. J. Med. Microbiol. 2012; 61(5): 672-7. DOI: 10.1099/jmm.0.038083-0.
33. Schneiders T., Amyes S.G., Levy S.B. Role of AcrR and ramA in fluoroquinolone resistance in clinical Klebsiella pneumoniae isolates from Singapore. Antimicrob. Agents Chemother. 2003; 47(9): 2831-7. DOI: 10.1128/AAC.47.9.2831-2837.2003.
34. Hentschke M., Wolters M., Sobottka I., Rohde H., Aepfelbacher M. ramR mutations in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae with reduced susceptibility to tigecycline. Antimicrob. Agents Chemoth-er. 2010; 54: 2720-3. DOI: 10.1128/AAC.00085-10.
35. Barrangou R. Diversity of CRISPR-Cas immune systems and molecular machines. Genome Biol. 2015; 16: 247. DOI: 10.1186/ s13059-015-0816-9.
36. Newire E., Aydin A., Juma S., Enne V.I., Roberts A.P. Identification of a Type IV-A CRISPR-Cas System located exclusively on IncHI1B/IncFIB plasmids in Enterobacteriaceae. Front. Microbiol. 2020; 11: 1937. Doi: 10.3389/fmicb.2020.01937.
37. Pinilla-Redondo R., Mayo-Muñoz D., Russel J., Garrett R.A., Randau L., S0rensen S.J. et al. Type IV CRISPR-Cas systems are highly diverse and involved in competition between plasmids. Nucleic Acids Res. 2020; 48(4): 2000-12. DOI: 10.1093/nar/gkz1197. 21.
