CC BY
24
НАУЧНАЯ СТАТЬЯ
https://doi.oig/10.36233/0507-4088-145 © КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2022
Молекулярно-генетическая характеристика многокомпонентного флавиподобного вируса Kindia tick virus (Flaviviridae), обнаруженного в иксодовых клещах на территории Гвинейской Республики
Карташов М.Ю.1, Гладышева А.В.1, Найденова Е.В.2, Захаров К.С.2, Швалов А.Н.1, Кривошеина Е.И.1, Сеничкина А.М.2, Ба М.Б.3, Терновой В.А.1, Бумбали С.3, Локтев В.Б.1
1ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор), 630559, Новосибирская область, п.г.т. Кольцово, Россия;
2ФКУН «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Роспотребнадзор), 410005, г. Саратов, Россия; Исследовательский институт прикладной биологии Гвинеи, г. Киндиа, Гвинейская Республика
Введение. Иксодовые клещи - переносчики возбудителей многих инфекционных болезней. Недавно при исследовании клещей Rhipicephalus geigyi, собранных с домашнего скота в Гвинейской Республике, обнаружен новый многокомпонентный флавиподобный РНК-содержащий вирус, получивший название Kindia tick virus (KITV), с необычным механизмом реализации генетической информации.
Цель работы - обнаружение и исследование генетического разнообразия KITV в иксодовых клещах, собранных на территории провинции Киндиа Гвинейской Республики.
Материалы и методы. В 2021 г с крупного рогатого скота собрано 324 экземпляра клещей видов Amblyomma variegatum, Rh. geigyi, Rh. annulatus, Rh. decoloratus, Rh. senegalensis. Детекция вирусной РНК проводилась в индивидуальных образцах клещей методом ОТ-ПЦР с последующим определением нуклео-тидной последовательности и проведением филогенетического анализа.
Результаты и обсуждение. Инфицированность KITV клещей вида Rh. geigyi составила 12,2%, Rh. annulatus -4,4%, Rh. decoloratus - 3,3%. Однако генетический материал KITV в клещах Am. variegatum, являющихся одним из доминирующих видов в Западной Африке, выявлен не был. Для всех изолятов вируса определена частичная нуклеотидная последовательность каждого из четырёх вирусных сегментов (GenBank, OK345271-OK345306), филогенетический анализ которых показал высокий уровень их тождественности (98,5-99,8%) по каждому из четырёх сегментов вирусного генома с ранее обнаруженными в Гвинейской Республике. Полученные изоляты KITV наиболее генетически близки к Mogiana tick virus, который ранее был обнаружен в Южной Америке в клещах Rh. microplus, и существенно отличаются от других многокомпонентных вирусов, циркулирующих в странах Европы и Азии, в том числе и в Российской Федерации. Заключение. Генетический материал KITV обнаружен в трёх видах иксодовых клещей, собранных с домашнего скота ряда префектур Гвинейской Республики. Уровень инфицированности клещей составил 3,312,2%. Актуальным остаётся продолжение исследований в данном направлении.
Ключевые слова: многокомпонентные флавиподобные вирусы; Kindia tick virus; KITV; иксодовые клещи; Гзинейская Республика
Для цитирования: Карташов М.Ю., Гладышева А.В., Найденова Е.В., Захаров К.С., Швалов А.Н., Кривошеина Е.И., Сеничкина А.М., Ба М.Б., Терновой В.А., Бумбали С., Локтев В.Б. Молекулярно-генетическая характеристика многокомпонентного флавиподобного вируса Kindia tick virus (Flaviviridae), обнаруженного в иксодовых клещах на территории Гвинейской Республики. Вопросы вирусологии. 2022; 67(6): 487-495. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-145
Для корреспонденции: Карташов Михаил Юрьевич, канд. биол. наук, старший научный сотрудник отдела молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов, ФБУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Роспотребнадзора, 630559, п.г.т. Кольцово, Россия. E-mail: mikkartash@ yandex.ru
Участие авторов: Карташов М.Ю. - концепция и дизайн исследования, проведение лабораторных исследований, статистическая обработка данных, написание текста статьи; Гладышева А.В. - сбор и обработка материала, написание текста статьи; Найденова Е.В. - сбор и обработка материала, написание и редактирование текста статьи; Захаров К.С. - проведение лабораторных исследований, подготовка иллюстраций; Швалов А.Н. - сбор и обработка материала, статистическая обработка данных; Кривошеина Е.И. - проведение лабораторных исследований; Сеничкина А.М. - проведение лабораторных исследований; Ба М.Б. - сбор и доставка проб биологического материала; Терновой В.А. - руководство исследованиями; Бумбали С. - руководство сбором и доставкой материала; Локтев В.Б. - общее руководство.
ORIGINAL RESEARCH
Финансирование. Исследования проводились в рамках Распоряжения Правительства Российской Федерации от 14.11.2020 № 2985-р о российско-гвинейском научно-техническом сотрудничестве в области эпидемиологии, профилактики и мониторинга бактериальных и вирусных инфекций в Гвинейской Республике. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Этическое утверждение. Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с CONSENSUS AUTHOR GUIDELINES FOR ANIMAL USE (IAVES 23 JULY 2010).
Поступила 29.09.2022 Принята в печать 21.11.2022 Опубликована 30.12.2022
ORIGINAL ARTICLE
https://doi.org/10.36233/0507-4088-145
Molecular and genetic characteristics of the multicomponent flavi-like Kindia tick virus (Flaviviridae) found in ixodes ticks on the territory of the Republic of Guinea
Mikhail Yu. Kartashov1, Anastasia V. Gladysheva1, Ekaterina V. Naidenova2, Kirill S. Zakharov2, Alexander N. Shvalov1, Ekaterina I. Krivosheina1, Aislu M. Senichkina2, Mamadou B. Bah3, Vladimir A. Ternovoi1, Sanaba Boumbaly3, Valery B. Loktev1
1State Research Center of Virology and Biotechnology «Vector», 630559, Koltsovo, Novosibirsk region, Russia; 2Russian Research Anti-Plague Institute «Microbe», 410005, Saratov, Russia; 3Research Institute of Applied Biology of Guinea, Kindia, Republic of Guinea
Introduction. Ixodes ticks are vectors for pathogens of many infectious diseases. Recently, during the study of Rhipicephalus geigyi ticks collected from livestock in the Republic of Guinea, a new multicomponent flavi-like RNA virus, called Kindia tick virus (KITV), was discovered with an unusual mechanism for the implementation of genetic information.
The aim of the work is to detect and study the genetic diversity of KITV in ixodes ticks collected in the territory of the Kindia province of the Republic of Guinea.
Material and methods. In 2021, 324 specimens of ticks of the species Amblyomma variegatum, Rh. geigyi, Rh. annulatus, Rh. decoloratus, Rh. senegalensis were collected from cattle. The detection of viral RNA was carried out in individual samples of ticks by RT-PCR, followed by the determination of the nucleotide sequence and phylogenetic analysis.
Results and discussion. KITV detection rates in ticks of the species Rh. geigyi was 12.2%, Rh. annulatus - 4.4%, Rh. decoloratus - 3.3%. However, the KITV genetic material has not been identified in Am. variegatum ticks, which are one of the dominant species in West Africa. For all virus isolates, a partial nucleotide sequences of each of the four viral segments (GenBank, 0K345271-0K345306) were determined. The phylogenetic analysis showed a high level of identity (98.5-99.8%) for each of the four segments of the viral genome with those previously found in the Republic of Guinea. The obtained KITV isolates are most genetically close to Mogiana tick virus, which was previously detected in South America in Rh. microplus ticks and significantly differed from other multicomponent viruses circulating in Europe and Asia, including the Russian Federation.
Conclusion. KITV genetic material was found in three species of ixodid ticks collected from livestock in a number of prefectures of the Republic of Guinea. The infection rate in ticks was 3.3-12.2%. The continuation of research in this direction remains relevant.
Keywords: multicomponent flavi-like viruses; Kindia tick virus; KITV; ixodid ticks; Republic of Guinea For citation: Kartashov M.Yu., Gladysheva A.V., Naidenova E.V., Zakharov K.S., Krivosheina E.I., Shvalov A.N., Senichkina A.M., Bah M.B., Ternovoi V.A., Boumbaly S., Loktev V.B. Molecular and genetic characteristics of the multicomponent flavi-like Kindia tick virus (Flaviviridae) found in ixodid ticks on the territory of the Republic of Guinea. Problems of Virology (Voprosy Virusologii). 2022; 67(6): 487-495. DOI: https://doi.org/10.36233/0507-4088-145 For correspondence: Mikhail Yu. Kartashov, Ph.D. (Biol.), Senior Researcher, FSBI State Research Center of Virology and Biotechnology "Vector" of the Federal Service for Surveillance of Consumer Rights Protection and Human Welfare (Rospotrebnadzor), 630559, Novosibirsk Region, Koltsovo, Russia. E-mail: [email protected] Information about the authors: Kartashov M.Yu., https://orcid.org/0000-0002-7857-6822 Gladysheva A.V., https://orcid.org/0000-0002-7396-3954 Naidenova E.V., https://orcid.org/0000-0001-6474-3696 Zakharov K.S., https://orcid.org/0000-0002-4726-309X Shvalov A.N., https://orcid.org/0000-0001-6890-1575
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Krivosheina E.I., https://orcid.org/0000-0001-5181-0415 Senichkina A.M., https://orcid.org/0000-0003-1026-2680 Bah M.B., https://orcid.org/0000-0002-4565-269X Ternovoi V.A., https://orcid.org/0000-0003-1275-171X Boumbaly S., https://orcid.org/0000-0002-4506-6033 Loktev V.B., https://orcid.org/0000-0002-0229-321X
Contribution: Kartashov M.Yu. - organization and planning of research, performing the experiments, data analysis and interpretation, text preparation; Gladysheva A.V. - performing the experiments, text preparation; Naidenova E.V. -material collection and processing, text preparation; Zakharov K.S. - performing the experiments; illustrations preparation; Shvalov A.N. - presentation of results and illustrations, statistical processing of data; Krivosheina E.I. - performing the experiments; Senichkina A.M. - performing the experiments; Bah M.B. - collection and delivery of samples of biological material; Ternovoi V.A. - research management; Boumbaly S. - organization and control of research; Loktev V.B. - general guidance.
Funding. The studies were conducted within the framework of the Orders of the Government of the Russian Federation of November 14, 2020 No. 2985-p on Russian-Guinean scientific and technical cooperation in the field of epidemiology, prevention and monitoring of bacterial and viral infections in the Republic of Guinea. Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Ethics approval. Authors confirm compliance with institutional and national standards for the use of laboratory animals in accordance with CONSENSUS AUTHOR GUIDELINES FOR ANIMAL USE (IAVES 23 JULY 2010).
Received 29 September 2022 Accepted 21 November 2022 Published 30 December 2022
Введение
События последних десятилетий позволяют по-другому оценить проблему новых и вновь возникающих инфекционных болезней вирусной этиологии. Яркими примерами чрезвычайных ситуаций, характеризующими всю опасность таких инфекций, могут служить эпидемии птичьего гриппа типа H5N и лихорадки Зика, а также продолжающаяся пандемия новой коронавирусной инфекции COVID-19, вызванная вирусом SARS-CoV-2. Возникновение этих инфекционных заболеваний является результатом вторичной или межвидовой передачи вирусных агентов от их естественных хозяев к человеку [1].
В то же время рядом авторов показано, что различные вирусы, представляющие разные семейства, выстраивают взаимоотношения в схеме «вирус - хозяин» по определённым правилам. Так, представители семейства Flaviviridae демонстрируют разнообразные примеры таких взаимодействий [2-4]. Например, вирусы денге, Зика или желтой лихорадки передаются комарами, вирус клещевого энцефалита - клещами, а вирус гепатита С вообще не имеет членистоногих переносчиков.
В связи с этим определённый интерес представляет обнаружение новых флавиподобных вирусов, таких как Jingmen tick virus (JMTV), который впервые был изолирован из клещей вида Rhipicephalus microplus, собранных в китайской провинции Хубэй, и назван в соответствии с географическим местом открытия -регионом Jingmen [5]. Фактически одновременно похожий многокомпонентный флавивирус Guaico Culex virus (GCXV) был обнаружен в комарах рода Culex в Перу, Панаме и на острове Тринидад в Карибском море [5, 6].
В дополнение к эктопаразитам генетический материал вируса JMTV (RC27) также удалось определить в плазме крови приматов - красных колобусов (род Piliocolobus (Rochebrune, 1877)), обитающих
в Уганде, а также в сыворотках крови крупного рогатого скота (КРС) и грызунов [5-8]. Предполагается, что JMTV вызвал вспышки лихорадочных заболеваний в Китае и Косово [7, 9, 10]. Это позволило говорить о способности данного вируса преодолевать межвидовые барьеры и эффективно реплицироваться как в эктопаразитах, так и в теплокровных животных.
Впоследствии в различных видах членистоногих и позвоночных были обнаружены другие многокомпонентные флавиподобные вирусы, имеющие устройство генома и механизм реализации генетической информации, схожий с JMTV. Так, Mogiana tick virus (MGTV) был выделен из слюнных желёз клеща Rh. microplus в Бразилии [11]. Чуть позднее на северо-востоке Китая была выявлена циркуляция ранее неизвестного вируса Alongshan (ALSV). Вскоре данный патоген был выделен из клещей Ixodes ricinus (Linnaeus, 1758) на юго-востоке Финляндии и в ряде регионов Российской Федерации [12, 13]. Многокомпонентные флавиподобные вирусы также были обнаружены на территории Турции в клещах Rh. sanguineus sensu lato (Latreille, 1806), Rh. turanicus (Pomerantsev, 1936), Rh. bursa (Canestrini & Fanzago, 1878), Hyalomma marginatum (Koch, 1844), Haemaphysalis inermis (Birula, 1895), Ha. parva (Neumann, 1897) [14]. Схожий многокомпонентный вирус был детектирован в крови больных Крым-ской-Конго геморрагической лихорадкой (ККГЛ) в Косово и на юге России [15].
Для организации генома всех флавиподобных вирусов характерно наличие сегментов и генов, кодирующих два ключевых неструктурных вирусных белка, схожих с белками представителей семейства Flaviviridae (NS3 и NS5). Многокомпонентные флавиподобные вирусы имеют в своей структуре от 4 (характерно для большинства вирусов, изолированных из клещей, летучих мышей, обезьян и человека) до 5 (встречается у вирусов, выделенных из комаров)
ORIGINAL RESEARCH
Рис. 1. Схема строения генома многокомпонентных флавиподобных вирусов на примере KITV. Fig. 1. Scheme of the structure of the genome of multicomponent flavi-like viruses on the example of KITV
сегментов, которые ограничены с 5'- и З'-концов не-транслируемыми регионами, а также полиаденили-рованы (рис. 1). Сегмент 1 кодирует неструктурный NS5-like белок, имеющий гомологию с белком NS5 (РНК-зависимая РНК-полимераза) классических представителей семейства Flaviviridae. Сегмент 3 ко -дирует неструктурный белок, имеющий высокую степень гомологии с флавивирусным белком NS3. Белок NS3 наряду с NS5 играет центральную роль в репликации вируса и является одним из наиболее изученных неструктурных белков. N-концевой домен NS3 обладает протеазной активностью, которая необходима для процессинга полипротеина, а C-концевой домен выполняет функцию геликазы и участвует в кэпиро-вании и синтезе вирусной РНК. На сегодняшний день хорошо изучена структура белка NS3 у большинства несегментированных флавивирусов, и их анализ показывает высокую гомологию не только в строении, но также в механизмах гидролиза аденозинтрифос-фата, распознавания и раскручивания РНК [16]. Структурные белки VP1, VP2 VP3 закодированы во втором и четвертом фрагменте и не имеют известных гомологов среди как флавивирусов, так и других известных на сегодняшний день вирусов. Сегмент 2 кодирует предполагаемый гликопротеин VP1. Белки VP2 (предполагаемый капсидный белок) и VP3 (предполагаемый вирусный мембранный белок) закодированы в сегменте 4 и имеют частично перекрывающиеся рамки трансляции [14]. Также рядом авторов проведены немногочисленные серологические исследования на основе структурных белков VP1 и VP2 с целью изучения циркуляции специфичных антител в сыворотках овец и КРС, являющихся прокормите-лями членистоногих переносчиков [17], или у пациентов с укусом клеща в анамнезе [12].
В настоящее время доказана патогенность многокомпонентных флавиподобных вирусов для сельскохозяй-
ственных животных и человека. Однако эти сведения носят фрагментарный и ограниченный характер. Не исключена вероятность того, что их роль в инфекционной патологии может быть более значимой, чем принято считать. Установление факта того, что многокомпонентные флавиподобные вирусы достаточно широко распространены и обнаружены на территории Азии, Европы, Африки и Америки, также диктует необходимость в продолжении изучения этой группы патогенов.
Имеется предположение, что флавивирусы, переносимые клещами, произошли на Африканском континенте из Кадам-подобного вируса (KADV) около 28,5 тыс. лет назад. В дальнейшем они распространились по территории Европы, Азии и Америки. Вполне вероятно, что африканские многокомпонентные фла-вивирусы, такие как Kindia tick virus (KITV), - наиболее вероятные кандидаты в предшественники современных представителей данной группы патогенов [18].
Ранее на территории Гвинейской Республики при проведении метагеномных исследований из суспензий клещей вида Rh. geigyi, собранных с КРС на территории провинции Киндиа, впервые был изолирован многокомпонентный флавиподобный вирус, получивший предварительное название Kindia tick virus [15, 19]. Было показано, что наибольшую степень гомологии KITV имел с MGTV, выделенным из клещей Rh. microplus в Южной Америке.
Уровень различия нуклеотидных/аминокислотных последовательностей KITV с другими представителями сегментированных флавиподобных вирусов составил 7-28/3,1-21,8% (для сегмента 1); 7,7-20,6/3,420,3% (для сегмента 2); 2,3-29,3/1,3-20,8% (для сегмента 3) и 0,4-22/0,2-15% (для сегмента 4).
Целью данной работы был дальнейший поиск и мо-лекулярно-генетическая характеристика многокомпонентных флавиподобных вирусов в иксодовых клещах, собранных на территории Гвинейской Республики.
Материалы и методы
Исследования были проведены на базе лаборатории Российско-гвинейского центра эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней, который расположен на территории Исследовательского института прикладной биологии в г. Киндиа, Гвинейская Республика [20].
Сбор клещей проводился в период с апреля по май 2021 г. при осмотре взрослых особей сельскохозяйственных животных, находящихся на свободном выпасе на территории префектур Койя, Дюбрека, Форекария, Киндиа, Телимеле провинции Киндия (рис. 2). Предварительно полученный и обработанный материал был протестирован методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием наборов реагентов российского производства для выявления маркеров возбудителей: РНК вируса ККГЛ «АмплиСенс CCHFV-FL»; РНК вируса клещевого энцефалита, ДНК Borrelia burgdorferi sl, Ehrlichia chaffeensis/E. muris и ДНК Anaplasma phagocytophilum «АмплиСенс TBEV, B. burgdorferi sl, A. phagocytophilum, E. chaffeensis/E. muris-FL»; ДНК Coxiella burnetii «АмплиСенс Coxiella burnetii-FL», ДНК риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки Rickettsia spp. «Набор реагентов АмплиСенс Rickettsia spp. SFG-FL»
(ФБУН «ЦНИИЭ», Россия), а также ДНК Francisella tularensis «Ген Francisella tularensis-РГФ» (ФКУЗ «РосНИПЧИ «Микроб», Россия). Для последующих исследований были выбраны пробы, в которых присутствие вышеупомянутых патогенов не было обнаружено.
Всего для исследования было собрано, сформировано и проанализировано 324 индивидуальные пробы клещей, относящихся к видам Am. variegatum, Rh. geigyi, Rh. annulatus, Rh. decoloratus и Rh. senegalensis. Эктопаразитов дважды отмывали 70% этанолом для удаления внешних загрязнений и наружной микрофлоры, после чего хранили при температуре -20 °C до проведения дальнейших исследований. Видовую принадлежность клещей устанавливали по морфологическим характеристикам согласно определителю [21] с использованием бинокуляра с увеличением ><56 с последующей таксономической верификацией нуклеотидной последовательности фрагмента гена рибосомальной РНК.
Обработку исследуемых проб проводили с помощью лабораторного гомогенизатора TissueLyser II (QIAGEN, Германия) в 500 мкл стерильного фос-фатно-солевого буфера. Вирусную РНК выделяли из 100 мкл клещевой суспензии методом фенол-хлороформной экстракции с использованием реагента ExtractRNA™ Reagent («Евроген», Россия). кДНК по-
Рис. 2. Территории префектуры Киндиа (Гвинейская Республика), где были собраны пробы для исследований. Места сбора клещей
обозначены звездочками.
Fig. 2. Territories of Kindia Prefecture (Republic of Guinea) where samples were collected for research. Tick collection sites are marked with
asterisks.
ORIGINAL RESEARCH
лучали в реакции обратной транскрипции с помощью коммерческого набора «РЕВЕРТА-L» («АмплиСенс», Россия) согласно инструкциям производителей.
Скрининг исследуемых образцов на наличие генетического материала KITV осуществляли методом ПЦР с парой праймеров KITV1_bF/KITV1_bR, комплементарных сегменту 1 (^5-подобный ген, сегмент 1) (табл. 1). Для положительных образцов были получены ампликоны, частично перекрывающие все 4 сегмента генома KITV. Реакцию амплификации ставили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 12,5 мкл двукратной ПЦР-смеси («БиоЛабМикс», Россия), 0,2 мкМ каждого из праймеров и 1,5 мкл кДНК. Праймеры, используемые в данной работе, и ожидаемая длина ампликонов представлены в табл. 1. ОТ-ПЦР проводили в ампли-фикаторе T100 (Bio-Rad, США) согласно следующей программе амплификации: активация полимеразы при температуре 95 °C - 5 мин; далее 38 последовательных циклов: денатурация при 95 °C - 15 с, отжиг праймеров при 57 °C - 20 с, элонгация при 72 °C - 45 с, финальная элонгация при 72 °C - 5 мин. Продукты реакции учитывали методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий в концентрации 2 мкг/мл.
Нуклеотидные последовательности полученных ПЦР-фрагментов определяли с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v3.1 (ThermoFisher Scientific, США) с последующим анализом на секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, США). Полученные хроматограммы изучали с помощью программы SeqMan (DNAstar, США).
Филогенетический анализ проводили с помощью пакета программ MEGA Х методом максимального правдоподобия с использованием трёхпараметриче-
ской модели эволюции Тамуры Т92 [22]. Показатель статистической надёжности узлов филогенетического дерева рассчитывался с помощью бутстреп-анали-за для 1000 случайных реплик.
Частичные нуклеотидные последовательности сегментов изолятов KITV, выявленных в данной работе, были депонированы в международную базу данных GenBank под номерами OK345271-OK345279 - для сегмента 1, OK345280-OK345288 -для сегмента 2, OK345289-OK345297 - для сегмента 3, OK345298-OK345306 - для сегмента 4.
Авторы подтверждают соблюдение институциональных и национальных стандартов по использованию лабораторных животных в соответствии с CONSENSUS AUTHOR GUIDELINES FOR ANIMAL USE (IAVES 23 JULY 2010).
Результаты и обсуждение
В настоящем исследовании РНК KITV была обнаружена в 9 пробах. В последующем для всех изолятов определены частичные нуклеотидные последовательности каждого из сегментов: 1-й - 1609 пар нуклеоти-дов (п.н.), 2-й - 980 п.н., 3-й - 1114 п.н. и 4-й - 1116 п.н. Также в работе показано, что различия нуклеотидных и аминокислотных последовательностей KITV, по сравнению с другими представителями сегментированных флавиподобных вирусов, составили: для сегмента 1 -от 7 до 28% и от 3,1 до 21,8%; для сегмента 2 - от 7,7 до 20,6% и от 3,4 до 20,3%; для сегмента 3 - от 2,3 до 29,3% и от 1,3 до 20,8% и для сегмента 4 - от 0,4 до 22% и от 0,2 до 15% соответственно (табл. 2).
Уровень гомологии нуклеотидных последовательностей, выделенных в 2021 г. для сегмента 1, соста-
Таблица 1. Последовательности олигонуклеотидных праймеров, используемых в работе Table 1. Oligonucleotide primer used in the work
Ген-мишень Target gene Праймер Primer Структура праймера Primer sequence Температура отжига, °C T annealing, °C Длина ампликона, п.н. Amplicon length, bp
Internal transcribed Boophits 2F GCCGTCGACTCGTTTTGA 57 825
spacer 2 Boophits 2R TCCGAACAGTTGCGTGATAAA
Сегмент 1 KITV1_aF TGAAGAACGTCAAGCCCTGG 58 602
KITV Segment 1 KITV1_aR GCTGACCCACGAACCTGTTT
KITV1_bF KITV1_bR AAAGAAGGGCTCTGAGGGC CTTATACAGGCCCTGTCCCG 58 607
KITV1_cF GAAGTGCGGATGGAGCGTAG 58 619
KITV1_cR ACCTGTGGGAGCAGAAGGAT
Сегмент 2 KITV2_aF AACTTTGGGAGTGACCAGGG 58 617
KITV Segment 2 KITV2_aR GATAAGGCCGTCAGAGCGAG
KITV2_bF KITV2_bR CAGGGACGAGACATTGCCAA CCGTGGAGTAGTGGACCGTA 58 555
Сегмент 3 KITV3_aF AATTGGAGAGGCAGAGGGGA 58 609
KITV Segment 3 KITV3_aR GACCTTGTTGGACCAGGTCA
KITV3_bF GGCAACTCATGACCTGGTCC
KITV3_bR AGGACCACTGTGGCGTAGT 58 558
Сегмент 4 KITV4_aF CCCTACCAGGCCTGATACGA
KITV Segment 4 KITV4_aR TAGTAGCGGGCCAGGTTGTA 58 615
KITV4_bF GCGGAGAGAGAGAAAACGCA
KITV4_bR ACAGGTTCACGAACACAGCC 58 617
Таблица 2. Выявление РНК KITV среди разных видов иксодовых клещей методом ОТ-ПЦР
Table 2. Detection of KITV RNA among different species of ticks by RT-PCR
Вид клеща Species of ticks
Количество экземпляров (из них положительных) Number of samples (of which positive)
Встречаемость KITV Prevalence of KITV
Am. variegatum Rh. geigyi
Rh. annulatus
Rh. decoloratus
Rh. senegalensis
Всего
Total
197 (0) 0% (95% CI 0-1,9)
49 (6) 12,2%
(95% CI 5,7-24,2) 45 (2) 4,4% (95% CI
1,2-14,8) 30 (1) 3,3% (95% CI
0,7-16,1)
3 (0) 0% (95% CI 0-46,2)
324 (9) 2,8% (95% CI 1,5-5,1)
вил 98,5-100%; для сегмента 2 - 99,6-100%; для сегментов 3 и 4 - 99,5-100%. При сравнении с изолятом К1ТУУ2017/1, полученным в 2017 г., этот показатель был 98,7-99,2%, по сравнению с другими многокомпонентными флавиподобными вирусами колебался от 72 до 90% для фрагмента 1; от 60 до 90% - для фрагмента 2; от 73 до 90% - для фрагмента 3 и от 61 до 90% -для фрагмента 4.
На рис. 3 показано, что все последовательности, выделенные в 2021 г., кластеризуются в одну группу вместе с изолятом К1ТУУ2017/1 [18]. Обращает на себя внимание тот факт, что филогенетические деревья выявленных изолятов К1ТУ и других многокомпо-
нентных вирусов, построенные по каждому из сегментов, имеют практически одинаковую топологию. В 2021 г. К1ТУ был обнаружен в трёх видах иксодовых клещей, но последовательности были весьма консервативны, и существенных отличий, связанных с таксономической разницей эктопаразитов, выявлено не было.
Рядом авторов показано, что многокомпонентные флавиподобные вирусы подразделяются как минимум на три субклады [23]. Вирус К1ТУ и его выявленные в ходе исследования изоляты при проведении анализа по каждому из четырёх сегментов генома однозначно кластеризуются в субкладу А, куда также относятся MGTV (Бразилия), JMTV (Китай, Азия) и вариант JMTV/primate/Uganda (Африка). Субклада В включает изоляты JMTV с Антильских островов и варианты JMTV/human/Kosovo (МН133313-МН133316), выделенные от больных КГЛ. Субклада С объединяет изоляты JMTV из Франции (МШ95527-МШ95530) и вирус Alongshan, обнаруженный у домашних животных и человека в Китае и позднее выявленный в Европе и России.
Можно предположить, что для вирусов с многокомпонентным геномом характерны события перегруппировки/рекомбинации, которые могут вносить вклад в их генетическую изменчивость. Однако имеющиеся данные говорят о том, что геном JMTV чрезвычайно стабилен среди позвоночных и беспозвоночных, что позволяет предположить, что вирус уже хорошо адаптирован к обоим хозяевам. Нуклеотидные последовательности различных сегментов представителей этой группы показывают высокую степень гомологии
Рис. 3. Филогенетический анализ изолятов KITV из индивидуальных иксодовых клещей для всех четырёх сегментов генома. Fig. 3. Phylogenetic analysis of KITV isolates from individual ixodid ticks for all four genome segments.
ORIGINAL RESEARCH
среди географически удалённых вирусов, циркулирующих в Европе, Азии, Африке и Южной Америке. Геномный анализ не позволяет определить очевидные мутации, которые могли бы отразить адаптацию вируса к позвоночному или беспозвоночному хозяину. Возможно, такую консервативность геномов можно связать с распространением одного и того же вируса в различных ареалах. Для более полного понимания такого широкого распространения вируса необходимо исследовать роль перелётных птиц, грызунов и, возможно, летучих мышей.
Заключение
В настоящем исследовании показано, что Kindia tick virus является первым сегментированным фла-виподобным вирусом, обнаруженным на территории Западной Африки. Генетический материал KITV получен при исследовании иксодовых клещей видов Rh. geigyi, Rh. annulatus и Rh. decoloratus, собранных с домашнего скота, уровень инфицированности составил 3,3-12,2%. Филогенетический анализ четырёх фрагментов KITV показал высокий уровень их гомологии (98,5-100%) с ранее обнаруженными изолята-ми, выделенными в Гвинейской Республике в 2017 г., и позволил кластеризовать их в субкладу А JMTV-подобных вирусов.
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о необходимости проведения дальнейших исследований по изучению циркуляции KITV на территории Западной Африки, выявлению видов носителей/переносчиков и определению степени пато-генности для человека и животных.
ЛИТЕРАТУРА
1. Karesh W.B., Dobson A., Lloyd-Smith J.O., Lubroth J., Dixon M.A., Bennett M., et al. Ecology of zoonoses: natural and unnatural histories. Lancet. 2012; 380(9857): 1936-45. https://doi. org/10.1016/s0140-6736(12)61678-x
2. Gaunt M.W., Sall A.A., Lamballerie X., Falconar A.K.I., Dzhiva-nian T.I., Gould E.A. Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their epidemiology, disease association and bio-geography. J. Gen. Virol. 2001; 82(Pt. 8): 1867-76. https://doi. org/10.1099/0022-1317-82-8-1867
3. Kitchen A., Shackelton L.A., Holmes E.C. Family level phylogenies reveal modes of macroevolution in RNA viruses. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2011; 108(1): 238-43. https://doi.org/10.1073/pnas.1011090108
4. Blitvich B.J., Firth A.E. Insect-specific flaviviruses: a systematic review of their discovery, host range, mode of transmission, superinfection exclusion potential and genomic organization. Viruses. 2015; 7(4): 1927-59. https://doi.org/10.3390/v7041927
5. Qin X.C., Shi M., Tian J.H., Lin X.D., Gao D.Y., He J.R., et al. A tick-borne segmented RNA virus contains genome segments derived from unsegmented viral ancestors. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2014; 111(18): 6744-9. https://doi.org/10.1073/ pnas.1324194111
6. Ladner J.T., Wiley M.R., Beitzel B., Auguste A.J., Dupuis A.P. 2nd, Lindquist M.E., et al. A multicomponent animal virus isolated from mosquitoes. Cell Host Microbe. 2016; 20(3): 357-67. https://doi. org/10.1016/j.chom.2016.07.011
7. Emmerich P., Jakupi X., von Possel R., Berisha L., Halili B., Günther S., et al. Viral metagenomics, genetic and evolutionary characteristics of Crimean-Congo hemorrhagic fever orthonairovirus in humans, Kosovo. Infect. Genet. Evol. 2018; 65: 6-11. https://doi. org/10.1016/j.meegid.2018.07.010
8. Yu Z.M., Chen J.T., Qin J., Guo J.J., Li K., Xu Q.Y., et al. Identification and characterization of Jingmen tick virus in rodents from
Xinjiang, China. Infect. Genet. Evol. 2020; 84: 104411. https://doi. org/10.1016/j.meegid.2020.104411
9. Jia N., Liu H.B., Ni X.B., Bell-Sakyi L., Zheng Y.C., Song J.L., et al. Emergence of human infection with Jingmen tick virus in China: A retrospective study. EBioMedicine. 2019; 43: 317-24. https://doi. org/10.1016/j.ebiom.2019.04.004
10. Wang Z.D., Wang B., Wei F., Han S.Z., Zhang L., Yang Z.T., et al. A New Segmented Virus Associated with Human Febrile Illness in China. N. Engl. J. Med. 2019; 380(22): 2116-25. https://doi. org/10.1056/nejmoa1805068
11. Maruyama S.R., Castro-Jorge L.A., Ribeiro J.M., Gardinassi L.G., Garcia G.R., Brandäo L.G., et al. Characterisation of divergent flavivirus NS3 and NS5 protein sequences detected in Rhipiceph-alus microplus ticks from Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2014; 109(1): 38-50. https://doi.org/10.1590/0074-0276130166
12. Kuivanen S., Levanov L., Kareinen L., Sironen T., Jääskeläinen A.J., Plyusnin I., et al. Detection of novel tick-borne pathogen, Along-shan virus, in Ixodes Ricinus ticks, south-eastern Finland, 2019. Euro Surveill. 2019; 24(27): 1900394. https://doi.org/10.2807/1560-7917.es.2019.24.27.1900394
13. Kholodilov I.S., Litov A.G., Klimentov A.S., Belova O.A., Po-lienko A.E., Nikitin N.A., et al. Isolation and characterisation of Alongshan virus in Russia. Viruses. 2020; 12(4): 362. https://doi. org/10.3390/v12040362
14. Dinçer E., Hacioglu S., Kar S., Emanet N., Brinkmann A., Nitsche A., et al. Survey and characterization of Jingmen tick virus variants. Viruses. 2019; 11(11): 1071. https://doi.org/10.3390/v11111071
15. Терновой В.А., Гладышева А.В., Семенцова А.О., Зайковская А.В., Волынкина А.С., Котенев Е.С. и др. Обнаружение РНК нового многокомпонентного вируса у больных Крымской-Кон-го геморрагической лихорадкой на юге России. Вестник Российской академии медицинских наук. 2020; (2): 116-21. https:// doi.org/10.15690/vramn1192
16. Gao X., Zhu K., Wojdyla J.A., Chen P., Qin B., Li Z., et al. Crystal structure of the NS3-like helicase from Alongshan virus. IUCrJ. 2020; 7(Pt 3): 375-82. https://doi.org/10.1107/s2052252520003632
17. Wang Z.D., Wang W., Wang N.N., Qiu K., Zhang X., Tana G., et al. Prevalence of the emerging novel Alongshan virus infection in sheep and cattle in Inner Mongolia, northeastern China. Parasit. Vectors. 2019; 12(1): 450. https://doi.org/10.1186/s13071-019-3707-1
18. Henderson B.E., Tukei P.M., McCrae A.W., Ssenkubuge Y., Mugo W.N. Virus isolations from Ixodid ticks in Uganda. II. Kadam virus - a new member of arbovirus group B isolated from Rhipicephalus pravus Dontiz. EastAfr. Med. J. 1970; 47(5): 273-6.
19. Ternovoi V.A., Protopopova E.V., Shvalov A.N., Kartashov M.Yu., Bayandin R.B., Tregubchak T.V., et al. Complete coding genome sequence for a novel multicomponent Kindia tick virus detected from ticks collected in Guinea. bioRxiv. 2020. Preprint. https://doi. org/10.1101/2020.04.11.036723
20. Найденова Е.В., Лопатин А.А., Сафронов В.А., Коломоец Е.В., Левковский А.Е., Силла А.Л. и др. Обеспечение биологической безопасности при проведении противоэпидемических мероприятий в период ликвидации эпидемии лихорадки Эбола в Гвинейской Республике. Инфекционные болезни: новости, мнения, обучение. 2018; 7(3): 102-8. https://doi.org/10.24411/2305-3496-2018-13015
21. Walker A.R., Bouattour A., Camicas J.L., Agustin Estrada-Peña A., Horak I., LatifA.A., et al. Ticks of Domestic Animals in Africa: A Guide to Identification of Species. Edinburgh: Bioscience Reports; 2003.
22. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol. 2018; 35(6): 1547-9. https://doi.org/10.1093/mol-bev/msy096
23. Temmam S., Bigot T., Chrétien D., Gondard M., Pérot P., Pom-melet V., et al. Insights into the host range, genetic diversity, and geographical distribution of Jingmenviruses. mSphere. 2019; 4(6): e00645-19. https://doi.org/10.1128/msphere.00645-19
REFERENCES
1. Karesh W.B., Dobson A., Lloyd-Smith J.O., Lubroth J., Dix-on M.A., Bennett M., et al. Ecology of zoonoses: natural and unnatural histories. Lancet. 2012; 380(9857): 1936-45. https://doi. org/10.1016/s0140-6736(12)61678-x
2. Gaunt M.W., Sail A.A., Lamballerie X., Falconar A.K.I., Dzhiva-nian T.I., Gould E.A. Phylogenetic relationships of flaviviruses correlate with their epidemiology, disease association and bio-geography. J. Gen. Virol. 2001; 82(Pt. 8): 1867-76. https://doi. org/10.1099/0022-1317-82-8-1867
3. Kitchen A., Shackelton L.A., Holmes E.C. Family level phyloge-nies reveal modes of macroevolution in RNA viruses. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2011; 108(1): 238-43. https://doi.org/10.1073/ pnas.1011090108
4. Blitvich B.J., Firth A.E. Insect-specific flaviviruses: a systematic review of their discovery, host range, mode of transmission, superinfection exclusion potential and genomic organization. Viruses. 2015; 7(4): 1927-59. https://doi.org/10.3390/v7041927
5. Qin X.C., Shi M., Tian J.H., Lin X.D., Gao D.Y., He J.R., et al. A tick-borne segmented RNA virus contains genome segments derived from unsegmented viral ancestors. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2014; 111(18): 6744-9. https://doi.org/10.1073/pnas.1324194111
6. Ladner J.T., Wiley M.R., Beitzel B., Auguste A.J., Dupuis A.P. 2nd, Lindquist M.E., et al. A multicomponent animal virus isolated from mosquitoes. Cell Host Microbe. 2016; 20(3): 357-67. https://doi. org/10.1016/j.chom.2016.07.011
7. Emmerich P., Jakupi X., von Possel R., Berisha L., Halili B., Günther S., et al. Viral metagenomics, genetic and evolutionary characteristics of Crimean-Congo hemorrhagic fever orthonairovirus in humans, Kosovo. Infect. Genet. Evol. 2018; 65: 6-11. https://doi. org/10.1016/j.meegid.2018.07.010
8. Yu Z.M., Chen J.T., Qin J., Guo J.J., Li K., Xu Q.Y., et al. Identification and characterization of Jingmen tick virus in rodents from Xinjiang, China. Infect. Genet. Evol. 2020; 84: 104411. https://doi. org/10.1016/j.meegid.2020.104411
9. Jia N., Liu H.B., Ni X.B., Bell-Sakyi L., Zheng Y.C., Song J.L., et al. Emergence of human infection with Jingmen tick virus in China: A retrospective study. EBioMedicine. 2019; 43: 317-24. https://doi. org/10.1016/j.ebiom.2019.04.004
10. Wang Z.D., Wang B., Wei F., Han S.Z., Zhang L., Yang Z.T., et al. A New Segmented Virus Associated with Human Febrile Illness in China. N. Engl. J. Med. 2019; 380(22): 2116-25. https://doi. org/10.1056/nejmoa1805068
11. Maruyama S.R., Castro-Jorge L.A., Ribeiro J.M., Gardinassi L.G., Garcia G.R., Brandäo L.G., et al. Characterisation of divergent flavivirus NS3 and NS5 protein sequences detected in Rhipiceph-alus microplus ticks from Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2014; 109(1): 38-50. https://doi.org/10.1590/0074-0276130166
12. Kuivanen S., Levanov L., Kareinen L., Sironen T., Jääskeläinen A.J., Plyusnin I., et al. Detection of novel tick-borne pathogen, Along-shan virus, in Ixodes Ricinus ticks, south-eastern Finland, 2019. Euro Surveill. 2019; 24(27): 1900394. https://doi.org/10.2807/1560-7917.es.2019.24.27.1900394
13. Kholodilov I.S., Litov A.G., Klimentov A.S., Belova O.A., Po-lienko A.E., Nikitin N.A., et al. Isolation and characterisation of Alongshan virus in Russia. Viruses. 2020; 12(4): 362. https://doi. org/10.3390/v12040362
14. Dinçer E., Hacioglu S., Kar S., Emanet N., Brinkmann A., Nitsche A., et al. Survey and characterization of Jingmen tick virus variants. Vi -ruses. 2019; 11(11): 1071. https://doi.org/10.3390/v11111071
15. Ternovoy V.A., Gladysheva A.V., Sementsova A.O., Zaykovs-kaya A.V., Volynkina A.S., Kotenev E.S., et al. Detection of the RNA for new multicomponent virus in patients with Crimean-Congo hemorrhagic fever in southern Russia. Vestnik Rossiys-koy akademii meditsinskikh nauk. 2020; (2): 116-21. https://doi. org/10.15690/vramn1192 (in Russian)
16. Gao X., Zhu K., Wojdyla J.A., Chen P., Qin B., Li Z., et al. Crystal structure of the NS3-like helicase from Alongshan virus. IUCrJ. 2020; 7(Pt 3): 375-82. https://doi.org/10.1107/s2052252520003632
17. Wang Z.D., Wang W., Wang N.N., Qiu K., Zhang X., Tana G., et al. Prevalence of the emerging novel Alongshan virus infection in sheep and cattle in Inner Mongolia, northeastern China. Parasit. Vectors. 2019; 12(1): 450. https://doi.org/10.1186/s13071-019-3707-1
18. Henderson B.E., Tukei P.M., McCrae A.W., Ssenkubuge Y., Mugo W.N. Virus isolations from Ixodid ticks in Uganda. II. Kadam virus - a new member of arbovirus group B isolated from Rhipiceph-alus pravus Dontiz. EastAfr. Med. J. 1970; 47(5): 273-6.
19. Ternovoi V.A., Protopopova E.V., Shvalov A.N., Kartashov M.Yu., Bayandin R.B., Tregubchak T.V., et al. Complete coding genome sequence for a novel multicomponent Kindia tick virus detected from ticks collected in Guinea. bioRxiv. 2020. Preprint. https://doi. org/10.1101/2020.04.11.036723
20. Naydenova E.V., Lopatin A.A., Safronov V.A., Kolomoets E.V., Levkovskiy A.E., Silla A.L., et al. Biological safety at carrying out anti-epidemic measures during the liquidation of the epidemic Ebola fever in the Republic of Guinea. Infektsionnye bolezni: novosti, mneniya, obuchenie. 2018; 7(3): 102-8. https://doi. org/10.24411/2305-3496-2018-13015 (in Russian)
21. Walker A.R., Bouattour A., Camicas J.L., Agustin Estrada-Peña A., Horak I., Latif A.A., et al. Ticks of Domestic Animals in Africa: A Guide to Identification of Species. Edinburgh: Bioscience Reports; 2003.
22. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Mol. Biol. Evol. 2018; 35(6): 1547-9. https://doi.org/10.1093/mol-bev/msy096
23. Temmam S., Bigot T., Chrétien D., Gondard M., Pérot P., Pom-melet V., et al. Insights into the host range, genetic diversity, and geographical distribution of Jingmenviruses. mSphere. 2019; 4(6): e00645-19. https://doi.org/10.1128/msphere.00645-19
