CC BY
437
Л Журнал фундаментальной медицины и биологии УДК 616.155.392-036
Зельцер А.Н., Бурнашева Е.В., Шатохин Ю.В.
ОБЗОРЫ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА
Ростовский государственный медицинский университет,
Россия, 344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29 E-mail: [email protected]
Хронический миелолейкоз (ХМЛ) — клональное миелопролиферативное заболевание, характеризующееся наличием специфического цитогенетического маркера t(9;22)(q34;q11.2), или филадельфийской (Ph) хромосомы. Ph—хромосома образуется в результате реципрокной транслокации между хромосомами 9 и 22, вследствие разрыва хромосомы 9 в локусе q34.1 и переноса З'-сегмента гена ABL1 на 5'-конец гена BCR, расположенного в локусе q11.21 хромосомы 22. В итоге появляется химерный ген BCR-ABL, который обладает высокой тирозинкиназной активностью. Открытия в области молекулярной биологии ХМЛ послужили внедрению первого препарата патогенетического действия при этом заболевании — иматиниба, который показал высокую эффективность при лечении больных ХМЛ. Полный цитогенетический ответ, при котором в костном мозге не выявляется Ph—хромосома и восстанавливается нормальное кроветворение, является общепринятым стандартом определения эффективности терапии иматинибом ХМЛ. Анализ кариотипа опухолевых клеток при ХМЛ является основополагающим в диагностике и мониторинге терапии этого заболевания.
Ключевые слова: хронический миелолейкоз, Ph—хромосома, цитогенетическая диагностика, молекулярная диагностика, химерный ген BCR-ABL, иматиниб, дополнительные хромосомные абберации.
Zeltser A.N., Burnasheva E.V., Shatokhin Yu.V.
MOLECULAR GENETIC CHARACTERISTICS OF CHRONIC MYELOID LEUKEMIA
Rostov State Medical University, 29 Nakhichevanskiy str, Rostov-on-Don, 344022, Russia E-mail: [email protected]
Chronic myeloid leukemia (CML) is the clonal myeloprolipherative disorder, that characterized by the presence of the so called Philadelphia (Ph) chromosome appeared as the result of reciprocal translocation t(9;22) (q34;q11). The target therapy of CML by tyrosine kinase inhibitor (TKI) imatinib significantly improved the outcomes of CML patients treatment. The purpose of this investigation was to estimate the cytogenetic method in the determination of the effectiveness of TKI therapy and prognosis of CML therapy outcomes. As a results of investigation were revealed that cytogenetic response is the main criteria for the estimation of TKI therapy of CML. The phase, dose and discontinuation of TKI therapy are very important factors for successful NTKI therapy of CML. The patients with additional chromosomal abnormalities (ACA) in Ph-positive cells has poor prognosis for outcome of imatinib therapy of CML patients.
Keywords: chronic myeloid leukemia, cytogenetic diagnostics, Ph-chromosome, molecular diagnostics, BCR - ABL gene, imatinib, additional chromosomal abnormalities.
Хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ) — клональное миелопролиферативное заболевание, затрагивающее полипотентные клетки-предшественницы миелопоэза, дифференцирующиеся до зрелых форм [1, 2]. История изучения этого заболевания насчитывает более 165 лет. Впервые клинико-гематологическая картина заболевания была описана J.H.Bennett в 1845 г. В 1847 г. R.Virchow для обозначения заболевания впервые использовал термин «лейкемия» [3]. Для его лечения последовательно были апробированы различные методы: раствор мышьяка, рентгенотерапия, химиотерапия бусульфаном и гидрокси-мочевиной, трансплантация костного мозга и терапия альфаинтерферонами [3]. И только в конце XX в. были расшифрованы патогенетические механизмы развития ХМЛ и разработаны патогенетические способы лечения этого заболевания.
Заболеваемость ХМЛ на протяжении последних десятилетий составляет 1,5 случая на 100 000 населения. В целом, количество больных ХМЛ составляет 15% от общего числа больных лейкозами. Болеют преимущественно люди среднего возраста, но чаще болеют лица в возрасте от 30 до 50 лет с соотношением заболевших мужчин и женщин 1,6:1 [4, 5].
ХМЛ отличается медленным нарастанием опухолевой массы. С момента появления опухолевого клона до первых клинических проявлений проходит, как правило, 5-6 лет. Это так называемая пролиферативная, доклиническая стадия. В конце этой стадии в крови у больного случайно может быть обнаружен гиперлейкоцитоз, обусловленный увеличением клеток гранулоцитар-ного ряда. Только при значительном увеличении количества лейкоцитов в крови появляются клинические симптомы заболевания, когда можно говорить о развернутой стадии заболевания [6].
В течение ХМЛ выделяют 3 фазы, отражающие степень прогрессирования заболевания: хроническая фаза, фаза акселерации и бластный криз (терминальная фаза). Каждая фаза, идентифицируемая по клинико-лабораторным признакам, представляет собой этап в развитии лейкозного процесса. Тактика терапии ХМЛ определяется в зависимости от фазы заболевания [4].
Хроническая фаза заболевания на момент постановки диагноза определяется примерно у 80% больных и характеризуется постепенно нарастающим лейкоцитозом от 15-20х109/л в начале заболевания до 500-900х109/л при развернутой клинической картине, менее 15% бластов в периферической крови и костном мозге, менее 30% бластов вместе с промиелоцитами в периферической крови или костном мозге, менее 20% базо-филов в периферической крови, более 100х109/л тромбоцитов. Указанные лабораторные изменения сопровождаются увеличением размера селезенки, которая без лечения достигает громадных размеров. Без лечения больные, как правило, теряют массу тела, появляется анемия и через 1-2 года больной полностью утрачивает трудо-
способность и нередко становится инвалидом. Хроническая фаза без лечения продолжается 2— 2,5 года [4].
Фаза акселерации является более продвинутым этапом развития заболевания. Характеризуется увеличением содержания бластов в периферической крови и костном мозге, превышающим 15%, или более 30% в сумме бластов и промие-лоцитов, более 20% базофилов в крови, тромбо-цитопенией 100х109/л. Фаза акселерации может продолжаться от 2-3 месяцев до 1,5-2 лет [4,7]. У большинства пациентов с ХМЛ без лечения, фаза акселерации через 4-6 месяцев переходит в бластный криз [8].
Терминальная стадия или бластный криз в 80—85% случаев характеризуется нарастанием количества бластных клеток в крови и костном мозге до 30—90%, появлением жалоб на боли в костях, суставах, мышцах, повышением температуры тела, сопровождающимся ознобами и проливными потами. На этом фоне отмечается прогрессирующее увеличение размеров селезенки и печени. Цитогенетически трансформация в бластный криз у 60-80% пациентов с ХМЛ ассоциируется с появлением вторичных хромосомных изменений, наряду с классической Ph-хромосомой. Чаще всего встречаются трисомия по 8 хромосоме (+8), изохромосома 17 (iso(17)), трисомия 19 хромосомы (+19) и дупликация Ph-хромосомы (+der(22)t(9;22)) [9]. В небольшом количестве случаев выявляются такие вторичные хромосомные изменения, как трисомии хромосом 6, 10, 12, 14, 17, 21, моносомии хромосом 7, 17, 18, потеря Y-хромосомы (-Y) у мужчин, транслокация t(3;21)(q26;q22) и инверсия хромосомы 3 (inv(3)(q21q26)) [10]. Иммунофенотипически бластные клетки при бластном кризе ХМЛ характеризуются миелоидным (50%), лимфоидным (20-30%) или недифференцированным (20—25%) фенотипом [3].
В 10% случаев ХМЛ манифестируется фазой акселерации, в 5% — бластным кризом. Окончательный диагноз ХМЛ ставится только на основании данных цитогенетического и/или молекулярно-генетического исследований [6]. Дифференциально-диагностические критерии различных фаз ХМЛ согласно классификациям Европейской организации по изучению и лечению лейкозов (European Leukemia Net, ELN) [11] и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [12] приведены в табл. 1.
ХМЛ — это первое онкологическое заболевание, при котором были описаны специфические изменения хромосом, позволяющие идентифицировать опухолевые лейкозные клетки. В 1961 г. P.S. Nowell и D.A. Hungerford первыми в мире увидели необычно укороченную хромосому 22, которую назвали Филадельфийской (Ph-хромосомой) в честь города Филадельфия, где она была впервые обнаружена [13]. Это было первым доказательством цитогенетической клональ-ности при гемобластозах. Только с введением в
Таблица 1
Фазы хронического миелоидного лейкоза по классификациям Европейской организации по изучению и лечению лейкозов и Всемирной организации здравоохранения
Фаза ХМЛ Классификация ELN Классификация ВОЗ
Хроническая Отсутствие признаков фазы акселерации и бластного криза
Акселерации 15—29% бластных клеток в периферической крови и/или костном мозге; сумма бластов и промиелоцитов > 30% (при этом бластов <30%); количество базофилов в крови > 20%; тромбоцитопения < 100х109/л, не связанная с терапией 15—29% бластных клеток в периферической крови и/или костном мозге; количество базофилов в крови > 20%; персистирующая тромбоцитопения < 100х109/л или тромбоцитоз; > 1000х109/л, не связанные с терапией; увеличение размеров селезенки и лейкоцитов, не связанные с терапией; цитогенетические признаки клональной эволюции.
Бластный криз наличие в периферической крови или в костном мозге > 30% бласт-ных клеток; появление экстрамедуллярных инфильтратов бластных клеток. наличие в периферической крови или в костном мозге > 20% бластных клеток; появление экстрамедуллярной бластной пролиферации; большие очаги или скопления бластов в трепанобиоптате костного мозга.
Примечания: ELN — Европейская организация по изучению и лечению лейкозов, ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения, ХМЛ — хронический миелоидный лейкоз.
цитогенетическую практику дифференциальной окраски хромосом в 1973 г. было сделано важнейшее открытие в исследовании патогенеза ХМЛ: J. Rowley показала, что образование Ph-хромосомы обусловлено не делецией, а реципрокной транслокацией t(9;22)(q34;q11.2) между хромосомами 9 и 22 [14]. Пионерами изучения цитогенетических аномалий при ХМЛ в России были А. В. Захарова, Е. К. Пяткин и Г. Г. Порошенко [15].
В норме на длинном плече хромосомы 9 в регионе 9q34 находится ген ABL (Abelson gene), являющийся протоонкогеном. Он широко распространен в природе, встречается у всех позвоночных и человека, кодирует образование белка с молекулярной массой 145 кД, относящегося к семейству тирозин-киназ, катализирующих процессы фосфорилирова-ния аминокислот. Протяженность гена ABL — 280 килобаз [16].
На участке хромосомы 22 в регионе 22q11.2 расположен ген BCR (breakpoint cluster region), представляющий сегмент ДНК протяженностью 5,8 килобаз. Продуктом экспрессии нормального гена BCR является белок с молекулярной массой 160 кД, который обнаруживается в большинстве тканей [17].
На молекулярном уровне, результатом транслокации t(9;22) является слияние 9q34 участка гена ABL и 22q11.2 фрагмента гена BCR с формированием химерного гена BCR-ABL на перестроенной 22 хромосоме. Изучение молекулярных меха-
низмов транслокации показало, что молекулярная масса кодируемого этим геном аномального белка зависит от локализации точки разрыва в локусе гена BCR. Положение точки разрыва влияет на длину аминокислотной последовательности BCR в составе слитного белка BCR-ABL. Описаны три кластера точек разрыва в этом гене: большой (major-M-BCR), малый (minor-m-BCR) и микро (micro-mu-BCR) [18]. У большинства пациентов с ХМЛ точка разрыва в гене BCR при возникновении транслокации расположена в регионе, соответствующем экзонам 13-14 и обозначается как точка разрыва в большом кластерном регионе (M-BCR). В результате образуется аномальный белок p210. В редких случаях точка разрыва в гене BCR при транслокации расположена в регионе между экзо-нами 1 и 2, и обозначается как минорная точка разрыва (m-BCR), что приводит к образованию другого аномального химерного белка р190 [2, 16, 17].
Химерный ген BCR-ABL и кодируемый им белок играют основную роль в патогенезе ХМЛ, запуская сложный каскад внутриклеточных взаимодействий. Под действием этого белка происходит нарушение функции целого ряда белков-регуляторов различных генов, в том числе семейства Ras и Raf, в результате чего увеличивается пролиферация лейкозных клеток. К накоплению опухолевых клеток при ХМЛ приводит повышенная их чувствительность к ростовым факторам и снижение восприятия клетками проапоптотических сигналов,
нарушение адгезивной способности к компонентам стромы костного мозга. В результате опухолевые клетки получают преимущество в пролифератив-ной активности, что приводит к постепенному расширению опухолевого клона и вытеснению клеток нормального гемопоэза. Снижение адгезивной способности гемопоэтических клеток в костном мозге приводит к выходу в периферическую кровь незрелых клеток и инфильтрации ими внутренних органов, в первую очередь селезенки и печени. Нарушение процессов апоптоза вызывает накопление огромного количества клеток, как в костном мозге, так и в периферической крови [2, 16].
Цитогенетические и молекулярно-цитогенети-ческие исследования костного мозга являются обязательными в клинической практике при постановке диагноза ХМЛ. Стандартное цитогенетическое исследование (СЦИ) — единственный метод, позволяющий анализировать весь хромосомный набор клетки [18,19]. ^-хромосома, формирующаяся в результате реципрокной транслокации ^9;22) ^34^11.2), является специфическим маркером опухолевых клеток и присутствует у всех больных ХМЛ в 90-100% клеток [20, 21, 22].
Приблизительно у 2-5% больных наряду с Р^позитивными клетками имеются и лейкозные клетки с нормальным кариотипом. Крайне редко у небольшого числа пациентов в дебюте заболевания может обнаруживаться всего около 10% Р^ позитивных клеток. Количество их растет медленно, в течение нескольких лет и в итоге достигает 100% [20].
У небольшого количества пациентов с ХМЛ Р^хромосома не обнаруживается цитогенетиче-ским методом, потому что субмикроскопические перестройки формируют «маскированную» Р^ хромосому. В этих редких случаях ген BCR-ABL обнаруживается в виде дополнительного материала на дериватной хромосоме 22 der(22)t(9;22) молеку-лярно-цитогенетическим методом [23].
При установлении диагноза ХМЛ у 5-10% пациентов выявляются вариантные транслокации с участием третьей хромосомы помимо хромосом 9 и 22 [24, 25]. В большинстве случаев вариантная транслокация t ^;9;22) обнаруживается цитогене-тическим методом. При этом дериватная хромосома 9 der(9)t(9;22), участвующая в перестройке с другой хромосомой, встречается у 10-15% пациентов [26, 27]. Чаще всего месторасположение слитного гена BCR-ABL в комплексных хромосомных перестройках обнаруживается на хромосоме 22 (22q11.2), но в редких случаях с вариантной транслокацией перемещение или инсерция слитного гена BCR-ABL происходит в другие регионы помимо 22q11.2. Еще реже слитный ген BCR-ABL может быть расположен в регионе 9q34 [28 ,29].
Стандартное цитогенетическое исследование позволяет разделить вариантные транслокации на две подгруппы: 1) транслокация ^9;22^), где V представлена третьей хромосомой, на которую произошло перемещение слитного гена BCR-ABL; и 2) ^9^) или ^22^). Только в редких случаях хромосомный фрагмент от третьей хромосомы перемещен на дериватную хромосому 22 ^ег(22^
(9; 22), образуя «маскированную» Ph-хромосому. В большинстве случаев вариантных Ph-хромосом сегмент 22q11-qter перемещен на третью хромосому, в то время как часть третьей хромосомы расположена на 9q34. Согласно данным литературы слитный ген BCR-ABL образуется в результате вариантной или сложной транслокации в 2-10% случаев ХМЛ [30]. В настоящее время считается, что вариантная транслокация может затронуть любую хромосому помимо хромосом 9 и 22. Однако самыми восприимчивыми к перестройкам с участием 9q34 и 22q11.2 оказались регионы 1p36, 3p21, 5q31, 6p21, 9q22,10q22, 11q13, 12p13, 17p13, 17q21, 17q25, 19q13, 21q22, 22q12 и 22q13 [24, 25].
За последние годы в литературе появились данные о ранее неописанных случаях ХМЛ с комплексными перестройками с тремя или более хромосомными точками разрыва, которые включают 1p32, 2q11, 3q21 и 6ql2. В одном случае слитный ген BCR-ABL был расположен на дериватной хромосоме 2 (der(2)t(2;9;22)), в то время как в других случаях локализация была на деривате хромосомы 22 (der(22)). Точка разрыва в регионе 6q12 ранее не была описана при ХМЛ, тогда как 1p32 и 2q11 были упомянуты в каталоге хромосомных аберраций, выявляемых при ХМЛ [25].
Вариантные транслокации обычно выявляются на начальном этапе заболевания в хронической фазе, не обнаруживаются как новые цитогенети-ческие отклонения во время течения заболевания и не являются предикторами прогрессии заболевания. Ранее предполагалось наличие одного механизма формирования вариантных транслокаций — одноступенчатой перестройки трех хромосом, сопровождающейся одномоментным разрывом и случайным соединением их ацентрических фрагментов. E. Nacheva c соавторами [31] предположили, что в этом случае классическая транслокация t(9;22)(q34;q11.2) сопровождается дополнительной транслокацией фрагмента третьей хромосомы. Авторы считают, что механизм формирования вариантной транслокации t(V;9;22) может быть прогностически важным: если вариантная транслокация образуется в результате одноэтапной геномной перестройки, то ее появление имеет такой же прогноз, как и появление классической транслокации t(9;22)(q34;q11.2), если в результате двухэтапной перестройки — прогноз течения заболевания может быть таким же, как и при клональной цитоге-нетической эволюции [32,33].
В исследовании М. Gorusu с соавторами [28] продемонстрирован двухэтапный механизм формирования вариантной транслокации t(V;9;22). Во время диагностического цитогенетического исследования авторами была обнаружена вариантная транслокация t(2;9;22). При этом слитный ген BCR-ABL был выявлен метом FISH в 100% интерфазных ядер. При контрольном цитогенетическом исследовании после курса терапии иматинибом было обнаружено присутствие двух клонов клеток: Ph-негативного клона клеток с t(2;22)(q11.2?;q11) и клона клеток с комплексной транслокацией t(2;9;22) со слитным геном BCR-ABL. Очевидно, что в данном случае первичной хромосомной пере-
стройкой была транслокация ^2;22)^11.2?^11) и, вероятно, ген BCR-ABL был перемещен на дери-ватную хромосому 2 ^ег(2)^2;22) с формированием сложной транслокации ^2;9;22). Точка разрыва 2q11 уже была описана в комплексных аберрациях с участием хромосом 9 и 22. Однако две точки разрыва на хромосоме 22 ранее не были описаны в формировании 1;(2;9;22) [31].
Полезным в исследовании механизма формирования вариантных транслокаций при ХМЛ оказался метод D-FISH [34]. Используя эту методику, оказалось возможным выявить оба процесса формирования вариантных транслокаций — одноэтап-ного с 3 точками разрыва (2G2O1F) и двухэтапного процессов с 4 точками разрыва (1G1O2F). Метод D-FISH позволил обнаружить доминирование процесса с 3 точками разрыва [28]. Случаи с двух-этапным процессом и 4 точками разрыва встречаются реже, но регулярно, и их частота составляет 6-21,4% [35]. Как и ожидалось, формирование вариантной транслокации с 4 точками разрыва было обнаружено в случаях, когда помимо клона опухолевых клеток с вариантной транслокацией удается выявить клон клеток с классической транслокацией ^9;22)^34^11), а также при наличии клеток только с вариантной транслокацией. Этот факт предполагает, что механизм с 4 точками разрыва имеет место на начальных стадиях лейкомогене-за как одноэтапный процесс или как вторичная транслокация между der(9)t(9;22) и третьей хромосомой — партнером, — происходящая в той же самой лейкемической стволовой клетке. В данном случае прогноз течения заболевания, вероятно, менее благоприятный, так как появление сложной транслокации вторично можно рассматривать как клональную эволюцию. Эти 2 механизма редки по сравнению с более простым процессом с 3 точками разрыва. В большинстве случаев формирование вариантных транслокаций с 4 точками разрывов выявляется только тогда, когда для изучения механизмов возникновения вариантной транслокации при ХМЛ применяется метод D-FISH [36,37]. В некоторых случаях наблюдались три «горячих» точки разрывов на третьей хромосоме партнере 14q32, 17q25, ^21. Кроме того, были описаны 2 случая ХМЛ, при которых точки разрыва в 5q31 и 10р13 были описаны впервые. Интересно, что эти «горячие» точки разрывов расположены преимущественно в GC-обогащенных регионах генома, в которых имеется высокая плотность расположения структурных генов и А1и-повторов. Локализация этих регионов совпадает также с областями хроматина с высокой активностью транскрипции. Наличие этих элементов может привести к геномной нестабильности в этих локусах хромосом и увеличить процент перестройки хромосомы и ее рекомбинации [24].
Комплексные вариантные транслокации при ХМЛ чаще образуются в результате одноэтапного процесса с 3 точками разрыва в трех хромосомах и последующих нереципрокных обменов с обязательным формированием слитного гена ABL-BCR. С другой стороны, случаи с 4 разрывами также регулярно наблюдаются во время начальной стадии
этого лейкоза. Возможно, что процесс с 4 точками разрыва предрасполагает к делеции хромосомы 9 и является важным прогностическим фактором выживаемости [38, 39].
У 10-15% впервые выявленных больных с ХМЛ стандартное цитогенетическое исследование затруднено в связи с отсутствием в цитогенетических препаратах митотически делящихся клеток костного мозга. Низкий митотический индекс клеток в стернальном пунктате наблюдается у пациентов с выраженным гиперлейкоцитозом. Отсутствие ми-тотически делящихся миелокариоцитов зачастую обусловлено неудачно проведенной пункцией костного мозга со значительным разбавлением пункта-та периферической кровью, что довольно часто бывает при высоком цитозе в периферической крови. Иногда выполнение стандартного цитоге-нетического исследования затруднено из-за плохой морфологии хромосом. Затруднения цитогенети-ческой диагностики ХМЛ могут быть обусловлены случаями так называемой «маскированной» Ph-хромосомы, когда стандартное цитогенетическое исследование не выявляет Ph-хромосомы, а химерный ген BCR-ABL обнаруживается молекулярно-генетическими методами. В этих случаях показано проведение FISH исследование с ДНК зондом к гену BCR-ABL.
Флюоресцентная гибридизация хромосом in situ (Fluorescence In Situ Hybridization — FISH) является более чувствительным и специфичным методом по сравнению со стандартным цитогенетическим исследованием и позволяет выявить даже одну опухолевую клетку среди 200-500 клеток. Метод FISH основывается на реакции гибридизации специфических ДНК-зондов с известными «комплиментарными» участками хромосом по принципу комплиментарного спаривания азотистых оснований ДНК. В качестве ДНК-зондов используют любые клонированные последовательности ДНК, выделенные фрагменты ДНК, целые хромосомы или их участки, отдельные гены и их фрагменты. Перед проведением гибридизации обязательно проводят конъюгацию ДНК-зондов со специфическими молекулами («метками»), которые маркируют данный зонд и позволяют визулизировать его локализацию непосредственно на исследуемых хромосомах (in situ). Первым методом визуализации результатов гибридизации in situ был радиоактивный вариант детекции, впоследствии модифицированный в неизотопный — флюоресцентный [40, 41]. FISH-анализ проводится на цитологических препаратах костного мозга с метафазными хромосомами (HM-FISH) или интерфазными ядрами (IP-FISH) на препаратах ядросодержащих форменных элементов крови.
FISH с ДНК-зондом к гену BCR-ABL — это высоко разрешающий молекулярно-цитогенетический метод исследования с использованием двухцветного ДНК-зонда, который позволяет четко определить локализацию транслоцированных участков хромосом 9 и 22. FISH позволяет определить патологический клон и в случаях фиброза костного мозга у пациентов с ХМЛ, имеющих низкую кле-точность аспиратов [9]. Для D-FISH мониторинга
BCR-ABL-позитивных клеток в процессе лечения ингибиторами тирозинкиназ может использоваться периферическая кровь, однако использование костного мозга все-таки предпочтительнее [15,42].
Для выявления реципрокной транслокации t(9;22)(q34;q11.2), приводящей к образованию химерного гена BCR-ABL, существуют три типа напрямую меченных ДНК-зондов [42]. Первый из них — BCR-ABL Dual Color, Single Fusion (S-FISH) — двухцветный зонд (BCR -зеленый, ABL- красный). Слитный ген BCR-ABL при использовании этого зонда визуализируется наличием одного сливного (желтого) сигнала. Этот ДНК-зонд используется для детекции больших Ph-позитивных клонов, так как погрешность при применении этого зонда (количество ложноположительных сигналов) может достигать 10%. При этом ложноотрицатель-ные сигналы не наблюдаются. В связи с этим двухцветный ДНК-зонд предназначен для диагностики ХМЛ, тогда как для мониторинга небольших клонов является мало эффективным [43].
Второй вид ДНК-зонда — BCR-ABL Extra Signal (ES- FISH) отличается от предыдущего наличием дополнительного сигнала на небольшом участке дериватной хромосомы 9 (der(9)t(9;22)). Клетки без транслокации t(9;22)(q34;q11.2) имеют два сигнала на хромосоме 9 и два сигнала на хромосоме 22, BCR-ABL-позитивные клетки — один сигнал на хромосоме 9, один сигнал на хромосоме 22, один сливной сигнал BCR-ABL-позитивной клетки и дополнительный мелкий сигнал. Наличие этого дополнительного сигнала позволяет минимизировать ошибку, возникающую за счет ложнопо-ложительных сигналов, до 1,5-3%. Этот тип зонда пригоден для мониторинга минимальной остаточной болезни.
Третий вид ДНК-зонда — BCR-ABL Dual Color, Dual Fusion (D-FISH). При использовании этого зонда идентифицируются оба варианта химерного гена: BCR-ABL на хромосоме 22 и ABL-BCR на хромосоме 9, что позволяет минимизировать ошибку при подсчете 600-800 интерфазных ядер до 0,1% [44]. Клетка без транслокации t(9;22)(q34;q11.2), так же как и при использовании S-FISH и ES-FISH ДНК—зондов, имеет два зеленых и два красных сигнала, BCR-ABL-позитивная — один красный, один зеленый и два желтых (сливных) сигнала на хромосомах 22 и 9. Сложные и комплексные перестройки иногда затрудняют трактовку результатов FISH анализа, поскольку возможно атипичное распределение сигналов. В сложных случаях, при необходимости отличить нормальные клетки с наложением сигналов от клеток с истинным слиянием генов BCR-ABL и делецией 9q34 на деривате хромосомы 9, а также для увеличения точности подсчета при анализе минимальной остаточной болезни рекомендуется использование трехцветного зонда (TD-FISH) [42].
Многоцветный FISH (multicolor-FISH) — это технология окрашивания в одной метафазе разных участков хромосом или нескольких пар гомологичных хромосом с помощью так называемых «цель-нохромосомных» ДНК-зондов, меченных разными флюорохромами. Такой подход существенно
расширяет диагностические возможности FISH-анализа в клинических и научных исследованиях [40, 45].
Новые технологии FISH-анализа позволяют окрашивать каждую из 23 пар хромосом в индивидуальный цвет. Число возможных комбинаций из количества флюорохромов (n) определяется по формуле 2n-1. Для идентификации каждой отдельной хромосомы достаточно использовать всего 5 флюорохромов, так как их комбинации друг с другом позволяют получить 31 разную окраску. Наиболее часто используют такие флюорохромы как Cy5, DEAC, FITC, Spectrum Orange, Texas Red. При проведении мультицветной FISH, детекцию каждого флюорохрома осуществляют с помощью соответствующих фильтров, пропускающих УФ излучение строго определенной длины волны. Далее с помощью компьютерных программ производят наложение полученных изображений для каждого отдельного флюорохрома в единое изображение [40, 45].
В ряде исследований было показано, что применение LSI-проб, М-FISH и MCB позволяет всесторонне охарактеризовать комплексные хромосомные перестройки, которые невозможно идентифицировать только цитогенетическим методом [46]. Например, в случаях ХМЛ со сложными ка-риотипами FISH метод позволяет выявить необычную локализацию слитного гена BCR-ABL. Так, в одном из случаев ХМЛ СЦИ выявило нормальную хромосому 9, транслокацию t(21;22) (q22;q11) и потерю der(22)t(21;22) [29]. FISH-анализ показал, что BCR последовательность была перемещена на 9q34 с образованием слитного сигнала BCR-ABL, который не выявлен в виде обычного деривата хромосомы 22 (der(22q11.2) (Ph-хромосомы). В другом случае «маскированная» Ph-хромосома, образованная в результате транслокации хромосом 8 и 10 в дополнение к транслокации t(9;22)(q34;q11.2), слитный ген BCR-ABL располагался на дериватной хромосоме 8 (der(8)) [29]. Слитный ген BCR-ABL транслоцировался на хромосому 8, что повлекло за собой формирование «маскированной» Ph-хромосомы. Обнаружение слитного гена BCR-ABL на 9q34 наблюдали как у Ph-негативных пациентов с нормальным кариотипом, так и у Ph-позитивных пациентов с обычной транслокацией t(9;22) (q34;q11.2) или с необычными транслокациями.
Механизмы формирования таких перестроек не ясны. В одном случае, М. Sessarego с соавторами [29] выдвинули гипотезу о том, что BCR последовательность была встроена в пределах 5'ABL последовательности, формируя типичный слитный ген BCR-ABL. Этот случай требует наличия двух точек разрыва в регионе 22q11; 22q11—>22qter те-ломерный сегмент перемещается на 21q22 и тогда получается, что дериват хромосомы 22 (der(22)) несет центромерный регион, а регион 21q22 те-ломерную последовательность. В результате образование классической Ph-хромосомы становится невозможным. Неясно, являются ли эти перестановки результатом одного или двух последовательных событий. Можно полагать, что произошли два последовательных события. Сначала имела место
вариантная транслокация t(9;22;10)(q34;q11;q22), которая привела к формированию типичной Ph-хромосомы, дериватной хромосомы 9 (der(9)) с дополнительным материалом, перемещенным от хромосомы 10 в регион 9q34 и дериватной хромосомы 10 (der(10) с 22q11—>22qter сегментом, транслоци-рованным в регион 10q22. Другой случай можно рассматривать как реципрокную транслокацию между хромосомой 8 и дериватной хромосомой 22 (der(22)t(9;22;10) с 22q11 центромерной точкой разрыва. Как следствие этого вторичная транслокация и слитный ген BCR-ABL транслоцировался на дериватную хромосому 8 (der(8) в регион 8q22, что и привело к образованию «маскированной» Ph-хромосомы. Цитогенетические, молекулярные и клинические исследования необходимы, чтобы определить реальную частоту таких случаев и их корреляцию с прогнозом заболевания [29].
Комплексные (вариантные) транслокации при ХМЛ сопровождаются делецией в хромосоме 9 (del(9)) чаще, чем в случаях с классической транслокацией t(9;22)(q34;q11.2). Использование FISH-метода привело к неожиданному наблюдению: в образцах клеток костного мозга с классической транслокацией t(9;22)(q34;q11.2) в некоторых случаях слитный сигнал BCR-ABL на хромосоме 22 сопровождался потерей сигналов, маркирующих дериватную хромосому 9 (der(9)) [47]. Присутствие делеции было подтверждено анализом микросате-литных локусов методом ПЦР с применением ло-кус-специфичных праймеров к смежным с транслокацией точкам разрыва в последовательностях хромосом 9 и 22. Хотя небольшие делеции (приблизительно 10 КБ) хромосомы 22 рядом с транслокационной точкой разрыва были продемонстрированы ранее, данные FISH-метода предположили существование значительных делеций, захватывающих по крайней мере несколько сотен килобаз [42,45]. Р. Sinclair и соавторы [42] первыми отметили, что делеция хромосомы 9 (del(9)) ассоцииро-ванна с плохой выживаемостью у пациентов с ХМЛ и встречается приблизительно в 15% случаев ХМЛ [20, 47].
Существует, по крайне мере, несколько доказательств, демонстрирующих, что делеция хромосомы 9 (del(9)) возникает во время транслокации t(9;22)(q34;q11.2).
Во-первых, в группах пациентов с различными фазами ХМЛ обнаружена одинаковая частота де-леции хромосомы 9 (del(9)). Также в ряде работ были последовательно проанализированы образцы клеток костного мозга при первичной диагностике заболевания и образцы костного мозга, которые были взяты на фоне прогрессии ХМЛ. В результате анализа большого количества метафаз ни у одного из пациентов не обнаружена приобретенная делеция хромосомы 9 (del(9)) [48].
Во-вторых, делеция хромосомы 9 (del(9)) обычно в 3 раза чаще встречается у пациентов с вариантными транслокациями по сравнению с пациентами, у которых обнаружена классическая транслокация t(9;22)(q34;q11.2) [39, 48]. Большинство исследований подтвердило относительную высокую частоту делеций del(9) у пациентов с вариантными транс-
локациями и продемонстрировало потерю участка третьей хромосомы у пациентов с делецией del(9) и/или 22 хромосомы [49].
В-третьих, если бы делеция хромосомы 9 произошла во время прогрессии заболевания, то была бы большая вероятность идентифицировать клетки, содержащие t(9;22)(q34;q11.2), но никак не де-лецию хромосомы 9. Однако у пациентов с деле-цией было проанализировано большое количество метафаз и сообщалось, что каждая метафаза содержала и транслокацию t(9;22)(q34;q11.2) и дериватную хромосому 9 (der (9)) [50].
Взятые вместе эти данные свидетельствуют, что у некоторых пациентов рекомбинация хромосом при формировании реципрокной транслокации обусловливает возникновение больших геномных делеций. Так как транслокация t(9;22)(q34;q11.2) безусловно инициируется в хроническую фазу ХМЛ, эти данные указывают на существование ранее неизвестной генетической гетерогенности пациентов с ХМЛ, у которых с самого начала их болезни наблюдается потенциальная предрасположенность к появлению и других опухолей, возникновение которых может быть связано с возникновением сбалансированных транслокаций и/или слитных генов [51].
Существует мнение, что вариантные или классические транслокации с делецией хромосомы 9 (del(9)) обладают неблагопритным прогностическим значением и снижают выживаемость больных ХМЛ по сравнению с пациентами, имеющими транслокацию без делеции в хромосоме 9. Так В. Huntly с соавторами считают, что плохой прогноз при делеции del(9) вызван не самой делецией, а, в основном, предрасположенностью к накоплению дополнительных генетических аберраций, которую отражает наличие делеции del(9). Тот факт, что делеции образуются только в определенной подгруппе пациентов, показывает генетическую гетерогенность у данных пациентов с ХМЛ [51].
Несмотря на существующие разногласия о прогностическом влиянии делеции хромосомы 9 (del(9)) потеря одного или более генов важна в развитии заболевания. И это наиболее вероятный механизм, объясняющий плохой прогноз при обнаружении делеции дериватной хромосомы 9 (del(9)). Предполагается, что у пациентов с ХМЛ без делеции хромосомы 9 (del(9)) бластный криз развивается после достаточного для этого накопления дополнительных хромосомных и генных мутаций. У пациентов с делецией главным в этом процессе является потеря критического гена или генов (генов, регулирующих экспрессию ABL-BCR, BCR-ABL и/или генов супрессии опухоли) во время транслокации t(9;22)(q34;q11.2) [51]. Молекулярное повреждение при делеции связано с активацией BCR-ABL онкогена, который ускоряет образование геномной нестабильности у пациентах с del(9) и приводит к быстрому прогрессированию заболевания в бласт-ный криз [52, 53].
Биологическое значение делеции del(9) обусловлено гаплонедостаточностью или последствием воздействия одного или более оставшихся нормальных аллелей [48]. Делеции в хромосоме
9 вблизи транслокационных точек разрыва могут иметь большие размеры до 8 МБ и до 17 МБ в хромосоме 22 [44, 50]. Каждая из этих областей содержит не менее 300 генов. Хромосома 9 и хромосома 22 содержат в себе гены кодирующие факторы и ко-факторы транскрипции (PBX3, LMX1B), компоненты сигналов трансдукции сигналов (се-рин-треонин фосфатазу PP2A, Ras ингибитор INF, домен протеин киназы LIM-K2, рецептор общей ß-цепи GM-CSF/IL-3/IL-5) [48].
В связи с этим, D. H. Kim и соавторы [54] сделали вывод, что наличие делеции der(9) у пациентов с ХМЛ снижает вероятность достижения гематологического, цитогенетического и молекулярного ответов (полного гематологического ответа, полного цитогенетического ответа, полного молекулярного ответа) на терапию иматинибом, что приводит к быстрой прогрессии заболевания в фазу акселерации и/или бластный криз [54]. По данным других авторов, неблагоприятная значимость делеции длинного плеча хромосомы 9 (del(9)) на течение ХМЛ не подтверждается [11].
Метод FISH-анализа с ДНК-зондом к гену BCR-ABL позволяет охарактеризовать более точно динамику BCR-ABL позитивного опухолевого клона при наличии дополнительных хромосомных аберраций. Например, сообщалось о случае ХМЛ с классической Ph-хромосомой и редкой дополнительной хромосомной аберрацией — транслокацией t(3;8)(p22;q22) [55]. Поломка в длинном плече хромосомы 3 в случаях клональной эволюции ХМЛ уже была описана, также как и то, что область 3p22 является партнером хромосомных перестроек, однако, главным образом, в солидных опухолях. Перестройки с вовлечением длинного плеча хромосомы 8 (8q22) встречаются при остром миелоидном лейкозе и миелодиспластическом синдроме [55]. В этом случае можно было бы предположить неблагоприятное прогностическое значение выявленной дополнительной хромосомной аберрации. Однако, в описанном случае мониторинг BCR-ABL позитивного клона клеток на фоне терапии иматини-бом был выполнен методом интерфазного FISH и показал большой цитогенетический ответ через 6 месяцев терапии иматинибом. Основываясь на результатах FISH-анализа, было сделано заключение, что пациенты с Ph-хромосомой и транслокацией t(3;8) хорошо отвечают на терапию иматини-бом [55].
Недостаток метода D-FISH для мониторинга Ph-позитивных клеток в процессе терапии ингибиторами тирозинкиназ проявляется в том, что при его использовании не выявляются дополнительные хромосомные аберрации, которые являются факторами неблагоприятного прогноза и своего рода «маркерами» перехода заболевания в фазу акселерации или бластный криз. Поэтому большое клиническое значение для мониторинга терапии ХМЛ имеет стандартное цитогенетическое исследование
[42].
Задачами терапии ХМЛ является эрадикация стволовых лейкозных клеток и восстановление нормальной кроветворной функции костного мозга. Очень важным вопросом таргетной терапии
является адекватный мониторинг терапии ХМЛ. Эффективность терапии оценивается на основании достижения гематологического, цитогенетического и молекулярного ответов в сроки, рекомендованные ELN [11].
Гематологический ответ на терапию ХМЛ может быть полным или частичным. Полный гематологический ответ определяется при отсутствии симптомов интоксикации и очагов экстрамедуллярного кроветворения, сокращения селезенки до нормальных размеров, уменьшением числа тромбоцитов до 450х109/л, лейкоцитов — до 10х109/л, базофилов — до 5% и менее, отсутствии в формуле крови мие-лоцитов и промиелоцитов. Ответ считается полученным, если он сохраняется не менее 4 недель. Частичным гематологический ответ считается, если уровень лейкоцитов более 9х109/л, но менее 20х109/л при наличии единичных миелоцитов и метамиелоцитов (в сумме не более 5%), персисти-рующей спленомегалии. Отсутствие гематологического ответа констатируют при увеличении уровня лейкоцитов до 20х109/л и выше, появлении в формуле промиелоцитов или более 5% миелоцитов и метамиелоцитов, тромбоцитоза более 500х109/л. Гематологический мониторинг проводится каждые 2 недели до достижения и подтверждения полного гематологического ответа, затем каждые 3 месяца [11, 56].
В настоящее время цитогенетический ответ является стандартом оценки минимальной остаточной болезни при ХМЛ и определяется стандартным цитогенетическим методом по содержанию Р^положительных клеток в пунктате костного мозга [11,56]. Выделяют следующие уровни цитогенетического ответа: полный цитогенетический ответ, при котором в костном мозге выявляется 0% Р^позитивных клеток, частичный цитогенетический ответ — от 1 до 35% Р^позитивных клеток, большой цитогенетический ответ определяется как сумма полного цитогенетического ответа и частичного цитогенетического ответа — от 0 до 35% Р^позитивных клеток, малый цитогенетический ответ — от 36 до 65% Р^позитивных клеток; минимальный цитогенетический ответ — от 66 до 95% Р^позитивных клеток и отсутствие цитогенетического ответа — более 95% Р^ позитивных клеток. Мониторинг контроля цито-генетического ответа проводят каждые 6 месяцев до достижения полного цитогенетического ответа [11, 56]. В 2013г. М. Вассагаш с соавторами [11] опубликовали новые рекомендации ELN, согласно которым цитогенетический мониторинг также необходимо проводить через 3 месяца после начала терапии иматинибом. Впервые в этих рекомендациях дано определение оптимального ответа на терапию иматинибом, которым считается достижение полного гематологического ответа и малого цитогенетического ответа (Р^позитивных клеток до 65%) через 3 месяца терапии, частичного цитогенетического ответа (Р^позитивных клеток до 35%) на 6 месяце терапии, полного цитогенетического ответа (0% Р^позитивных клеток) на 12 месяце терапии и большого молекулярного ответа на 18 месяце терапии. Ответ на
терапию ХМЛ считается субоптимальным, если на 3 месяце терапии нет цитогенетического ответа (Ph-позитивных клеток более 95%), на 6 месяце терапии — более чем частичный цитогенетиче-ский ответ (Ph-позитивных клеток более 35%), на 12 месяце терапии — частичный цитогенетический ответ (Ph-позитивных клеток от 1% до 35%); на 18 месяце терапии — экспрессия гена BCR-ABL больше, чем при большом молекулярном ответе. Неудачей в терапии считается, если на 3 месяце терапии нет полного гематологического ответа, на 6 месяце терапии нет цитогенетического ответа (Ph+ более 95%), на 12 месяце терапии обнаруживается более чем частичный цитогенетический ответ (Ph-
позитивных клеток более 35%), на 18 месяце терапии — более чем полный цитогенетический ответ (табл. 2).
По данным М. Вассагаш с соавторами [11], если после 3 месяцев терапии иматинибом у пациентов с ХМЛ не достигнут полный гематологический ответ, то вероятность получения полного цитогене-тического ответа у таких пациентов незначительная, а пятилетния общая выживаемость составляет 60%, выживаемость без прогрессии — 56%. Если к 6 месяцу терапии иматинибом у пациентов нет ци-тогенетического ответа, вероятность достижения полного цитогенетического ответа в дальнейшем составляет 25%.
Таблица 2.
Рекомендации Европейской организации по изучению и лечению лейкозов 2013 ответа на терапию первой линии пациентов с хроническим миелоидным лейкозом
Характеристика ответа
Продолжительность терапии Целевой уровень ответа Предостережение Неудача
до лечения гематологическая резистентность к иматинибу; ДХА в Ph+
3 мес. Ph+ <35(ЧЦО) BCR-ABL <10% Ph+ 36-95% (минЦО) BCR-ABL >10% Нет ПГО Ph+ >95%
6 мес. Ph+ 0% (ПЦО) BCR-ABL <1% Ph+ 1-35% (МЦО) BCR-ABL >10% Ph+ 35% BCR-ABL >10%
12 мес. BCR-ABL <0,1% (БМО) BCR-ABL 0,1-1% Ph+ >0% BCR-ABL >1% новые мутации
Примечание: ДХА — дополнительные хромосомные абберации; ЧЦО — частичный цитогенетический ответ; минЦО — минимальный цитогенетический ответ; ПГО — полный гематологический ответ; ПЦО — полный цитогенетический ответ; МЦО — малый цитогенетический ответ; БМО — большой молекулярный ответ.
Молекулярный мониторинг терапии ХМЛ ингибиторами тирозинкиназ — это анализ уровня экспрессии гена BCR-ABL, определяемого в соответствии с международной шкалой как отношение уровня экспрессии гена BCR-ABL к уровню экспрессии контрольного гена, умноженное на 100%. Молекулярный ответ оценивается на основании определения количества BCR-ABL-транскрипта в крови с помощью метода количественной поли-меразной реакции в реальном времени (real-time PCR, RQ-PCR). Чувствительность метода составляет 1:1000-1:100000 клеток. Преимуществом данного метода является возможность исследования периферической крови. Молекулярный мониторинг наиболее целесообразен для оценки минимальной остаточной болезни у больных с полным цитогенетическим ответом [57].
Большой молекулярный ответ — это экспрессия гена BCR-ABL на уровне менее 0,1% в соот-
ветствии с международной шкалой или снижение уровня BCR-ABL транскрипта на 3 log и более по сравнению со стандартизированным уровнем экспрессии BCR-ABL- транскрипта до начала терапии. Полным молекулярный ответ считается, если BCR-ABL-транскрипт не удается обнаружить. Негативные результаты подтверждаются с помощью качественной реакции ПЦР, чувствительность которой выше, чем у RQ-PCR. Молекулярный мониторинг терапии ХМЛ проводится каждые 3 месяца
[11, 58]
Особого внимания требуют больные с высоким риском прогрессирования ХМЛ: с дополнительными хромосомными аномалиями в Ph-позитивных и Ph-негативных клетках, с повышением уровня BCR-ABL- транскрипта более чем на 1 log в повторных анализах. Для данных пациентов с ХМЛ стандартные дозы иматиниба могут оказаться не лучшим вариантом терапии [11].
В результате многолетнего разностороннего изучения патогенеза ХМЛ стало очевидным, что обусловленная транслокацией ^9;22)^34^11.2) активация ABL-тирозинкиназы является пусковым механизмом развития заболевания. Данные литературы свидетельствуют о том, что препараты, обладающие антитирозинкиназной активностью для лечения ХМЛ, направлены, главным образом, на патогенетические звенья процесса заболевания [59]. Одним из путей воздействия на опухолевый процесс заболевания является блокада доступа фермента тирозинкиназы к АТФ и предотвращение фосфорилирования субстратов. Это обеспечивает остановку пролиферации и индукции
апоптоза в клетках, экспрессирующих BCR-ABL-тирозинкиназу [16].
Получение цитогенетической ремиссии является целью первоначальной терапии больных ХМЛ. Наличие даже небольшого остаточного количества Р^позитивных клеток может быть основой для развития рецидива. Понятие эффективности включает в себя как качество цитогенетического ответа на лечение, так и безопасность препарата. В настоящее время иматиниб является стандартом терапии для всех пациентов с ХМЛ независимо от возраста и фазы заболевания. Однако важно учитывать, что тактика терапии пациента различается в зависимости от фазы ХМЛ и ответа на лечение.
ЛИТЕРАТУРА
1. Воробьев А.И. Руководство по гематологии /А.И. Воробьев. -М.: Ньюдиамед, 2003. - Вып.3, Т.1. - С.343.
2. Deininger M.W. The molecular biology of chronic myeloid leukemia / M.W. Deininger, J.M. Goldman, J.V. Melo // Blood. -2000. - Vol. 96(10). - P.3343-3356.
3. Волкова М.А. Хронический миелолейкоз: вчера, сегодня, завтра / М.А. Волкова // Клиническая онкогематология. -2010. - Т.3, № 4. - С. 317 -326.
4. Абдулкадыров К.М. Федеральные клинические рекомендации по диагностике и терапии хронического миелолейкоза / К.М. Абдулкадыров, А.О. Абдуллаев, Л.Б.Авдеева // Вестник гематологии. - 2013. - T.IX, №3. - С.4-40.
5. Jemal A. Cancer statistics, 2010/ Jemal A., Siegel R., Xu J. et al. // CA: A Cancer Journal for Clinicians.- 2010. - Vol.60. - P.277-300.
6. Моисеев С.И. Хронические миелопролиферативные заболевания. Классификация, диагностика и лечение / С.И. Моисеев, А.Ю. Зарицкий, Г.Н. Салогуб // Пособие для интернов, клинических ординаторов и врачей. - 2005. - С.10-19.
7. Антипова Л.А. Долгосрочные результаты применения има-тиниба в лечении больных хроническим миелолейкозом в фазе акселерации / Л.А. Антипова, С.С. Лория, С.В. Семоч-кин, А.Г.Румянцев // Онкогематология. - 2009. - Т.1. - С.1-6.
8. Cortes J.E. Staging of chronic myeloid leukemia in the imatinib era: an evaluation of the World Health Organization proposal / J.E. Cortes, M. Talpaz, S. O'Brien et al. // Cancer. - 2006. -Vol.106. - P.1306-1315.
9. Kantarjin H. Chronic Myeloid Leukaemia / H. Kantarjin, J.Cortes et al. // Abeloffs Clinical Oncology. - 2014. - Vol.101. -P.1944-1957.
10. Karrman K. Cytogenetic evolution patterns in CML post-SCT / K. Karrman, B. Sallerfors, S. Lenhoff et al. // Bone Marrow Transplantation. - 2007. - Vol.39. - P.165-171.
11. Baccarani M. European LeukemiaNet recommendations management of Chronic Myeloid Leukemia / Baccarani M., Deininger M., Rosti G. et al. // Blood. - 2013. -Vol.122. - P.872-884.
12. Swerdlow S.H., World Health Organization of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues / S. H. Swerdlow, E. Campo, N. L. Harrris et al. — Lyon: IARC Press: 2008.
13. Nowell P.C. A minute chromosome in human chronic granulocytes leukaemia / P.C. Nowell, D. A. Hungerford // Science. - 1960. - Vol.132. - P.1497-1501.
14. Rowley J.D. Letter: a new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukaemia indentified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining / J.D. Rowley // Nature. - 1973. -Vol.243. - P.290-293.
15. Домрачева Е.В. Прогностическое значение дополнительных цитогенетических аномалий при хроническом миелолейко-зе / Е.В. Домрачева, А.В. Захарова, Е.А. Асеева // Гематология и трансфузиология. - 2005. - Т. 50, № 4. - С.37-42.
16. Tefferi A. Oncogenes in myeloproliferative disorders / A. Tefferi, D.G. Gilliland // Cell Cycle. - 2007. - Vol.6. - P.550-566.
17. Tefferi A. Chronic myeloid leukemia: current application of cytogenetics and molecular testing for diagnosis and treatment / A. Tefferi, G.W. Dewald, M.L. Litzow et al. // Mayo Clinic Proc. -2005. - Vol.80. - P.390-402.
18. Melo J.V. BCR-ABL gene variants / J.V. Melo // Baillieres Clin Haematol. - 1997. - Vol.10. - P.203-222.
19. Shaffer L.C. ISCN (2009): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature / M. Slovac, L. Cambell, S. Karger // Basel. - 2009. - 140P.
20. Домрачева Е.В. Роль цитогенетических исследований при лечении хронического миелолейкоза ингибиторами ти-розинкиназ / Е.В. Домрачева, Е.А. Асеева // Гематология и трансфузиология - 2007. - Т.52, № 2. - С.25-28.
21. Lim T.H. The incidence and patterns ofBCR/ABL rearrangements in chronic myeloid leukemia (CML) using fluorescence in situ hybridization (FISH) / T.H. Lim, S.L. Tien, P. Lim et al. // Ann Acad Med Singapore. - 2005. - Vol.34. - P.533-538.
22. Melo J.V. Chronic myeloid leukaemia as a model of disease evolution in human cancer / J.V. Melo, D.J. Barnes // Nat Rev Cancer. - 2007. - Vol.7. - P.441-453.
23. Zagaria A. Molecular cytogenetic characterization of deletions on der(9) in chronic myelocytic leukemia / A. Zagaria, L. Anelli, F. Albano et al. // Cancer Genet Cytogenet. - 2006. - Vol.167. -P.97-102.
24. Fisher A.M. Breakpoints of variant 9;22 translocations in chronic myeloid leukemia locate preferentially in the CG-richest region of the genome / A.M. Fisher, P. Strike, C. Scott et al. // Genes Chromosome Cancer. - 2005. - Vol.43. - P.383-389.
25. Johansson B. Cytogenetic and molecular genetic evolution of chronic myeloid leukemia / B. Johansson, T. Fioretos, F. Mitelman // Acta Haematol. - 2002. - Vol.107. - P.76-94.
26. Cianciulli A.M. Complex variant Philadelphia translocation involving the short arm of chromosome 9 in a case of chronic myeloid leukemia / A.M. Cianciulli, R. Marzano, R. Merola et al. // Haematologica. - 2004. - Vol.89. - P.127-128.
27. Valencia A. Complex Variant t(9;22) Chromosome Translocations in Five Cases of Chronic Myeloid Leukemia / A. Valencia, J. Cervera, E. Such et al. // Advances in Hematology. -2009. - Vol.2009. - P. 1-4.
28. Gorusu M. On the genesis and prognosis ofvariant translocations in chronic myeloid leukemia / M. Gorusu, P. Benn, Z. Li et al. // Cancer Genet Cytogenet. - 2007. - Vol.173. - P.97-106.
29. Sessarego M. Complex chromosome rearrangements may locate the bcr/abl fusion gene sites other than 22q11 / M. Sessarego, G. Fugazza, R. Bruzzone et al. // Haematologica. - 2000. - Vol.85. -P.35-39.
30. Markovic V.D. Lack of BCR/ABL reciprocal fusion in variant Philadelphia chromosome translocations: a use of double
fusion signal FISH and spectral karyotyping / V.D. Markovic, D. Bouman, J. Bayani et al. // Leukemia. - 2000. - Vol.14. - P.1157-1160.
31. Nacheva E. Philadelphia-negative chronic myeloid leukemia: detection by FISH of BCR-ABL fusion gene localized either to chromosome 9 or chromosome 22 / E. Nacheva, T. Holloway, K. Brown et al. // Br J Haematol. - 1994. - Vol.87. - P.409-412.
32. Albano F. The double decent generated by an insertion mechanism in chronic myeloid leukemia with t(9;9;22) / F. Albano, A. Zagaria, L. Anelli et al. // Ann Hematol. - 2008. -Vol.87. - P.923-926.
33. Reid A.G. Survival implications of molecular heterogeneity in variant Philadelphia-positive chronic myeloid leukemia / A.G. Reid, B.J. Huntly, C. Grace et al. // Br J Haematol. - 2003. -Vol.121. - P.419-427.
34. Albano F.»Homebrew» FISH assay shows higher efficiency than BCR-ABL dual color, dual fusion probe in detecting micro deletions and complex rearrangements associated with t(9;22) in chronic myeloid leukemia / F. Albano, L. Anelli, A. Zagaria et al. // Cancer Genet Cytogenet. - 2007. - Vol. 174. -P.121-126.
35. Aoun P. Interphase fluorescence in situ hybridization studies for the detection of 9q34 deletions in chronic myelogenous leukemia: a practical approach to clinical diagnosis / P. Aoun, M. Wiggins, D. Pickering et al. // Cancer Genet Cytogenet. - 2004. -Vol.154. - P.138-143.
36. De Melo V.A. Deletions adjacent to BCR and ABL I breakpoints occur in a substantial minority of chronic myeloid leukemia patients with masked Philadelphia rearrangements / V.A. De Melo, D. Milojkovic, D. Marin et al. // Cancer Genet Cytogenet. -2008. - Vol.182. - P.111-115.
37. Michalova K. Location of the BCR/ABL fusion genes on both chromosomes 9q34 in Ph negative chronic myeloid leukemia / K. Michalova, Z. Zemanova, J. Brezinova et al. // Leuk Lymphoma. -2002. - Vol.43. - P.1695-1700.
38. Albano F. Non random distribution of genomic features in breakpoint regions involved in chronic myeloid leukemia cases with variant t(9;22) or additional chromosomal rearrangements / F. Albano, L. Anelli, A. Zagaria et al. // Molecular Cancer. -2010. - Vol.9. - P.1-17.
39. Kolomietz E. Primary chromosomal rearrangements of leukemia are frequently accompanied by extensive submicroscopic deletions and may lead to altered prognosis / E. Kolomietz, J. Al-Maghrabi, S. Brennan et al. // Blood. - 2001. - Vol.97. - P.3581-3588.
40. Назаренко С.А. Цитогенетика человека и хромосомные болезни / С.А. Назаренко, Ю.С. Яковлева // Молекулярно-био-логические технологии в медицинской практике. - 2005. -Т.7. - С.42-54.
41. Vorsanova S.G. Human interphase chromosome: a review of available molecular cytogenetic technologies / S.G. Vorsanova, Y.B. Yurov, I.Y. Yurov // Molecular Cytogenetics. - 2010. - Vol.3. -P.1-15.
42. Landstrom A. Fluorescent in situ hybridization in the diagnosis, prognosis, and treatment monitoring of chronic myeloid leukemia / A. Landstrom, A. Tefferi // Leukemia & Lymphoma. -2006. - Vol.47. - P.397-402.
43. Siu L. Application of tri-color, dual fusion fluorescence in situ hybridization (FISH) system for the characterization of BCR-ABL fusion in chronic myelogenous leukemia (CML) and residual disease monitoring / L. Siu, E. Ma, W. Wong et al. // BMS Blood Disorders. - 2009. - Vol.9, №4. - P.1-6.
44. Sinclair P.B. Large deletions at the t(9;22) breakpoint are common and may identify a poor-prognosis subgroub of patients with chronic myeloid leukemia / P.B. Sinclair, E.P. Nacheva, M. Leversha et al. // Blood. - 2001. - Vol.98. - P.2879-2880.
45. Liehr T. Multicolor FISH probe sets and their applications / T. Liehr, H. Starke, A. Weise et al. // Histology and Histopathology. -
2004. - Vol.19. - P.229-237.
46. Lundan T. Allogeneic stem cell transplantation reverses the poor prognosis of CML patients with deletions in derivative chromosome 9 / T. Lundan, L. Volin, T. Ruutu et al. // Leukemia. -
2005. - Vol.19. - P.138-140.
47. Yoong Y. Clinical correlates of submicroscopic deletions involving the ABL-BCR translocation region in chronic myeloid leukemia / Y. Yoong, T.J. Van DeWalker, R.O. Carlson et al. // European Journal Of Haematology.- 2005. - Vol.74. - P.124-127.
48. Huntly B.J.P. Deletions of the derivative chromosome 9 occur at the time of the Philadelphia translocation and provide a powerful and independent prognostic indicator in chronic myeloid leukemia / B.J.P. Huntly, A.G. Reid, A.J. Bench et al.// Blood. - 2001. - Vol.98. - P.1732-1738.
49. Albano F. Anovel translocation t(14;15)(q32;q24) bearing deletion on der(14) in Philadelphia-positive chronic myeloid leukemia/ F. Albano, G. Specchia, L. Anelli et al. // Haematologica. -2003. - Vol.88. - P.1076-1077.
50. Storlazzi C.T. Breakpoint characterization of der(9) deletions in CML patients / C.T. Storlazzi, G. Specchia, L. Anelli et al. // Genes Chromosomes Cancer. - 2002. - Vol.35. - P.271-276.
51. Huntly B.J.P. Double jeopardy from a single translocation: deletions of the derivative chromosome 9 in chronic myeloid leukemia / B.J.P. Huntly, A.J. Bench, A.R. Green // Blood. - 2003. - vol.102. - P.1160-1168.
52. Nowicki M.O. BCR/ABL oncogenic kinase promotes unfaithful repair of the reactive oxygen species-dependent DNA doublestrand breaks / M.O. Nowicki, R. Falinski, M. Koptyra et al. // Blood. - 2004. - vol.104. - P.3746-3753.
53. Penserga E.T. Fusion tyrosine kinases: a result and cause of genomic instability / E.T. Penserga, T. Skorski // Oncogene. -
2007. - vol.26. - P. 11-20.
54. Kim D.H. No significance of derivative chromosome 9 deletion on the clearance kinetics of BCR/ABL fusion transcripts, cytogenetic or molecular response, loss of response, or treatment failure to imatinib mesylate therapy for chronic myeloid leukaemia / D.M. Kim, G. Popradi, L. Srihasha et al. // Cancer. -
2008. - vol.113. - P.772-781.
55. Mkrtchyan H. Novel complex t(V;9;22) rearrangements in three cases with chronic myeloid leukemia and a rare translocation in a case with classical Philadelphia chromosome / H. Mkrtchyan, S. Ghazaryan, G. Avetisyan et al. //Oncology Reports. - 2008. -vol.20. - P.99-104.
56. Туркина А.Г. Протокол диагностики и терапии хронического миелолейкоза ХМЛ-2011 / А.Г. Туркина, Е.Ю. Челышева, Г.А. Гусарова и др. // Программное лечение заболеваний системы крови. - 2012.- Т.2. - С.21-65.
57. Hughes T. Monitoring disease response to tyrosine kinase inhibitor therapy in CML / T. Hughes, S. Branford // Hematology. -
2009. - Vol. - P.477-487.
58. Druker B.J. Circumventing Resistance to Kinase-Inhibitor Therapy / B.J. Druker // New England Journal Of Medicine -
2006. - Vol.354. - P.2594-2596.
59. Deininger M.W. Milestones and monitoring in patients with CML treated with imatinib / M.W. Deininger // Hematology. -2008. - Vol. - P.419-426.
ПОСТУПИЛА: 29.01.2016
