CC BY
300
■ М!Ш,Ш.ЦЯИ
Молекулярная диагностика паразитарных болезней
Е. Н. Морозов, НИИ медицинской паразитологии и тропической медицины
К. Ю. Кузнецова им. Е.И. Марциновского ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный
медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России
Рассмотрены результаты и перспективы использования современных методов молекулярной диагностики паразитарных болезней. Описаны возможности использования полимеразной цепной реакции для диагностики протозойных болезней и дирофиляриоза.
Ключевые слова:
диагностика, паразитарные болезни, полимеразная цепная реакция
Molecular diagnosis of parasitic diseases
E.N. Morozov, K.Yu. Kuznetsova
E.I. Martsinovsky Institute of Medical Parasitology and Tropical Medicine, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University
Results and perspectives of molecular diagnosis of parasitic diseases are discussed. Application of PCR for diagnostic purposes of protozoan infections and dirofilariasis is presented.
Key words:
diagnostics,
parasitic
diseases,
polymerase chain reaction
В последнее время в России отмечается все большее число паразитарных болезней, «завезенных» из эндемичных стран [1, 2]. Ситуация еще более ухудшается из-за роста оппортунистических протозойных инфекций (токсоплазмоза, криптоспоридиоза, пневмоцистоза и др.), обусловленного ослабленным иммунным статусом населения вследствие широкого распространения ВИЧ-инфекции и неблагоприятных экологических условий [9, 10].
В связи с этим существует необходимость в современных высокочувствительных методах мониторинга за паразитарными заболеваниями (лабораторная диагностика паразитозов, мониторинг за лекарственной устойчивостью возбудителей, контроль эффективности лечения, поиск внутривидовых различий паразитов и др.) [7, 8]. В настоящее время диагностика паразитарных болезней часто основывается на выявлении простейших микроскопическими методами. Иногда прибегают к культивированию на специальных средах или путем пассажей на лабо-
36
раторных животных (биологическая проба). В последние годы расширился спектр иммунологических методов диагностики паразитозов. В зависимости от локализации возбудителя материалом для исследования могут быть кровь, мокрота, испражнения, образцы тканей (биопта-ты), спинномозговая жидкость и др. При некоторых паразитарных болезнях используют метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) для идентификации ДНК паразита в биологических материалах.
Внедрение метода ПЦР в широкую практику стало одним из наиболее важных событий в биологии и медицине в последнее десятилетие. Метод ПЦР поднимает диагностику на принципиально иной уровень - уровень определения специфических нуклеиновых кислот - ДНК или РНК, что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации. С помощью ПЦР одна молекула искомой ДНК может быть обнаружена в присутствии миллионов других молекул ДНК в исследуемом материале.
ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ: новости, мнения, обучение №1 2014
Е.Н. Морозов, К.Ю. Кузнецова МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ БОЛЕЗНЕЙ
ПЦР в настоящее время является одним из наиболее важных диагностических инструментов исследования геномов возбудителей инфекционных и паразитарных болезней. По сравнению с традиционными методами диагностики ПЦР обладает более высокой чувствительностью, специфичностью и позволяет проводить прямое определение микроорганизма непосредственно в клиническом материале без получения чистой культуры возбудителя, что снижает трудозатраты. Такой подход наиболее информативен при диагностике внутриклеточных паразитов (малярия, лейшманиозы, токсоплазмозы и др.).
Различные варианты оборудования для ПЦР позволяют работать как в условиях полной автоматизации процесса, так и при чередовании ручных и автоматизированных этапов, что делает ПЦР доступной не только научным учреждениям и крупным медицинским центрам, но и более мелким клиническим лабораториям.
Идея открытия метода принадлежит К. Б. Мюллису, сотруднику корпорации «Цетус». В 1983 г. он разработал метод, благодаря которому in vitro можно получать копии изучаемых генов в неограниченном количестве. Этот метод, основанный на амплификации искомого участка ДНК, он и назвал полимеразной цепной реакцией. И в скором времени он стал одним из наиболее совершенных среди других методов молекулярно-биологических исследований.
Методы молекулярной паразитологии имеют наибольшие возможности в случае с трансмиссивными паразито-зами: малярией, лейшманиозами и дирофиляриозом. Это связано с тем, что ПЦР может использоваться не только как диагностический инструмент, но и для поиска генетических различий между штаммами (в случае малярии), видами (лейшманиозы), а также для обнаружения паразитов в переносчике (дирофиляриозы). В ряде исследований ПЦР используется как предварительный метод перед применением прямого секвенирования или других молекулярно-генетических методов.
Наиболее перспективной модификацией метода ПЦР является постановка ПЦР в реальном времени. Данная методика лишена основного недостатка ПЦР-диагностики -возможности контаминации лаборатории, оборудования и реагентов продуктами реакции. Это стало возможно, поскольку при применении этого метода нет необходимости открывать пробирку с продуктом ПЦР. Детекция результатов проходит непосредственно внутри термоци-клера, что позволяет проводить ПЦР без самой «грязной» стадии - электрофореза. Благодаря этому значительно уменьшилось время, требуемое для получения реакции.
Применение ПЦР при диагностике малярии и лейшмани-озов имеет особую ценность в условиях референс-центров, так как дает возможность накопления значительного числа препаратов, присланных на контроль [3]. При применении ПЦР в референс-центре используется методика выделения ДНК паразита из препаратов крови «толстая капля», ранее окрашенных по Романовскому-Гимзе. Данная методика была разработана в НИИ медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского [4].
В последние годы дирофиляриоз все чаще регистрируют в центральных и северных областях России, это
единственный из филяриозов, способный распространяться в умеренном климате. До 2005 г., когда случаи дирофиляриоза были выявлены более чем у 200 жителей 28 эндемичных территорий, его рассматривали как вновь возникающую паразитарную болезнь.
Как правило, диагностическое исследование проводят уже после появления клинических признаков ди-рофиляриоза у теплокровных - людей и собак, поэтому меры борьбы и профилактики неизменно запаздывают. Молекулярно-биологические методы обнаружения возбудителя в организме переносчика позволяют получить данные об общей распространенности, плотности распределения инвазии, сезонности, а также оценить вероятность заражения человека дирофиляриозом в тот или иной период теплого времени года. С 2009 г. исследования подобного рода начали активно проводить за рубежом, в местах, неблагополучных по дирофиляриозу и граничащих с эндемичными районами. Внедрение в практику молекулярно-биологических методов исследования переносчиков может способствовать получению новых данных о распространенности этой патологии, а в частных случаях облегчить ее диагностику.
Еще одним перспективным направлением применения методов молекулярной паразитологии является детекция возбудителей кишечных протозоозов в клиническом материале и объектах окружающей среды. В первую очередь это касается возбудителя бластоцистоза, многообразие морфологических форм которого затрудняет постановку дифференциального диагноза. Методом верификации диагноза бластоцистоза может служить ПЦР - ее высокая чувствительность позволяет обнаружить в исследуемом материале специфический фрагмент ДНК микроорганизма, являющегося маркером данного возбудителя [11, 12].
В зарубежной литературе в последние годы появляются данные о сравнительных исследованиях куль-турального метода, микроскопического исследования нативного мазка и ПЦР [6]. С помощью ПЦР возможно проведение генотипирования Blastocystis spp., что необходимо для определения степени патогенности этих простейших при эпидемиологических исследованиях, рода того или иного штамма возбудителя в развитии хронического или острого течения болезни.
Ограничения применения ПЦР при рутинной диагностике паразитозов связаны со сложным жизненным циклом паразитов: когда паразит на разных стадиях жизненного цикла изменяет свою локализацию в организме хозяина, невозможно определить, какой материал оптимально пригоден для исследования. Так, применение ПЦР-диагностики у больных геогельминтозами нецелесообразно, поскольку микроскопия дает достаточно быстрый видоспецифический результат. Однако применение ПЦР при геогельминтозах возможно при проведении санитарно-паразитологических исследований. В этом случае постановка ПЦР позволяет значительно сократить трудозатраты. Маловероятно также обнаружение паразита T. gondii в крови пациентов. В случае отрицательного результата ПЦР больного с подозрением на токсоплазмоз следует направлять на исследование методом иммуноферментного
Журнал для непрерывного медицинского образования врачей
37
#
НАУЧНЫЕ ОБЗОРЫ
анализа (ИФА). При этом данные ПЦР, для которой в качестве источника ДНК используют амниотическую жидкость пациента, достаточно достоверны, что связано с наличием в ней большого числа паразитов.
Широкое внедрение ПЦР в клиническую лабораторную диагностику требует повышения уровня информированности медицинских работников о теоретических основах и возможностях современных методических подходов и интерпретации результатов анализа.
Значительное сокращение трудозатрат при постановке ПЦР по сравнению с другими методами достигается только при массовых обследованиях, так как время, необходимое для постановки 1 или 50 проб, отличается не более чем на 10%. Еще более значительного сокращения трудозатрат удается добиться при применении ПЦР в реальном времени, поскольку при применении этого метода отсутствует стадия электрофореза, а длительность ПЦР сокращена до 1,5 ч [5].
С учетом специфики паразитарных болезней можно выделить следующие перспективные направления применения молекулярно-генетических методов в паразитологии:
■ рутинная диагностика токсоплазмоза у беременных;
■ исследование переносчика дирофиляриоза на наличие микрофилярий (используется в эпидемиологических и научных исследованиях);
■ поиск внутривидовых различий малярийных паразитов, связанных с лекарственной устойчивостью малярийных паразитов, а также с длительностью инкубационного периода и возможностью возникновения рецидивов (используется в эпидемиологических и научных исследованиях);
■ рутинная диагностика малярии, лейшманиозов, трипаносомозов и бабезиоза, особенно в сложных случаях с низкой паразитемией;
■ ретроспективный анализ препаратов на малярию и лейшманиозы с применением разработанной в НИИ медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского методики выделения ДНК малярийного паразита из окрашенных препаратов крови (используется только в референс-лабораториях);
■ выявление простейших кишечника (криптоспори-дии, лямблии, бластоцисты, дизентерийные амебы) в клиническом материале и водных объектах окружающей среды;
■ дифференциальная диагностика диарей неясной этиологии при подозрении на паразитарную патологию.
Таким образом, молекулярно-биологические методы имеют значительные перспективы в паразитологии как в научных исследованиях, так и в практическом здравоохранении.
СВЕДЕНИЯ О ВЕДУШЕМ АВТОРЕ
Ф
Морозов Евгении Николаевич - кандидат медицинских наук, доцент, заместитель директора НИИ медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России E-mail: [email protected]
ЛИТЕРАТУРА_
1. Ежов М.Н., Званцов А.Б., Сергиев В.П. Возврат малярии в страны европейского региона ВОЗ: уроки истории и современная ситуация в Закавказье и Турции // Мед. паразитол. - 2004. - № 4. - С. 16-18.
2. Ежов М.Н., Званцов А.Б., Сергиев В.П. Возврат малярии в страны европейского региона ВОЗ: уроки истории и современная ситуация. Сообщение 2. Средняя Азия // Мед. паразитол. - 2005. - № 1. - С. 26-28.
3. Жиренкина Е.Н., Понировский Е.Н., Стрелкова М.В. и др. Особенности эпидемиологии висцерального лейш-маниоза в Папском районе Наманганской области Узбекистана, выявленные при обследовании детей методом ПЦР // Мед. паразитол. - 2011. - № 3. - С. 37-41.
4. Иванова Н. В., Морозов Е. Н., Кукина И. В. и др. Последовательность ITS 1, 5,8S и ITS 2 рДНК А-типа Plasmodium vivax и разработка метода ретроспективной ПЦР-диагностики малярии по окрашенным препаратам крови «толстая капля» // Молекул. биол. - 2001. - Т. 35, № 3. - С. 515-525.
5. ПЦР в реальном времени / Под ред. Д.В. Ребрико-ва. - М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009. - 223 с.
6. Сергиев В.П., Успенский А.В., Романенко Н.А. и др. Новые и возвращающиеся гельминтозы как потенциаль-
38
ный фактор социально эпидемических осложнений в России // Мед. паразитол. - 2005. - № 4. - С. 6-8.
7. Сергиев В.П., Малышев Н.А., Дрынов И.Д. Значение паразитарных болезней в патологии человека. // Эпидемиология и инфекц. бол. - 1999. - № 4. - С. 4-6.
8. Сергиев В. П., Малышев Н.А., Дрынов И.Д. Человек и паразиты: пример сочетанной эволюции // Вестн. РАМН. - 2000. - № 11. - С. 15-17.
9. Сергиев В.П., Лебедева М.Н. Распространенность паразитарных болезней и их профилактика в России // Мед. паразитол. - 1997. - № 4. - С. 48-52.
10. Сергиев В.П., Пальцев М.А. Физиология паразитизма и проблема биологической безопасности. - М.: Медицина, 2008. - 143 с.
11. Detection of Blastocystis hominis in unpreserved stool specimens by using polymerase chain reaction / R. Stensvold, A. Brillowska-Dabrowska, H.V. Nielsen et а1 // J. Parasitol. -2006. - Vol. 92, N 5. - P. 1081-1087.
12. Direct characterization of Blastocystis from faeces by PCR and evidence of zoonotic potential / U. Parkar, R.J. Traub, S. Kumaret et а1 // Parasitology. - 2007. - Vol. 134, N 3. -P. 359-367.
ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ: новости, мнения, обучение №1 2014
#
