CC BY
32
66. Karanikas G., Moamtni A, Poetri C., et al. Frequence and relevance of elevated calcitonin levels in patients with neoplastic an nonneoplastic thyroid disease and in healthy subjects // J.Clin. Endocrinol. and Metab. — 2004. — Vol. 89, № 2. - P.515-519.
67. Kaserer K, Scheuba C, Neuhold N, et al. Sporadic versus familial medullary thyroid microcarcinoma; a histopathologic study of 50 consecutive patients // Am.J. Surg. Pathol.
- 7001. - Vol. 25. - P.1245-1251.
68. Kebelew E, Clarc O.H. Medullaru thyroid cancer // Oncol.
- 2000. - Vol. 1, №4. - P.359-369.
69. Koch C.A. Molecular pathogenesis of MEN-2 asociated tumors // Familial Cancer. - 2005. - Vol. 4, № 1. - P.3-7.
70. Learoyd D.L., Gosnell J, Elston M.S., et al. Experience of prophylactic thyroidectomy in multiple endocrine neoplasia type 2 A kindreds with RET codon804 mutations // Clin. Endocrinol. - 2005. - Vol. 63, № 6. - P636-641.
71. Machens A., Nicoli-Sire P., Hoegel J., et al. Early malignant progression of heraditary medullary thyroid cancer // N. Engl.J. Med. - 2003. - Vol. 349. - P1517-1525.
72. Machens A., Hauptmann S., Dralle H. Increased Risk of Lymph Node Metastasis in Multifocal Hereditary and Sporadic Medullary Thyroid Cancer // Wjuld. J. Surg. - 2007.
- Vol. 31, № 10. - P.1960-1965.
73. Maio M, Coral S., Sigalotti L, et al. Analysis of cancer testis antigens in sporadic medullary thyroid carcinoma: Expes-sion and humoral response to NY-ESO-1 // J. Clin. Endocrinol. and Metab. - 2003. - Vol. 88, № 2. - P.748-754.
74. Moley T.F., Dilley W.G., De Benedetti M.K. Improved results of cervical reoperation for medullary thyroid carcinoma // Ann. Surg. - 1997. - Vol. 225, № 6. - P734-743.
75. Mukherjee J.J., Kaltsas G.A., Islam N., et al. Treatment of
metastatic carcinoid tumors, phaeochromocytoma and medullary carcinoma of the thyroid with (131) I-meta-iodo-ben-zylguanidine (131) I-MIBG //Clin. Endocrinol. - 2001. -Vof 55, № 1. - P.47-60.
76. Mc Nally D., Campbell W.J., Sloan J.M., et al. Thyroidectomy for medullary carcinoma as the sole indicator for surgery // Vlster Med. J. - 1997. - Vol. 66, №2. - P134-135.
77. Modigliani E, Cohen R, Campos J., et al. Prognostic factors for sutvival and for biochemical cure in medullary thyroid carcinoma : results in 899 patient // G. Clin. Endocrinol. -1998. - Vol. 48, № 3. - P265-273.
78. Papaparaskeva K., Nagel H., Droese M. Cytologic diagnosis of medullary carcinoma of the thyroid gland // Diagn. Cy-topathol. - 2000. - Vol. 22, № 6. - P.351-358.
79. Rosei J., Carcangiu M.,De Lelis R.A. Tumors of the thyroid gland // Washington, D.C. Armed Forces Institute of Pa-tology, 1992. - 343 p.
80. Rubello D., Piotto A., Pogette C, et al. 99m Tc-MIBI radio-guited surgery for recurrent thyroid carcinoma : technical feasibility and procedure, and preliminary clinical results // Euurop. J.Nucl. Med. - 2002. - Vol. 29. - P.1201-1205.
81. Schuetz M, Behesthi M, Oczer S., et al. Calcitonin measurements for early detection of medullary thyroid carcinoma or its premalignant conditions in Hashimotos thyroiditis // Anticancer Res. - 2006. - Vol. 26, № 1. - P723-728.
82. Takahashi M, Buma Y, Iwamoto T., et al. Cloning and exression of the RET proto-oncogene encoding a tyrosine inase with two potential transmembrane domains // Oncogene. - 1988. - Vol. 3. - P571-578.
83. Winter J., Raue F. Surgical therapy and prognostic factors in medullary ^thyroid carcinoma // Onkologic. - 1994. - Vol.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© БАХМЕТЬЕВА О.С. - 2008
МОДУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТЬ СD38/АДФ-РИБОЗИЛЦИКЛАЗЫ НЕЙТРОФИЛОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ НА ФОНЕ ПРОВЕДЕНИЯ СИСТЕМНОГО ТРОМБОЛИЗИСА
О.С. Бахметьева
(Красноярская государственная медицинская академия, ректор — д.м.н., проф. И.П. Артюхов, НИИ молекулярной медицины и патобиохимии, руководитель — д.м.н., проф. А.Б. Салмина, кафедра биохимии с курсом медицинской, фармацевтической и токсикологической химии, зав. — д.м.н., проф. А.Б. Салмина.кафедра поликлинической и семейной медицины с курсом ПО, зав. — д.м.н., проф. М.М. Петрова)
Резюме. В статье рассматривается изменение экспрессии и активности СБ38/АДФ-рибозилциклазы нейтрофилов периферической крови у больных с острым инфарктом миокарда. Исследовали экспрессию фермента СВ38 нейтрофи-лами периферической крови и егороль в развитии эндотелиальной дисфункции при остром инфаркте миокарда. Обнаружили увеличение экспрессии СЛ38 нейтрофилами периферической крови на фоне уменьшения активности АДФ-рибозилциклазы у больных с острым инфарктом миокарда, и модуляцию экспрессии/активности фермента при системном тромболизисе.
Ключевые слова: СБ38, АДФ-рибозилциклаза, нейтрофил, острый инфаркт миокарда.
Эндотелиальная дисфункция является одним из ве- эндопероксиды и другие [7]. При различных сосудис-
дущих компонентов патогенеза ишемической болезни тых заболеваниях способность эндотелиальных клеток
сердца. В 1980 году Furchgott и Zawadzki опубликовали освобождать релаксирующие факторы уменьшается, в
статью о сам°стоятельн°й роли эндотелия в регуляции то время как сохраняется или даже увеличивается об-
сосудистого тонуса. В норме эндотелий сосудов конт- разование сосудосуживающих факторов; ухудшается
ролирует процесс пролиферации гладкомышечных кле- функционирование брадикининовых рецепторов, то
ток, обеспечивает адекватную вазодилатацию, угнета- есть формируется состояние, определяемое как дисфун-
ет активацию и адгезию тромбоцитов, участвует в про- кция эндотелия.
цессах гомеостаза и препятствует воспалительным про- Накопились данные экспериментальных и клини-
цессам [1,4]. Эти эффекты реализуются с участием фак- ческих исследований, подтверждающие, что воспали-
торов дилатации: фактор гиперплазии про- тельный процесс, характеризующийся активацией эн-
стациклин 12, монооксид азота, натрийуретический дотелиальных и гладкомышечных клеток, образовани-
пептид С типа, адреномедуллин, и факторами конст- ем воспалительных медиаторов, таких как окисленные
рикции: эндотелин,тромбоксан А2, простагландин F2, липопротеиды низкой плотности, провоспалительные
цитокины, играет важную роль в развитии дисфункции эндотелия, являющейся ключевым звеном в развитии атеросклероза и инфаркта миокарда. В качестве доступной модели изучения степени выраженности эндотелиальной дисфункции, можно рассматривать нейтрофи-лы периферической крови, популяция которых обладает динамичностью в связи с относительно непродолжительным пребыванием их в системном кровотоке [4,7].
Нейтрофилы принадлежат к числу центральных участников воспаления. Поскольку в последние годы атеросклероз рассматривают как проявление системного воспалительного процесса, роль этих клеток при ишемической болезни сердца (ИБС) представляется весьма существенной [1,4]. Нейтрофилы чрезвычайно чувствительны к стимулирующим воздействиям и быстро мигрируют в очаг воспаления. Так, при остром инфаркте миокарда нейтрофилы уже к концу первых суток накапливаются на периферии некроза и мигрируют к центру. Локальная деструкция тканей в результате повреждения ведет к локальному протеолизу белков и появлению пептидов, являющихся хемоаттрактантами для нейтрофилов. Их скопления образуют демаркационную зону между живой и погибшей тканью [7].
Один из механизмов активации нейтрофилов во время респираторного взрыва и, потенциально, в процессе их направленной миграции осуществляется при участии трансмембранного гликопротеина CD38. Это бифункциональный фермент, который, с одной стороны, участвует в формировании циклической АДФ-рибозы, участвующей в регуляции уровня внутриклеточного кальция, а с другой стороны, отвечает за гидролиз этой молекулы, представляя, таким образом, суммарную НАД+-гидролазную активность [2,3,8]. Гидролиз циклической АДФ-рибозы превалирует над ее синтезом [6].
Молекула CD38 представляет собой трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 46 кД, активирующийся АДФ-рибозилциклазой, НДД-гидрола-зой и являющийся вторичным посредником переноса Ca2+. Хорошо обоснована роль Ca2+ в контроле таких фундаментальных процессов физиологии клетки, как секреция, сокращение, дифференцировка, пролиферация и апоптоз. Предложено возможное участие CD38/ДДФри-бозилциклазной системы в регуляции этих событий.
Поскольку ДДФ-рбозилциклаза получена при участии CD38 на внешней поверхности многих клеток, а СД38 действует внутрикле-точно, все большее внимание привлекается к этому топологическому парадоксу. Для объяснения эффекта внутриклеточного проникновения мембранной цДДФ-рибозы обсуждается эндоцитоз как один из возможных механизмов перемещения ферментативной активности в клетку.
В последние годы появились данные о роли фермента в регуляции функциональной активности ряда клеток, в том числе, нейтрофилов, однако данные об
особенностях экспрессии и проявления активности CD38|AДФрибозилциклaзы в этих клетках при остром инфаркте миокарда отсутствуют.
Mbi представляем результаты пилотного исследования влияния тромболитической терапии на экспрессию и активность фермента у больных острым инфарктом миокарда (OИM).
Материалы и методы
Объектом исследования явились больные с OИM в период госпитализации, не страдающие тяжелой хронической или острой сопутствующей патологией (бронхиальная астма, пиелонефрит, почечная недостаточность и др.). Средний возраст больных составлял 57,0+0,01 лет.
Опытную группу I составили 30 больных OИM, 20 мужчины и 10 женщин, получавшие стандартную медикаментозную терапию, но без тромболитической терапии стреп-токиназой.
Контрольную группу составили 10 здоровых человек, 5 мужчин и 5 женщин, без сердечно-сосудистой патологии.
Опытная группа II представлена пятью больными, 4 мужчины и 1 женщина, получавшие стандартную медикаментозную терапию (ингибиторы ангиотензин-превраща-ющего фермента, ß-блокаторы, мочегонные препараты, антикоагулянты, дезагреганты, нитраты) и дополнительно — тромболитическую терапию стрептокиназой доза 150000 ЕД (группа ТЛТ).
Забор венозной крови производился натощак на первые и 14 сутки развития OИM. Hейтрофилы выделяли из цельной гепаринизированной периферической крови с использованием многоступенчатого градиента плотности фиколл-верографин. Плотности верхнего и нижнего градиентов составляли 1,142 и 1,0б2 г!см2, соответственно. Экспрессию CD38 на нейтрофилах периферической крови определяли иммуноцитохимическим методом, путем инкубации фиксированного препарата, содержащего 100 мкл суспензии нейтрофилов в концентрации 1х10б клеток!мл, с моноклональными FITC-мечеными антителами (anti-CD38, Caltag, США). Визуализация осуществлялась методом флуоресцентной микроскопии, определяли относительное количество CD38+ клеток в препарате.
Активность АДФ-рибозилциклазы оценивалась методом флуориметрического анализа, основанного на измерении флуоресценции продукта каталитической конверсии никотинамидгуаниндинуклеотида по стандартному протоколу. Белок определялся методом Лоури.
Статистическая обработка данных проводилась с использованием компьютерных программ Microsoft Excel, AnalystSoft StatPlus, McGraw Hill BioStat, c использованием непараметрического теста Marn-ymm. Критический уровень значимости при проверке статистических гипотез р=0,05.
Результаты и обсуждение
Me обнаружили высокий уровень экспрессии CD38+ на нейтрофилах периферической крови у больных с OИM на 1 и 14 сутки заболевания по сравнению с
контрольной группой (р<0,05), при этом активность
Таблица 1
Экспрессия и активность CD38/АДФ-рибозилвдклазы нейтрофилов у больных с острым инфарктом миокарда
Группа и сроки наблюдения, сутки Величины и показатели в исследуемых группах
Количество CD38+ нейтрофилов, % Активность АДФ-рибозилциклазы, ед!мин!мг белка
Опытная группа I: первые (п=30) четырнадцатые сутки (п=30) 25,4+0,49 18,5±0,б9 0,475±0,14 0,254+0,08
Опытная группа II (группа ТЛТ): первые (п=5) четырнадцатые (п=5) 23,4±1,б# 1б,0 ±1,38# 0,070±0,01# 0,233±0,05#
Контрольная группа: первые (п=10) четырнадцатые (п=10) б,5±0,73* б,5±0,73* 0,432±0,08* 0,431±0,08*
Примечание: * - р<0,05 при сравнении с контрольной группой; # - р<0,05 при сравнении с опытной группой I.
фермента на 1 сутки развития инфаркта миокарда составила 0,475+0,14 ед/мин/мг белка, а на 14 — уменьшилась в 2 раза (р<0,05) (табл. 1).
Интересно, что активность фермента после введения стрептокиназы на 1 сутки развития ОИМ была в 6 раз ниже, чем в группе I без применения тромболити-ческой терапии (р<0,05) (табл. 1).
Обращает на себя внимание факт смещения пика максимальной активности фермента in vitro: в опытной группе II — 0,2+0,0001 мин. после начала инкубации компонентов реакции, на первые сутки развития инфаркта миокарда — 0,7+0,004 мин. (p<0,05), на 14 сутки заболевания — 0,18+0,0001 мин. (p<0,05), что, по нашему мнению, может быть связано с конформаци-онными изменениями в молекуле фермента [5], определяющими изменение доступности активного центра для субстрата.
Поскольку АДФ-рибозилциклазная активность получена при участии CD38 на внешней поверхности нейтрофилов, а CD38 действует внутриклеточно, все большее внимание привлекается к этому топологическому парадоксу. Для объяснения эффекта внутриклеточного проникновения мембранного компонента CD38 обсуждается эндоцитоз как один из возможных механизмов перемещения ферментативной активности в клетку. Недавно выяснено, что CD38 подвергается выборочной и обширной интернализации через эндоцитозные пузырьки; при инкубации CD38+ позитивных клеток и НАД+ или тиоловых компонентов эти эндоцитозные пузырьки могут преобразовать цитозольный НАД+ в АДФ-рибозилциклазу, несмотря на неблагоприятную
асимметричную ориентацию, которая делает активный центр CD38 внутривезикулярным [5,8]. ДДФ-рибозил-циклазная активность приводит к длительному увеличению свободной концентрации внутриклеточного кальция в различных клетках, что в свою очередь приводит к образованию НДД+. Это влияние, CD38 интернализации, на уровень внутриклеточного кальция, включает двухступенчатый механизм. Во-первых, вход цитозольного НДД+ в эндоцитозные везикулы, опосредованный неизвестной до настоящего времени транспортной динуклеотидной системой, которая является двунаправленной и характеризуется недостаточной специфичностью, низким сродством, но высокой производительностью [5].
Д во-вторых, внутривезикулярная катализируемая CD38 конверсия, сопровождаемая втягиванием циклического нуклеотида в цитозоль с последующим выпуском кальция из тапсигарин-чувствительных запасов.
Интересным остается факт достоверного снижения активности фермента под влиянием тромболитической терапии у больных с инфарктом миокарда, что позволяет на наш взгляд, по-новому оценить механизмы активации нейтрофилов, сопровождающие системный тромболизис [4], предположив роль ДДФ-рибозилцик-лазы в процессах, регулирующих активность нейтрофилов при этом патологическом состоянии.
Таким образом, нами впервые зарегистрированы изменения экспрессии и активности ДДФ-рибозилцикла-зы нейтрофилов периферической крови у больных с острым инфарктом миокарда, что, вероятно, обусловлено активацией клеток, мигрирующих в очаг воспаления.
EXPRESSION AND ACTIVITY OF CD38/ADP-RIBOSYL CYCLASE IN PERIPHERAL BLOOD NEUTROPHILES IN PATIENTS WITH ACUTE MYOCARDIAL INFRACTION:
PILOT STUDY
O.S. Bakhmetieva (Krasnoyarsk State Medical Academy)
The paper contains results of study of CD38/ADP-ribosyl cyclase in patients with acute myocardial infarction (MI). We assessed expression and activity of CD38/ADP-ribosyl cyclasae inperipheral blood neutrophiles in patients with MI in order to elucidate its role in progression of endothelial dysfunction. We found elevation of CD38 expression and decreased activity of ADP-ribosilcyclase, and their modulation under systemic thrombolysis.
ЛИТЕРАТУРА
2.
4.
Маянский Д.Н., Маянская С.Д. Роль нейтрофилов в ишемическом и реперфузионном повреждении миокарда // Тер. арх. - 2001. - № 12. - С.84-88.
Dewitt S., Laffafian I., Hallett M.B. Does neutrophil CD38 have a role in Ca++ signaling triggered by integrin? // Nature Med. - 2002. - VOl. 307, №8. - Р.1201-Г214.
GraeffR.,Munshi C., AarhusR. A single residue at the active site of CD38 determines its NAD cyClizing and hydrolyzing activities // J. Biol. Chem. - 2001. - VoL 276. - РШ69-12173.
Link B., Schwerdt H., Berg G, et al. Neutrophil adhesion and activation during systemic thrombolysis in acute myocardial infarction - neutrophil activation, peripheral leukocyte responses, and myocardial injury // Thrombosis Res.
- 1999. - Vol. 91, № 4. - P183-190.
5. Liu Q., Kriksunov I.A., Graeff R, et al. Structural basis for the mechanistic understanding of human CD38-controlled multiple catalysis // J. Biol. Chem. — 2006. — Vol. 281. — P.32861-32869.
6. Munshi C., ThielD.J., Mathews I.I. Characterization of the active site of ADP-ribosyl cyclase // J. Biol. Chem. — 1999.
- Vol. 274. - P. 30770-30777.
7. Naruko T., Ueda M., Haze K. Neutrophil infiltration of culprit lesions in acute coronary syndromes // J. Circulation.
- 2002. - Vol. 106. - P2894-2900.
8. Salmina A., Olovyannikova R., Noda M., Higashida H. NAD+ metabolism and ADP-ribosyl cyclase as targets for central nervous system therapy // Current MedicinalChem-istry. - 2006. - Vol. 6. - P193-210.
