CC BY
37
УДК 57.083.132
А. Я. Самуйленко, И. В. Павленко, Н. К. Еремец, А. А. Нежута, И. В. Бобровская, Л. А. Неминущая, Н. Д. Скичко, И. И. Бережной, В. А. Гаврилов, И. В. Ковальский, С. В. Гаврилов, З. А. Канарская
МОДЕЛИРОВАНИЕ И ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА
СИМБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА «СИМБИОХИТ»
Ключевые слова: хитозан, защитная среда, симбиотический препарат, сушка.
Разработан перспективный симбиотический препарат на основе штамма Escherichia coli VL-613 «СИМБИОХИТ» с использованием оптимизированной защитной среды высушивания с применением хитозана. Защитная среда с применение хитозана позволяет повысить выживаемость микроорганизмов при сублимационном высушивании и длительном хранении препарата на 15 - 17 % по сравнению с защитной средой, используемой при изготовлении препарата «Пролизер».
Keywords: chitosan, protective environment symbiotic preparation, drying.
Worked out a symbiotic preparation on the basis of the strain Escherichia coli VL-613 "SIMBIOHIT" using optimized protective drying of the medium using chitosan. Protective environment with the use of chitosan improves the survival of microorganisms in the dried-sublimation Shivani and long-term storage of the drug by 15 -17% compared with the protective medium used in the manufacture of the drug "Prolizer".
Актуальность. Обеспечение населения России продовольствием и биологическая защита людей и животных в стране являются основной задачей АПК на современном этапе, что делает актуальными научные исследования в области биотехнологии, направленные на решение этих проблем.
В настоящее время микробиотехнология является активно развивающимся научным направлением, использующим методы биотехнологии при разработке и производстве широкого спектра биопрепаратов (вакцин, сывороток, диагностикумов, пробиотиков), биологически активных веществ (ферментов, антибиотиков, пребиотиков и др.), добавок к кормам (белков и аминокислот). Применение этих биопродуктов в животноводстве и птицеводстве способствует повышению продуктивности животных и птицы, обеспечению ветеринарного благополучия хозяйств, гарантии качества, биологической и экологической безопасности биопродукции и ее производства.
Вступление России в ВТО повысило требования к конкурентоспособности отечественной продукции, что делает необходимым реконструкцию (реин-жиринг) производств многих предприятий биологической, химической и пищевой промышленности и разработку новых или усовершенствование традиционных промышленных технологий производства препаратов.
Основы разработки, оптимизации, моделирования технологий микробиологических производств и процессов микробиологического синтеза отражены в работах [1]. Эти разработки актуальны и для предприятий, выпускающих лекарственные средства для животных, в том числе и иммунобиологические препараты, с точки зрения обеспечения их безопасности и качества.
В настоящее время в области разработки новых и усовершенствования существующих промышленных технологий производства сухих живых бактериальных препаратов не существует единого мето-
дологического подхода, основанного на использовании методов системного анализа.
Традиционные технологии разработаны на основе эмпирических подходов и зачастую не удовлетворяют современным национальным и международным требованиям, предъявляемым к технико-технологическим характеристикам (ТТХ) производства и обеспечивающим качество продукции. Поэтому остается много нерешенных технических и технологических проблем совершенствования существующих и создания новых технологий промышленного производства бактерийных препаратов.
Семейство энтеробактерий объединяет обширную группу грамотрицательных бактерий, к которым относятся роды Escherichia, Edwardsiella, Citrobacter, Salmonella, Shigella и др. Сальмонеллы патогенны для животных многих видов, наиболее часто сальмонеллезы регистрируют у свиней и птиц. Сальмонеллезы имеют большое эпидемиологическое и эпизоотологическое значение. Возбудителями, в основном, являются S. choleraesuis, S. enteritidis, S. typhimurium, S. typhisuis, значительно реже обнаруживают S. gleser, S. dublin, S. voldagsen.
Группа бактерий, включенная в род Escherichia, насчитывает большое число разновидностей, отличающихся между собой по ферментативным и серологическим свойствам, подвижности, по чувствительности к бактериофагам и колицинам, по степени антагонистической активности и патогенности. Непатогенные виды колибактерий традиционно используются для изготовления пробиотических препаратов [2, 3, 4].
Симбиоз животных и полезных микроорганизмов играет важную роль в нормальном функционировании организма животных и птицы, а так же реализации их генетического потенциала продуктивности. В настоящее время активно развивается использование симбиотиков антагонистов патогенной микрофлоры и продуцента лизина - незамени-
мой аминокислоты, которая входит в состав структурных тканевых белков и белковых ферментов, является важным фактором биологически полноценного кормления, способствует улучшению пищеварения, играет важную роль в формировании костяка, повышении продуктивности сельскохозяйственных моногастричных животных (птицы и свиней). Такие симбиотики используются в качестве альтернативы дорогостоящему синтетическому лизину (моногидрохлорид лизина), в основном, импортного производства. Поэтому разработка новых препаратов такой группы и технологии их производства является актуальной проблемой. Начало решения этих проблем заложено в работах [5, 6, 7, 8, 9, 10].
В настоящее время промышленность выпускает симбиотический препарат «Пролизэр», способ получения которого включает засев культурой, культивирование в жидкой питательной среде на основе перевара Хоттингера, концентрирование бактериальной суспензии с последующим смешиванием со стабилизатором, расфасовку и лиофилиза-цию препарата; при этом в процессе культивирования Escherichia coli VL-613 сразу после засева окислительно-восстановительный потенциал бактериальной культуры снижают до минус (80 - 100) мВ, после чего до окончания процесса культивирования рО2 поддерживают на уровне (20 ± 5) % от насыщения кислородом воздуха, рН регулируют на уровне (7,0-7,4), а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации (0,1-0,2) % при лимитировании роста E. coli VL-613 глюкозой, длительность процесса культивирования составляет 4-6 ч. [11, 12, 13, 14].
В способе получения симбиотический препарат «Пролизэр» на основе штамма E. coli VL-613 среда высушивания готовится по следующей прописи: концентрация основных компонентов имеет следующие значения: желатин - 2,0 %; сахароза - 10,0 %. В качестве растворителя - калий фосфатный буфер. [12, 13].
Известно, что повышению стабильности препаратов после сушки и в процессе хранения способствуют различные соединения: это природные и синтетические высокомолекулярные соединения - полисахариды (декстран, декстрин, агароза), соли альгиновой кислоты, желатин и поливинилпирролидон. Они создают защитные барьеры для клеток в процессе сушки, после высушивания, эффективны в концентрациях 1 - 2 %. В более высоких концентрациях (исключая полисахариды) они ухудшают условия удаления влаги при высушивании. Тиомочевина и натриевые соли глутаминовой, лимонной и аскорбиновой кислот, легко окисляясь, блокируют свободнорадикальные и аммоно-карбонильные реакции в сухой биомассе (достаточно 1-3 % этих веществ). В этой связи поиск стабилизаторов для сушки препаратов и сегодня остается весьма актуальным.
Исследования на животных показали, что олигосахариды хитина улучшают функцию кишечника. Другое исследование на животных позволило
предположить, что хитин, хитиновые олигосахари-ды и хитозан стимулируют неспецифическую иммунную реакцию у мышей, приводящую к созданию Т-клеток, которые атакуют опухолевые клетки. Из сказанного выше, мы решили ввести хитозан в состав защитной среды высушивания.
Учитывая перспективу применения хитина и его производных для получения биопрепаратов для животных, целью настоящей работы являлось разработка способа получения симбиотического препарата с применением в составе защитной среды хитозана.
В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
- оптимизация защитной среды высушивания с хитозаном, используемой при изготовлении симбиотического препарата на основе E. coli;
- изготовление опытно-промышленных образцов препаратов и проверка срока годности препарата.
Материалы и методы
Объекты исследований. При исследовании и разработке симбиотического препарата - штамм E. coli VL-613. Культивирование эшерихий проводили на питательной среде, основой которых являлся перевар Хоттингера.
Технологическое оборудование. Культуру эшерихий выращивали в пробирках и флаконах на шуттель-аппарате, а также в ферментере АНКУМ-2М емкостью 3 и 10 дм3, который оснащен системами автоматического контроля и регулирования основных параметров культивирования (температура, рН, рО2, еН, расход воздуха на аэрацию, скорость вращения мешалки и оптическая плотность бактериальной суспензии).
С целью пеногашения при интенсивном росте в ферментере листерий, сальмонелл и эшери-хий применяли пеногаситель пропинол Б - 400.
Содержание рН в культуральной жидкости определяли потенциометрически, уровень растворенного кислорода рО2 - датчиками изготовленными в СКБ БП (г. Пущино), еН - потенциометрически с использованием электродов с ионной проводимостью типа ЭО - 01.
Оптическую плотность культуры листерий и E.coli измеряли на фотоколориметрах ФЭК - 56, ФЭК - 60, КФК - 2 и блоке оптической плотности аппарата АНКУМ - 2М.
Концентрирование бакмассы листерий, сальмонелл и E.coli осуществляли с помощью лабораторных центрифуг К-70Д, S-60 и установки «Сар-токон-мини» («Владисарт», г. Владимир).
Замораживание готовых препаратов проводили в холодильных установках ЛСШ-28, с последующим высушиванием в сублиматоре ТГ-50.5.
Методы доклинических испытаний. Морфологию бактериальных культур определяли путем микроскопирования мазков, окрашенных по Граму. Культуральные свойства - путем высева их на МПА и МПБ. Жизнеспособность определяли методом последовательного десятичного титрования на чашках Петри с мясопептонным агаром. Длительность фаз роста, максимальной удельной скорости, мини-
мального времени удвоения культур определяли графическим методом.
Статистическая обработка результатов. Для оптимизации защитной среды высушивания использовали метод математического планирования полный факторный эксперимент (ПФЭ) типа 2n. Расчеты и построение технологических графиков осуществляли с помощью пакета MICROSOFT OFFICE EXCEL 2010, построение технологических и аппаратурных схем - с помощью программы Microsoft Office VISIO 2010.
На основе ранее выполненных исследований [11] была получена бактериальная культура эшерихий E. coli VL-613 с общей концентрацией по окончанию культивирования 16-30 млрд. м.к./см3.
Для этого в стерильный ферментер, который снабжен системой автоматического контроля и регулирования основных технологических параметров (температура, обороты мешалки, рН, рО2, еН), загружают жидкую питательную среду - бульон Хоттингера (приготовленный на основе перевара Хоттингера с содержанием 600 - 800 мг % аминного азота), приготовленную по следующей прописи, масс. %:
Перевар Хоттингера 18,0 - 22,0
Пептон 0,8 - 1,2
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,7 - 0,9
Хлористый натрий 0,7 - 0,9
Глюкоза 0,15 - 0,25
Дрожжевой экстрат 0,4 - 0,6
Вода дистиллированная до 100,0
Готовая стерильная питательная среда должна содержать 160 - 180 мг % аминного азота и иметь рН 7,4 - 7,6 ед. рН.
В ферментер с питательной средой иноку-лируют 18-24-часовую матриксную культуру эше-рихий (E. coli шт. VL-613), выращенную, в жидкой питательной среде по составу аналогичному со средой культивирования, в соотношении 5-10% от объема питательной среды в ферментере, и культивируют при (37±1) С в течение 4-7 часов.
После засева ферментера окислительно-восстановительный потенциал (еН) культуральной жидкости снижают до (-100) - (-80) мВ, путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке, после чего до окончания процесса культивирования с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скоростью вращения мешалки поддерживают парциональное давление растворенного кислорода (рО2) в культуральной жидкости на уровне (20±5) % от насыщения кислородом воздуха, рН культуральной жидкости регулируют на уровне (7,2-7,4) ед. рН подачей 10% -ного раствора NaOH, а дробную подачу глюкозы осуществляют дозами до концентрации (0,1-0,2) % при лимитировании роста эшерихий глюкозой, характеризующемся резким повышением рО2 при неизменных расходе воздуха и оборотах мешалки и прекращением снижения рН культуральной жидкости.
Общая концентрация эшерихий по окончанию культивирования составляет (16-30) млрд. м. к./см3.
Полученную бактериальную культуру концентрируют, осадок смешивают с защитной средой высушивания.
Используя математические методы планирования эксперимента, в частности план полного факторного эксперимента (ПФЭ) типа 23, была разработана математическая модель и оптимизирована среды высушивания для E. coli штамма VL-613 для длительного сохранения биологических свойств симбиотического препарата в процессе сушки и хранения.
В качестве математической модели была взята защитная среда (ЗС) разработанная для сим-биотического препарата на основе E. coli штамма VL-613, её состав: желатин - 2,0 %; сахароза - 10,0 %; в качестве растворителя КФБ до 100%.
Критерием оптимизации «Уо» для нахождения оптимальной ЗС в процессе сушки эшерихий была выбрана концентрация живых м/о после процесса сушки относительно концентрации эшерихий до процесса сушки, принятой за 100 %.
Критерием оптимизации «У^> для нахождения оптимальной ЗС в процессе длительного хранения выбрали концентрацию живых микроорганизмов E. coli при длительном хранении относительно концентрации после сушки, принятой за 100 %, где i - месяц хранения.
По данным предварительных опытов выбраны следующие факторы защитной среды для сублимационной сушки сальмонелл:
Х1 - концентрация желатина;
Х2 - концентрация сахарозы;
Х3 - концентрация хитозана пищевого.
Результаты и обсуждение
3
В таблице 1 представлен план ПФЭ 2 . В качестве контрольной ЗС использовали среду для симбиотического препарата на основе E. coli штамма VL-613.
Таблица 1 - План ПФЭ в кодированной и натуральной размерностях (n=6)
№ опыта Кодированная размерность факторов Натуральная размерность факторов Накопление эшерихий (Уср), млрд/см3
Xi Х2 Хз Концентрация желатин, % Концентрация сахарозы, % Концентрация хитозана пищевого, %
1 - - - 1,5 5,0 1,0 11,82
2 + - - 2,5 5,0 1,0 11,33
3 - + - 1,5 10,0 1,0 11,02
4 + + - 2,5 10,0 1,0 12,15
5 - - + 1,5 5,0 2,0 11,42
6 + - + 2,5 5,0 2,0 10,18
7 - + + 1,5 10,0 2,0 12,40
8 + + + 2,5 10,0 2,0 11,27
Xoi 2,0 7,5 1,5
AXi 0,5 2,5 0,5
Конт. 2,0 10,0 0,0 12,83
В таблице 2 представлены данные по сохраняемости ж/с эшерихий на разных ЗС по плану
ПФЭ 2 в процессе сушки и с 1 по 12 месяц хранения.
Анализируя полученные данные по оптимизации состава ЗС для процесса сушки эшерихий, можем считать опыт №7 плана ПФЭ 23 (табл. 1) -лучшим.
Таблица 2 - Сохраняемость ж/с эшерихий в различных ЗС согласно плану ПФЭ 2 в процессе сушки и с 1 по 12 месяц хранения
№ п/ п Уср.до сушки млрд/см3 3 м с/ £ рр сл ^ s ж/с эшерихий по месяцам хранения
Л £ Умс Я £ Умс £ £ S о £ р Умс --А" Ч р р3 Умс
1 11,82 11,23 10,38 9,75 8,93 8,75 7,77
2 11,33 9,83 9,33 8,55 7,98 7,80 7,6
3 11,02 9,62 8,98 8,35 7,5 7,07 7,05
4 12,15 11,43 11,07 10,42 9,78 9,13 8,67
5 11,42 10,83 10,38 10,12 9,1 8,70 8,00
6 10,18 10,83 9,08 8,33 7,6 7,15 6,67
7 12,40 12,0 12,00 11,78 11,36 11,14 10,92
8 11,27 10,92 10,62 9,85 9,22 8,97 8,83
К 12,83 12,0 11,5 10,83 10,5 10,0 9,33
Затем проводили эксперименты по оптимизации ЗС в процессе длительного хранения согласно плану ПФЭ 2 (таблица 1). Количество ж/с эшерихий в процессе длительного хранения будем определять через 1, 3, 6, 9 и 12 месяцев хранения (таблица 2) и рассчитывали уравнения регрессии для каждого месяца хранения соответственно.
Окончанием эксперимента по оптимизации состава защитной среды в процессе длительного хранения можем считать опыт № 7 плана ПФЭ 23 (таблицы 1).
Оптимизированная среда высушивания готовится по следующей прописи: концентрация основных компонентов имеет следующие значения: желатин - 1,5 %; сахароза - 10,0 %; хитозан пищевой - 2 %. В качестве растворителя - калий фосфатный буфер.
Осадок бактериальной массы после концентрирования смешивали с защитной средой высушивания. После тщательного перемешивания смешанную с защитной средой высушивания бактериальную суспензию до концентрации 10-14 млрд./см3 E. coli в жидком препарате и по 2 или 4 см3 расфасовывают с соблюдением условий асептики в стерильные флаконы объемом 10 или 20 см3 и проводят ее сублимационное высушивание.
Контрольная среда высушивания (препарат «Пролизэр») готовилась по следующей методике. Концентрация основных компонентов имеет следующие значения: желатин - 2,0 %; сахароза - 10,0 %. В качестве растворителя - калий фосфатный буфер. Концентрация жизнеспособных клеток эшери-хий перед сушкой 12,83 млрд/см3.
Оптимизированная среда разрабатываемого препарата высушивания готовилась по следующей
прописи: концентрация основных компонентов имеет следующие значения: желатин - 1,5 %; сахароза -10,0 %; хитозан пищевой - 2 %. В качестве растворителя - калий фосфатный буфер. Концентрация жизнеспособных клеток эшерихий перед сушкой 12,4 млрд/см3.
На рис. 1 показана зависимость выживаемости E. coli в процессе длительного хранения препаратов (срок наблюдения 12 месяцев).
14,0
¿.О ■
1,0 ■
0.0 -.-.-.-.-.-.
0 2 4 6 8 10 12
время, мес.
—* -ко**фоль-"Пролмээр" —■— ontrbk препарат
Рис. 1 - Зависимость выживаемост и E. coli в процессе длительного хранения препаратов (срок наблюдения 12 месяцев)
Анализ представленных результатов по со-хроняемости жизнеспособных эшерихий позволяет сделать вывод, что на разработанной защитной среде с применением хитозана E. coli эффективней переносят сублимационное высушивание и длительное хранение. В результате увеличивается срок длительного хранения препарата до 12 месяцев и сохраняемость жизнеспособных клеток выше на 15, 34 %, чем у ранее используемой защитной среды препарата «Пролизер». Проведенные исследования использованы при разработке технологии нового симбиотического препарата на основе штамма E. coli VL-613 с товарной маркой «СИМБИОХИТ».
Вывод
Разработан перспективный симбиотический препарат на основе штамма E. coli VL-613 «СИМБИОХИТ» с использованием оптимизированной защитной среды высушивания с применением хитозана. Защитная среда с применение хитозана позволяет повысить выживаемость микроорганизмов при сублимационном высушивании и длительном хранении препарата на 15 - 17 % по сравнению с защитной средой, используемой при изготовлении препарата «Пролизер». На способ получения нового препарата подана заявка на выдачу патента на изобретение № 2014109049 от 11.03.2014 г.
Литература
1. В.В. Бирюков, В.М. Кантере, Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза. Наука, Москва, 1985. 296 с.
2. А.Н. Панин, В.А. Мельников, Ветеринария, 1, 12-15 (2011).
3. А.Н. Панин, Н.И. Малик, Е.В. Малик, В сб. Пробио-тики в промышленном птицеводстве. Материалы I
Международного ветеринарного конгресса по птицеводству, М., 2005. С. 235-239.
4. А.Я. Самуйленко, Е.Э. Школьников, П.С. Рахманин, Ветеринарная медицина, 2, 85, 959-961 (2005).
5. О.В. Еремец, М.А. Малышева, Л.А. Неминущая, Л.С. Люлькова, Н.К. Еремец, Т.А. Скотникова, Ветеринария и кормление, 6, 60-61 (2010).
6. Авт. Свид. SU 1354458 (1985).
7. Л.К. Эрнст, А.Я. Самуйленко, Е.Э, Школьников, В.А. Меньшенин, И.В. Павленко, А.А. Раевский, Е.С. Рахма-нина, И.В. Егоров, Е.Н. Андрианова, И.Д. Салеева, Птицеводство, 4, 35-36 (2011).
8. В.И. Фисинин, И.А. Егоров, Т,М. Околелова, Ш.А. Имангулов, Кормление сельскохозяйственной птицы. ВНИТИП, Сергеев Посад, 2002. 360 с.
9. В.И. Фисинин, В.С. Лукашенко, И.П. Салеева, Технология производства мяса бройлеров. ВНИТИП, Сергеев Посад, 2008. 252с.
10. Пат. Ш 2450051 (2010).
11. И.В. Павленко, А.Я. Самуйленко, В.И. Еремец, А.А Нежута, З.А. Канарская, А.В. Канарский, Вестн. Казан. технолун-та, 9, С. 165 - 171 (2013).
12. И.В. Павленко, А.Я. Самуйленко, В.И. Еремец, А.А Нежута, З.А. Канарская, А.В. Канарский, Вестн. Казан. технол ун-та, 9, С. 171 - 176 (2013).
13. А.Я. Самуйленко, В.И. Еремец, И.В. Павленко, И.П. Салеева, Экология и промышленность России, 9, С. 38 -40 (2013).
© А. Я. Самуйленко - д-р вет. наук, проф., дир. ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, vnitibp@mail.ru; И. В. Павленко - канд. биол. наук, зав. лаб. отдела противобактерийных препаратов ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, polt65@yandex.ru; Н. К. Еремец -канд.биол. наук, зав. отделом обеспечения качества лекарственных средств для ветеринарии и животноводства, vnitibp@mail.ru; А. А. Нежута - д-р биол. наук, зав. отделом технологии сушки биопрепаратов ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, vnitibp@mail.ru; Л. А. Неминущая - д-р биол. наук, зав. лаб. отдела обеспечения качества ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, vnitibp@mail.ru; И. В. Бобровская - канд. биол. наук, зав. лаб. технологических методов контроля и доклинических испытаний ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, biv_74@mail.ru; Н. Д. Скичко - д-р биол. наук, вед. науч. сотрудник ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, vnitibp@mail.ru; И. И. Бережной - асп. ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, vnitibp@mail.ru; В. А. Гаврилов - асп. ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, vnitibp@mail.ru; И. В. Ковальский - асп. ГНУ ВНИТИБП РАСХН РФ, vnitibp@mail.ru, С. В. Гаврилов - асп. - каф. ПИМП, КНИТУ, ser_gavr@mail.ru; З. А. Канарская - канд. тех. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии КНИТУ, zosya_kanarskaya@mail.ru.
