CC BY
44
МОДЕЛЬ ФОТОИНДУЦИРОВАННОГО ТЕРМОГЕМОЛИЗА
ЭРИТРОЦИТОВ А.Ю. Москалева, В.А. Тарлыков
Рассмотрена возможность использования процесса гипоосмотического набухания эритроцитов, вызванного их нагревом вследствие поглощения излучения оптического диапазона, для измерения жесткости эритроцитарных мембран и оценки деформируемости эритроцитов
Введение
Для диагностики целого ряда заболеваний и оценки эффективности применяемого курса лечения необходимо осуществлять контроль реологических показателей крови. Это обусловлено тем, что многие заболевания и патологические состояния сопровождаются нарушениями реологических свойств крови, которые приводят к развитию различных осложнений, наиболее распространенными из которых являются гипервискозный синдром, нарушение суспензионной стабильности крови, изменения в системе микроциркуляции [1,6].
Одним из основных параметров, определяющих реологические свойства крови, является деформируемость, характеризующая способность красных клеток крови изменять свою форму под действием внешних сил. Высокая деформируемость эритроцитов играет важную роль в процессах переноса кровью кислорода и углекислого газа. Способность эритроцитов к деформации определяется вязкоэластичными свойствами мембраны, внутренней вязкостью и отношением объема клетки к ее площади. Физико-химические параметры крови (рН, осмолярность, газовый состав, температура), различные химические агенты также влияют на деформируемость эритроцитов. Существенные нарушения деформируемости эритроцитов наблюдаются при различных заболеваниях системы крови (анемиях, множественной миеломе, истинной полицитемии и др.), при гипертонии, ишемической болезни сердца и других патологиях.
Существуют различные методы измерения деформируемости эритроцитов. К прямым методам относятся измерения деформации мембраны при закреплении эритроцита в поле зрения микроскопа при различных механических воздействиях [1, 2]. В случае косвенных методов измерения о степени деформируемости эритроцитов судят по изменению различных параметров, отражающих способность эритроцитов к деформации. Это различные фильтрационные методы (пропускание эритроцитарной суспензии через микропористые фильтры, искусственные капилляры малого диаметра), оценка деформируемости по «пробе на упаковку» при центрифугировании [1-4,10]. Еще одним методом оценки деформируемости служит резистентность эритроцитов к различным воздействиям (химическим, осмотическим и др.), приводящим к гемолизу эритроцитов при превышении порогаустойчивости [1, 5, 6].
Оптические методы регистрации характеризуются быстродействием, высокой точностью, чувствительностью, минимальным воздействием на объект исследования, возможностью одновременной регистрации большого количества малых частиц. Наиболее распространенным методом регистрации деформируемости эритроцитов является микроскопический метод, позволяющий наблюдать реакцию эритроцитов на различные внешние воздействия на них. Среди когерентно-оптических методов исследования, широко использующихся в биологии и медицине, большой интерес представляет применение дифракционного метода, основанного на явлении дифракции лазерного излучения на одиночных и множественных биологических микрообъектах. Параметры дифракционной картины однозначно связаны с параметрами микрообъектов, что дает возможность определять их размеры, форму, внутреннюю структуру и другие характеристики. В данной работе нами рассматривается возможность оценки деформируемости эритроцитов в условиях фотоинду-цированного нагрева, вызванного воздействием оптического излучения на образец крови.
Термическое воздействие на биообъекты. Термогемолиз эритроцитов
Воздействие повышенных температур на биологические объекты (гипертермия) широко используется в различных областях биологии и медицины [7-14]. Имеются различные объяснения механизмов влияния гипертермии на биологические объекты, согласно которым термическому воздействию подвергается мембрана клетки (изменяется ее проницаемость, происходят термические денатурационные переходы липидов и белков клеточной мембраны, например, спектрина) [2, 9-11], наблюдается денатурация гемоглобина - первая стадия термогемолиза эритроцитов [12] и другие явления. Эти процессы оказывают влияние на деформируемость эритроцитов. При превышении порога устойчивости к термическому воздействию происходит термогемолиз эритроцитов (рис. 1).
Рис. 1. Механизмы термогемолиза эритроцитов
Еще одной критической системой термического повреждения клеток и тканей является система осмотического гомеостаза [13]. При гипертермии нарушается существующее в условиях температурного оптимума осмотическое равновесие в системе клетка - среда вследствие различий констант электролитической диссоциации электролитов содержимого клетки и окружающей ее среды. При повышении температуры осмотическое давление содержимого клеток будет увеличиваться более интенсивно, чем давление суспензионной среды (например, физиологического раствора). В результате клетки подвергаются гипоосмотическому воздействию, степень влияния которого будет определяться скоростью нагрева, величиной перепада и абсолютным значением температуры. При этом происходит набухание эритроцитов, в конечном итоге приводящее к их гемолизу. Таким образом, фотоиндуцированный нагрев эритроцитов, происходящий при облучении образца крови, приводит к увеличению объема клеток вплоть до их гемолиза, что может быть использовано для определения деформируемости эритроцитов.
Модель фотоиндуцированного термогемолиза эритроцитов
Рассмотрим процессы, происходящие при облучении образца крови.
Оптическое излучение, поглощенное эритроцитом, находящимся в изотоническом растворе, вызывает повышение его внутренней энергии, что приводит к нагреванию клетки. При этом распределение теплового поля в плоскости клетки [8]
DT (x, y) = a( x, y, z )
x,y) • t
PC0 '
(1)
где а - коэффициент поглощения излучения эритроцитом на длине волны X; ю - плотность мощности излучения; t - длительность воздействия; р - плотность вещества; С0 -удельная теплоемкость клетки. Таким образом, чем больше плотность мощности излучения и длительность воздействия, тем большему термическому влиянию подвергается клетка.
Источник оптического излучения необходимо выбирать с учетом максимального поглощения эритроцитом на этой длине волны, пренебрегая другими видами воздействия. Основным компонентом эритроцита, ответственным за поглощение, является гемоглобин, удельный коэффициент поглощения которого зависит от длины волны излучения (рис. 2) [14]. Наблюдается сильная полоса поглощения с центром в области около 414,5 нм и более слабые пики в области 550 нм. Оксигемоглобин по сравнению с гемоглобином меньше поглощает в красной области спектра. В качестве одного из возможных источников оптического излучения может быть выбрана вторая гармоника УЛ&Ш3+-лазера (Х=0,53 мкм).
100
10
1,0
0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 X, мкм
Рис. 2. Спектр оптического поглощения гемоглобина (---) и оксигемоглобина (-): зависимость удельного коэффициента поглощения от длины волны
При нагревании суспензии эритроцитов вследствие различий в электролитном составе суспензионной жидкости (в данном случае изотонического раствора №0) и содержимого клетки происходит нарушение осмотического гомеостаза, подобное процессу, вызываемому изменением соотношения концентраций осмотически активных элементов клеток и среды [13]. Суспензионные среды состоят преимущественно из сильных электролитов (хлорид натрия и др.), полностью диссоциированных на ионы независимо от температуры раствора. Осмотическое давление Р для сильных электролитов
Р = пСЯТ, (2)
где п - количество ионов, образованных из каждой молекулы растворенного соединения; С - концентрация вещества; Я - газовая постоянная; Т - абсолютная температура. Следовательно, с увеличением температуры осмотическое давление раствора для сильных электролитов возрастает из-за повышения подвижности ионов, а не за счет увеличения их концентрации.
В состав внутренней среды клеток наряду с сильными электролитами входят также слабые полиэлектролиты (белки, нуклеиновые и аминокислоты и другие соедине-
0
ния) с относительно низкой константой электролитической диссоциации. Поэтому при повышении температуры рост величины осмотического давления для растворов слабых полиэлектролитов (например, белков) будет определяться не только увеличением подвижности ионов, но и их числа за счет дополнительной внутри- и межмолекулярной диссоциации, вызванной температурным повышением констант электролитической диссоциации [13]:
"Л
Г
Р = ШС1 +
V
кт + в
С
ЯТ, (3)
где Р - осмотическое давление; 0 - осмотический коэффициент для неидеальных растворов; С - концентрация вещества; Q - тепловой эффект реакции; В - постоянный коэффициент, не зависящий от температуры; Я - газовая постоянная; Т - абсолютная температура раствора.
Следовательно, повышение температуры вызывает более интенсивное увеличение осмотического давления содержимого клеток, чем давления суспензионной среды. В результате эритроциты подвергаются гипоосмотическому воздействию, степень которого будет определяться величиной температуры нагрева, ее перепадом и скоростью нагрева.
Будем считать, что при воздействии лазерного излучения температура суспензионной среды не изменяется, так как коэффициент ее поглощения пренебрежимо мал по сравнению с коэффициентом поглощения гемоглобина эритроцитов, т.е. примем, что при облучении образца крови происходит локальный фотоиндуцированный нагрев содержимого эритроцита.
Таким образом, поглощение эритроцитами оптического излучения, вызывающее их фотоиндуцированный нагрев, приводит к увеличению осмотического давления содержимого клеток по сравнению с осмотическим давлением среды, что аналогично помещению эритроцитов в гипоосмотический раствор. При этом происходит набухание эритроцитов и, при соответствующих значениях плотности мощности излучения и длительности воздействия, их гемолиз (фотоиндуцированный термогемолиз эритроцитов).
Варьируя длину волны излучения, мощность и длительность облучения, можно изменять степень теплового, а значит и гипоосмотического воздействия, т.е. контролировать процесс набухания эритроцитов и момент наступления гемолиза. Действие оптического излучения с различными характеристиками на эритроциты, находящиеся в изотоническом растворе, будет аналогично помещению эритроцитов в гипоосмотиче-ские растворы различной концентрации.
е
Модель расчета жесткости эритроцитарных мембран в условиях фотоиндуцированного набухания
Как известно [5,6], процесс набухания эритроцитов в гипоосмотических растворах за счет поступления внутрь них воды состоит из двух стадий. На первом этапе происходит увеличение объема эритроцита без изменения площади его поверхности (диско-цит трансформируется в сфероцит). На втором сферулированный эритроцит продолжает увеличиваться в объеме за счет растяжения мембраны, испытывая избыточное внутреннее осмотическое давление, вплоть до момента наступления гемолиза.
Диаметр эритроцитов здорового человека может варьироваться в пределах от 6,5 до 9 мкм (средние значения 7,5-7,9 мкм) [1,2]. Будем считать средний диаметр эритроцита равным 7,7 мкм. При моделировании сечения эритроцита овалом Кассини [1] для среднего значения радиуса 3,85 мкм получим первоначальные объем Уэ=71,1 мкм3 и
Ясф -
5Сф V* -4 РЯ1, (4)
4л' сф 3 сф
площадь поверхности 8Э=142,5 мкм . Примем эти значения за исходные, тогда для момента, когда эритроцит примет сферическую форму,
А
где Ясф, £сф, Усф - соответственно радиус, площадь и объем эритроцита, принявшего сферическую форму. Тогда Ясф = 3,37 мкм, £сф = 142,5 мкм2, ¥сф = 160,1 мкм3.
Во второй фазе гипоосмотического набухания сферулированный эритроцит увеличивается в объеме за счет растяжения мембраны, которая способна растягиваться вплоть до наступления гемолиза, увеличивая свою площадь по разным данным на 8-14% [2, 5]. Будем считать, что в среднем к моменту наступления гемолиза площадь сферулированного эритроцита увеличивается на 10 %. Тогда, считая за исходную площадь поверхности сферулированного эритроцита £сф = 142,5 мкм2, получаем площадь поверхности сфероцита в момент гемолиза £г = 156,75 мкм2, радиус Яг = 3,53 мкм, объем Ут = 184,16 мкм .
Установим аналитическую связь между избыточным давлением внутри эритроцита и изотропным поверхностным напряжением в мембране. Будем рассматривать эритроцит как тонкостенную сферу (для эритроцита Я ~ а ~ Ь, где а и Ь - соответственно внутренний и внешний радиусы сферы), к которой приложены внешнее давление Рр и внутреннее Рэ. Тогда тангенциальное растягивающее напряжение, действующее в оболочке сферы на расстоянии Я от центра сферы, определяется следующим образом [5]:
а ( - ЯАР /(а - Ь), (5)
где АР = Рэ - Рр. Числитель в полученном выражении является изотропным поверхностным напряжением Т, т.е.
т - 38 ядр. (6)
Т является функцией радиуса эритроцита, изменяющегося в процессе гипоосмотического набухания, и избыточного давления, действующего внутри клетки. Для мембраны эритроцитов справедливо следующее соотношение: Т — КД8 / 5сф, где К - поверхностная жесткость мембраны, Д£ - абсолютное приращение площади поверхности мембраны эритроцита при набухании [5]. Отсюда получаем, что равновесные состояния эритроцита в результате его гипоосмотического набухания будут описываться соотношением:
38 Яг ДРг - КД$г / , (7)
где Яг - текущее равновесное значение радиуса эритроцита, А$г = 5г - £сф - абсолютное приращение площади поверхности эритроцитарной мембраны, 5г - соответствующее радиусу Яг значение площади ее поверхности. Значение АРг определяется как разность внутреннего и внешнего давлений, приложенных к мембране эритроцита. Так как при воздействии оптического излучения происходит локальный фотоиндуцированный нагрев внутренней среды эритроцита и, следовательно, увеличение давления только внутри эритроцита, то величину АРг можно определить как разность давлений внутри эритроцита до Р и после Рэ воздействия:
ДРг - РЭ2 - РЭ1, (8)
где Рэ , Рэ определяются из выражения (3). Выразим значения площадей мембран
эритроцитов через их радиус, тогда:
38 я др - к
' Я Л 2
V ЯсФ 0
- 1
(9)
Отсюда получаем выражение для жесткости эритроцитарной мембраны:
где R
текущии относительный радиус эритроцита.
Заключение
Предложенная модель фотоиндуцированного термогемолиза эритроцитов, вызванного их гипоосмотическим набуханием вследствие воздействия оптического излучения на эритроциты, может быть использована для оценки деформируемости эритроцитов и измерения жесткости эритроцитарных мембран. Это имеет большое значение для экспресс-контроля деформируемости эритроцитов как при диагностике, так и в динамике течения заболевания. Использование только изотонического раствора позволит сократить время проведения измерений жесткости эритроцитарных мембран по сравнению с методикой, использующей гипоосмотические растворы различных концентраций.
1. Левтов В.А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х. Реология крови. М.: Медицина, 1982.
2. Черницкий Е.А., Воробей A.B. Структура и функции эритроцитарных мембран. Мн.: Наука и техника, 1984.
3. Методы исследования агрегации, вязкости и деформируемости эритроцитов. Под ред. Федоровой З.Д. Л.: НИИ гематологии и переливания крови, 1989.
4. Козинец Г.И., Сарычева Т.Г. Оценка деформабельности эритроцитов методом фильтрации // Лабораторное дело. 1990. №11. С.15.
5. Петренко Ю.М., Владимиров Ю.А. Изменение размеров эритроцитов при их набухании в гипоосмотических средах // Биофизика. 1987. Т.32. №3. С. 448- 453.
6. Бессмельцев С.С., Скворцова Ю.А., Тарлыков В.А. Исследование жесткости мембраны эритроцитов у больных с множественной миеломой на фоне терапии, включающей лечебный плазмаферез // Эфферентная терапия. 2000. Т.6. №1. С. 36-41.
7. Калинин Л.Г., Бошкова И.Л. Физическая модель отклика растительной ткани на воздействие микроволнового электромагнитного поля // Биофизика. 2003. Т.48. №1. С.122-124.
8. Исследование влияния фотодинамического эффекта на микроорганизмы методом лазерной термооптической цитометрии / Лапотко Д.О., Жаров В.П., Романовская Т Р., КучинскийГ.С. // Квантовая электроника. 1999. 29. №3. С. 221-226.
9. Волков Е.И., Полежаев A.A. Плазматическая мембрана как мишень действия гипертермии // Успехи современной биологии. 1983. Т.96. №3(6). С. 353-365.
10. Ямайкина И.В., Мансуров В.А., Ивашкевич Э.В. Температурная денатурация спектр ина эритроцитов: реология, деформируемость и детергентоустойчивость // Биофизика. 1997. Т.42. №3. С. 675 - 679.
11. Александров В.Я. Клетки, макромолекулы и температура. Л.: Наука, 1975.
12. Ямайкина И.В., Черницкий Е.А. Денатурация гемоглобина - первая стадия термо-гемолизаэритроцитов // Биофизика. 1989. Т.34. №4. С. 656-659.
13. Морозов И.И. Термическое повреждение клеток и их осмотический гомеостаз // Медицинскаярадиология. 1992. Т.37. №11-12. С. 39-42.
14. Джонсон (C.C. Johnson), Гай (A.W. Guy). Воздействие неионизирующего электромагнитного излучения на биологические среды и системы // ТИИЭР. 1972. Т. 60.
Литература
№6. С. 49-82.
