CC BY
584
ТОМ 1
НОМЕР 1
ЯНВАРЬ - МАРТ 2008
КЛИНИЧЕСКАЯ
О. її/ч СЕМИНАР ПО ОНКОЛОГИИ
НКиГЕМАТОЛОГИЯ
Многоликий р53: разнообразие форм, функций, опухольсупрессирующих и онкогенных активностей
Б. П. Копнин [1], П. Б. Копнин [2], Н. В. Хромова [1], Л. С. Агапова [1] _____________________РЕФЕРАТ_______________
Изменения функции белка р53 являются одним из наиболее универсальных молекулярных изменений в клетках различных новообразований. Широкая вовлеченность аномалий р53 в развитие разных типов опухолей обусловлена выполнением этим белком ряда функций, предотвращающих и/или ингибирующих опухолевый рост. Наряду с этим он обладает некоторыми активностями, которые могут стимулировать опухолевую прогрессию. Это, как и многообразие нормальных и патологических форм белков р53, затрудняет использование р53 в качестве прогностического маркера и мишени терапевтических воздействий. Тем не менее в последние годы получен ряд результатов, позволяющих надеяться на разработку новых эффективных способов предсказания клинического течения и терапии новообразований, основанных на высокотехнологичных и более точных методах анализа р53 и модуляции его активностей.
Ключевые слова
опухолевый супрессор р53, транскрипционные факторы, мутагенез, опухолевая прогрессия
Multifaced р53: variety of forms, functions, tumor-suppressive and oncogenic activities
B.P. Kopnin [1], P.B. Kopnin [2], N.V. Khromova [1],
L.S. Agapova [1]
Summary:
Dysfunction of p53 protein is one of the most universal molecular alterations in various human neoplasias. Frequent involvement of p53 abnormalities in development of different types of tumors is due to its several activities preventing and/or inhibiting tumor growth. Alongside with tumor-suppressive functions p53 possesses some activities which can stimulate tumor progression. Such dualisms, as well as the big variety of normal and pathological forms of p53 proteins, complicate the use of p53 as a prognostic marker or a target for therapeutic interventions. Nevertheless, some recent results give hopes for development of new effective methods of a prediction and therapy of oncological diseases which will be based on hi-tech and more exact methods of the analysis and modulation of p53 functions.
Keywords:
p53 tumor suppressor, transcription factors, mutagenesis, tumor progression.
[1] Institute of Carcinogenesis, Blokhin Memorial Russian Cancer Research Center, RAMS, Moscow; [2] Engelhardt Institute of Molecular Biology, RAS, Moscow
Контакты: [email protected]
ВВЕДЕНИЕ
Огромный интерес онкологов к белку р53 обусловлен тем, что нарушение его функции является наиболее универсальным молекулярным изменением в различных новообразованиях человека. Дисфункция р53 обнаруживается в значительной части опухолей более чем 60 разных типов, в том числе при различных формах лейкозов и лимфом. В большинстве этих случаев нарушения функционирования р53 обусловлены соматическими мутациями его гена TP53, произошедшими либо в клетках, из которых впоследствии возникли неопластические клоны, либо уже в опухолевых клетках в ходе прогрессии новообразования. Герминальные (т. е. произошедшие в половых клетках и передающиеся по наследству) мутации гена ТР53, приводящие к синтезу неполноценного белка во всех клетках организма, вызывают синдром Ли— Фраумени, заключающийся во врож-
денной предрасположенности к развитию в молодом возрасте различных новообразований, в первую очередь сарком, рака молочной железы, лимфолейкоза. Нередко синдром Ли— Фраумени характеризуется возникновением первично-множественных опухолей.
К середине 1990-х годов сформировалась довольно стройная система представлений, согласно которым р53 за счет ряда своих активностей предохраняет организм от накопления в нем потенциально опасных аномальных клеток с различными повреждениями генома. Потеря или ослабление этой функции в тех или иных клетках организма резко увеличивает вероятность их злокачественного перерождения и развития из них новообразований. Нарушение функционирования р53, происходящее в ходе опухолевой прогрессии, может придавать неопластическим клеткам дополнительные селективные преимущества, в частности повышен-
2
[1] НИИ канцерогенеза, ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина, РАМН, Москва;
[2] Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта, РАН, Москва
Белок p53
ную приспособляемость к меняющимся условиям микроокружения и устойчивость к различным терапевтическим воздействиям.
Однако продолжающиеся накапливаться данные значительно усложнили эти представления. Так, обнаружено, что ген ТР53 помимо основной полноразмерной формы белка р53 кодирует ряд его укороченных изоформ, отличающихся по биологическим активностям от «классического» белка р53. Выяснилось также, что в дополнение к своим защитным функциям р53 участвует в регуляции миграции и морфогенетических реакций по крайней мере некоторых типов клеток, и потеря этих его активностей может, наоборот, оказывать ингибирующее действие на развитие опухолей. Существенную модуляцию функциональной активности р53 и его молекул-мишеней могут осуществлять различные изоформы белков р63 и p73, кодируемые генами TP63, TP73, имеющими высокую степень гомологии с TP53. Все это вносит дополнительные трудности в использование р53 в качестве маркера для прогнозирования течения онкологических заболеваний или мишени терапевтических воздействий. Ниже кратко рассмотрен ряд аспектов этой все усложняющейся картины.
СТРОЕНИЕ, ФОРМЫ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ АКТИВНОСТИ БЕЛКОВ р53
Полноразмерный белок р53 человека состоит из 393 аминокислотных остатков (а.о.), кодируемых 10 экзонами гена ТР53 (всего в составе гена ТР53, простирающегося на ~20 тысяч пар оснований на коротком плече хромосомы 17, 11 экзонов, но 1-й экзон кодирует нетранслируемую мРНК). В полипептидной цепи р53 принято выделять несколько структурно-функциональных доменов: N-концевой трансактивационный, подразделяющийся на 2 субдомена (а.о. 1—42 и 43—62), пролинбогатый (а.о. 63—94), центральный ДНК-связывающий (а.о. 94—292), олигомериза-ционный (а.о. 325—356) и С-концевой регуляторный (а.о. 363-393).1-3 Трансактивационный домен связывает целый ряд белков: белок Mdm2, осуществляющий негативную регуляцию р53; компоненты инициальных транскрипционных комплексов; ацетилтрансферазы р300 и СВР, ацетилирую-щие не только гистоны, но и С-конец самого р53, что вызывает его активацию; и т.д. Пролинбогатый домен содержит БН3-связывающий мотив (PXXP), взаимодействующий со многими регуляторными белками. ДНК-связывающий домен специфически связывается с двуцепочечной ДНК регулируемых генов, так называемыми р53-респонсивными элементами, состоящими из расположенных друг за другом последовательностей с обобщенной структурой типа PuPuC(A/T)(A/T)GPyPyPy (Pu — пурин, Py — пиримидин) (один р53-респонсивный элемент связывается с четырьмя ДНК-связывающими доменами р53, функционирующего в виде тетрамерного комплекса). При этом аффинность связывания р53 с разными респонсивными элементами варьирует в зависимости от их конкретной нуклеотидной последовательности (например, с генами, контролирующими клеточный цикл, р53, как правило, связывается лучше, чем с генами, индуцирующими апоптоз). Олигомеризацион-ный домен ответственен за образование димерных и тетрамерных комплексов молекул р53. С-концевой домен может осуществлять негативную регуляцию функции р53, препятствуя связыванию ДНК-связывающего домена со специфической последовательностью регулируемого гена.
Значительное число сайтов белка р53 может подвергаться различным пост-трансляционным модификациям (фосфорилирование, ацетилирование и др.), в результате чего конформация (пространственная структура) и, как следствие, активности его молекул могут претерпевать зна-
чительные изменения.1-4 Так, при фосфорилировании и ацетилировании определенных сайтов N- и С-концевых участков молекул р53 ДНК-связывающие домены их тетрамерных комплексов приобретают способность связываться с р53-респонсивными элементами, что, в свою очередь, обеспечивает взаимодействие базовых факторов транскрипции с N-концевыми участками р53 и стимуляцию транскрипции мРНК генов-мишеней. При приобретении других конфор-мационных состояний р53 проявляет совершенно иные активности, в частности, он способен подавлять транскрипцию других групп генов-мишеней, стимулировать репарацию ДНК и подавлять репликацию ДНК вирусов.
Недавно выяснилось, что р53 может синтезироваться в виде различных изоформ,3 что вносит еще большее разнообразие в его возможные активности. Дело в том, что транскрипция гена ТР53 может начинаться не только с сайта, расположенного перед 1-м экзоном, но и с внутреннего сайта в
4-м интроне, в результате чего будет образовываться укороченный белок, начинающийся со 133-го кодона (изоформа A133p53). Кроме того, 9-й интрон может подвергаться альтернативному сплайсингу, давая три изоформы, две из которых (р53в, p53y) не содержат олигомеризационного домена. В результате этого, а также альтернативной инициации трансляции или альтернативного сплайсинга в интроне 2, ген ТР53 может кодировать по меньшей мере 9 разных изоформ, различающихся по своим активностям. Экспрессия этих вариантных форм р53 имеет тканеспецифический характер, что, несомненно, определяет различия в активности ряда р53-регулируемых сигнальных путей в клетках разной дифференцировки.3 Следует заметить, что существует два нормальных аллельных варианта человеческого гена TP53, белковые продукты которых отличатся по 72-му кодону (содержат в этом положении либо пролин [72P], либо аргинин [72R]), и, как следствие, имеют некоторые различия трехмерной структуры и биологической активности.5 Встречаемость таких аллелей варьирует в зависимости от этнической принадлежности. Так, частота аллеля 72P составляет 60% у афроамериканцев и 30—35% у белого населения США.
В дополнение к гену ТР53 в геноме человека присутствуют 2 гена — TP63 и TP73, белковые продукты которых имеют высокую степень сходства с белком р53 (вместе они составляют семейство белков р53).3,6,7 В отличие от р53, который экспрессируется в клетках практически всех тканей, его гомологи продуцируются только в части клеточных типов. При этом, подобно TP53, гены TP63 и TP73 кодируют по несколько белков (35 изоформ р73 и не менее 6 изоформ р63), различающихся по структуре и способности активировать гены-мишени. Так, некоторые их формы (так называемые ТА-формы р63 и р73) способны повышать транскрипцию примерно половины из р53-регулируемых генов и большую группу других, не регулируемых р53 генов, тогда как AN-формы р6З и р73, наоборот, подавляют активность многих р53-, р6З- и р73-респонсивных генов, конкурируя с р53 и ТА-формами р63/р73 за связывание с генами-мишенями.6,7
АКТИВНОСТИ р53, ПРЕДОТВРАЩАЮЩИЕ И/ИЛИ ИНГИБИРУЮЩИЕ ОПУХОЛЕВЫЙ РОСТ
р53 играет важную защитную роль. Его нормальное функционирование резко уменьшает вероятность накопления в организме аномальных клеток с различными изменениями генома, в том числе и теми, которые способствуют неопластической трансформации клеток и/или прогрессии возникших опухолевых клонов. Такая охранная функция белка р53 обусловлена несколькими его активностями, основанными,
www .medprint.ru
3
Б.П.Копнини соавт.
прежде всего, на способности регулировать транскрипцию большой группы генов, белковые продукты которых выполняют ряд физиологических функций (рис. 1, а). Во-первых, стимулируя синтез белков, участвующих в детоксикации активных форм кислорода (АФК), р53 предохраняет клетки от оксидативного стресса и вызываемого им мутагенеза.8 Во-вторых, функционируя как транскрипционный фактор и, кроме того, вступая в различные белок-белковые взаимодействия, р53 осуществляет позитивную регуляцию различных систем репарации поврежденной ДНК.9 В-третьих, в результате участия в контроле репликации центриолей полноценное функционирование р53 предотвращает амплификацию центросом и многополюсные митозы, что обеспечивает правильное распределение хромосом по дочерним клеткам во время митоза.10 И, наконец, в четвертых, при различных внешних повреждающих воздействиях и/или внутриклеточных стрессах молекулы р53 вследствие определенных посттрансляционных модификаций (фосфорилирование Ser15, Ser20, Ser33, Ser46, Thr81, Ser315; ацетилирование Lys373, Lys382; и др.)1,4,11 приобретают так называемую «стрессовую» конформацию и, как следствие, повышенную стабильность (внутриклеточное содержание такого р53 резко увеличивается) и более выраженную способность изменять
активность генов, продукты которых останавливают клеточный цикл или индуцируют апоптоз (рис. 1, б). Апоптоз, кроме того, индуцируется транспортом стабилизированного белка р53 в митохондрии, что приводит к повышению проницаемости их мембран и усиленному выходу из них апоптоген-ных молекул — цитохрома С и др.12 Таким образом, клетки, в которых уже возникли или могут возникнуть перестройки
генома или другие аномалии, либо погибают, либо останав-
ливают свое размножение для репарации повреждений. При этом в эмбриональных стволовых клетках «стрессовый» р53 индуцирует также репрессию гена NANOG и, как следствие,
утрату ими способности к самоподдержанию и дифференци-
ровке.1
р53
Изменения транскрипции респонсивных генов
X I \
б
«Латентная»
форма
Антиоксидантная защита;
Повреждения ДНК (УФ - и у-облучение, N0, кислородные радикалы, недостаток нуклеотидов), тепловой / ХОЛОДОВОЙ шок, гипоксия, вирусная инфекция, экспрессия онкогенов
подавление гликолиза, репарация ДНК
Регуляция миграции и дифференцировки клеток, подавление ангиогенеза
«Стрессовая»
форма
Остановка клеточного цикла Апоптоз
Рис. 1. Гены-мишени (а) и алгоритм функционирования (б) р53. Объяснения в тексте.
Выбор между этими двумя возможными реакциями клетки на активацию р53 (остановка клеточного цикла или апоптоз) зависит от множества факторов:4,14 а) гистогенетического типа клеток (например, в нормальных фибробластах, как правило, наблюдается остановка клеточного цикла, тогда как в лимфоцитах — апоптоз); б) функциональной активности сигнального пути pRb-E2F (в фибробластах c инактивированным pRb или гиперэкспрессированными Myc, E2F наблюдается не остановка в G1, а апоптоз); в) степени активации р53 (с увеличением уровня его экспрессии повышается вероятность апоптоза); г) преимущественной экспрессией определенных изоформ р53, различающихся по способности активировать проапоптотические гены и, как следствие, индуцировать апоптоз; д) присутствия в клетке транскрипционных кофакторов (ASPP1/2, р63/р73 и др.), увеличивающих способность р53 избирательно активировать проапоптоти-ческие гены. Еще одним фактором, определяющим выбор между остановкой клеточного цикла и апоптозом, является характер модификации самих молекул р53. Так, р53, фосфо-рилированный по Ser15/20 и ацетилированный по С-концу, способен активировать ген p21Waf1/Cip1 и вызывать остановку клеточного цикла в G1, тогда как дополнительное фосфорилирование по Ser46 придает ему способность активировать наряду с геном p21Waf1/Clp1 и ген белка р53А1Р1, а в этом случае уже наблюдается апоптоз. Причем вероятность фосфорилирования Ser46 повышается с увеличением интенсивности повреждений ДНК.
Опухольсупрессирующие активности р53 не ограничиваются поддержанием целостности генома и подавлением размножения/элиминацией потенциально опасных аномальных клеток. Так, благодаря способности репрессировать ген hTERT,15 кодирующий каталитическую субъединицу теломе-разы, и ряду других активностей р53 препятствует имморта-лизации клеток, т. е. приобретению ими способности делиться неограниченное число раз. Регулируя синтез ряда белков с ангиогенными и антиангиогенными активностями (рис. 1), р53 ингибирует образование в опухолевых узелках крове -носных сосудов, снабжающих неопластические и стромальные клетки кислородом и питательными веществами. Кроме того, его активность необходима для нормальной дифферен-цировки некоторых типов клеток16 и блокирования гликолиза17 (переход от аэробного дыхания к гликолизу — характерная черта опухолевых клеток, позволяющая им не только решать энергетические проблемы в условиях гипоксии, но и ингибировать апоптоз.18,19
Неудивительно поэтому, что инактивация функции р53 резко увеличивает вероятность развития опухолей.20,21 Практически у всех трансгенных мышей с нокаутом обоих аллелей гена p53 (p53-/-), приводящим к полному отсутствию белка р53 во всех клетках организма, в возрасте 2—10 мес развиваются злокачественные новообразования — в основном В- и Т-клеточные лимфомы (70—80%) и, кроме того, различные саркомы и герминальные опухоли. У мышей с нокаутом только одного аллеля (p53+/-) и пониженным содержанием белка р53 во всех клетках также повышен риск возникновения опухолей, но они развиваются позже и не у всех животных (~75% мышей в возрасте 9—18 мес). При этом существенно меняется спектр возникающих новообразований — основными формами (~60%) являются саркомы (остеосаркомы, фибросаркомы, рабдомиосаркомы, лейоми-осаркомы, гемангиосаркомы, анапластические саркомы). Также развиваются опухоли мозга, аденокарциномы легкого, гепатокарциномы, а развития лимфом — основной формы новообразований у мышей p53-/-----не отмечается.21
Следует подчеркнуть, что у трансгенных мышей с дополнительной копией генар53 (р53 +/+/+) и повышенным син-
4
Клиническая онкогематология
Белок p53
a s 70 0
§ 60 о 50
U
О
о;
х
=г
X
0
=г
и
0
о.
о
>
с,
е
40
30
20
10
0
Контроль
р53+/+
Контроль NAC
р53-/-
индивидуальные мыши
Рис. 2. Влияние изменений внутриклеточного уровня активных форм кислорода (АФК) на возникновение лимфом и продолжительность жизни мышей C57BI с гомозиготным нокаутом гена р53.
а - изменения внутриклеточного уровня АФК, измеряемого по флюоресценции 2’-7’-дихлордигидрофлюоресцеиндиацетата (DCF), в клетках селезенок мышей с гомозиготным нокаутом р53 (р53-/-), не получавших (контроль) и получавших антиоксидант N-ацетилЖ-аспартат (NAC, 1 г/кг/сут с питьевой водой). Показан уровень АФК у каждой из проанализированных мышей.
б - продолжительность жизни р53-/- мышей, получавших NAC (19 животных) несколько увеличилась по сравнению с контрольными р53-/- мышами (17 животных), но была значительно меньше, чем у мышей дикого типа (р53+/+). При вскрытии у всех 36 р53-/- мышей были обнаружены лимфомы (тимомы и другие формы).
тезом белка во всех клетках организма риск развития опухолей, индуцируемых химическими канцерогенами, наоборот, ниже, чем у мышей дикого типа (р53+/+).22
Очевидно, ни одна из указанных биологических активностей р53 сама по себе не может обеспечить мощный опухоль-супрессирующий эффект его полноценного функционирования. Так, значительное подавление апоптогенной активности р53 в результате нокаута гена PUMA практически не увеличивало вероятность развития опухолей.23,24 Не наблюдалось увеличения частоты опухолей и у животных с нокаутом гена p2ICipi/Wafl — ключевого медиатора ингибирующего эффекта р53 на клеточный цикл.25 Мы обнаружили, что нивелирование эффекта инактивации р53 на внутриклеточный уровень АФК путем применения антиоксиданта ^ацетил^-аспартата (NAC) лишь несколько замедляет развитие лимфом у мышейp53-/-, но не влияет на частоту их возникновения (рис. 2).
В отличие от инактивации р53, нокаут генов, кодирующих другие члены семейства р53 — р63 и р73, не увеличивает у мышей риск развития новообразований.26 При нокауте обоих аллелей гена р63 наблюдается резкое уменьшение пула эпителиальных стволовых клеток и пренатальная или постнатальная гибель эмбрионов вследствие полного отсутствия кожи и других эпителиальных тканей. При нокауте гена р73 рождаются мыши с дефектами вомеро-назального органа (такие мыши не воспринимают сигналы от феромонов), нарушениями слуха, зрения и др., у которых, однако, продолжительность жизни не уменьшена. Более того, поскольку как и р63, р73 преимущественно экспрессируются в виде транскрипционно-неактивных А N-форм, ингибирующих транскрипционную активность р53 и его гомологов (Ар63 главным образом в стволовых и недифференцированных эпителиальных клетках, а Ар73 в незрелых эпителиоци-тах и клетках нейрогенного происхождения), предполагается, что они обладают онкогенным, а не опухольсупрессирующим потенциалом.27 В пользу такой точки зрения свидетельствует и повышение уровня экспрессии А N-форм р63 и р73 в части новообразований человека.
АКТИВНОСТИ р53, СПОСОБНЫЕ СТИМУЛИРОВАТЬ ОПУХОЛЕВУЮ ПРОГРЕССИЮ
Еще одной большой группой генов-мишеней р53, являются гены, продукты которых регулируют морфологическое стро-
ение и двигательную активность клеток. Так, р53 способен активировать транскрипцию генов ряда митогенных/мото -генных факторов: обоих представителей семейства рассеивающих (Scatter) факторов (HGF/SF и HGFl/MSP), ген одного из членов семейства эпидермальных факторов роста (HB-EGF, кодирует гепаринсвязывающий EGF) и их рецепторов (HGF/SF-R (Met), EGF-R; рис. 1). Кроме того, р53 регулирует экспрессию хемокина фрактал кина, гладкомышечного а-актина, матриксных металлопротеаз и др. Физиологическое значение такой регуляции пока не совсем понятно (предполагается, что она может играть существенную роль в процессах дифференцировки клеток и воспаления),28,29 но очевидно, что ее нарушения могут оказывать заметное воздействие на прогрессию опухолей. Дело в том, что важнейшим свойством многих типов неопластических клеток является повышенная миграционная способность, лежащая в основе инвазии (проникновения в окружающие нормальные ткани) и метастазирования (образование вторичных очагов опухолевого роста). Ранее мы обнаружили, что потеря экспрессии р53 приводит к существенному снижению миграционной способности самых разных типов клеток — нормальных фибробластов, кератиноцитов, макрофагов, клеток рака легкого и ободочной кишки. С другой стороны, повышение активности р53, вызываемое, в частности, рядом стрессов, наоборот, увеличивает миграционную способность клеток.30
Ключевым механизмом воздействия р53 на двигательную способность разных типов клеток является модификация функциональной активности белка Rac1, представителя Rho-семейства малых ГТФаз, ответственного за протрузию
Рис. 3. Влияние гомозиготного нокаута гена TP53 в клетках рака ободочной кишки человека линии HCT116 на: а — внутриклеточное содержание функционально активных ГТФ-связанных форм белка Rac1 и инвазивную способность клеток in vitro (миграция через покрытые матригелем фильтры с диаметром пор 8 мкМ); б — уровень мРНК, кодируемых генами MIG-7 и VEGF-C (измерялся с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР, уравнивание нанесенных проб контролировалось по уровню мРНК а-тубулина); в — внутриклеточное содержание белка Е-кадгерина (Вестерн-блот анализ) и выраженность межклеточных контактных структур, содержащих Е-кадгерин (иммунофлюоресцентный анализ). Объяснения в тексте.
www.medprint.ru
5
Б.П.Копнин и соавт.
Рис. 4. Суммарное распределение мутаций по кодонам р53 во всех исследованных новообразованиях человека (по базе данных Международного агентства по изучению рака - IARC http://www.iarc.fr/p53/).
ламеллоподий и направленное движение клетки.30 При этом р53 не регулирует синтез и содержание белка Rac1 в клетке, но резко увеличивает его ГТФ-связанную функционально активную фракцию (рис. 3, а), по-видимому, за счет более эффективного проведения сигналов от рецепторов митогенов/ мотогенов к фосфоинозитид-3-киназам (PI3K), осуществляющим позитивную регуляцию функции белка Rac1.30 Механизмы такой активности р53 пока изучены довольно плохо. Не исключено, что существенную роль в ней может играть недавно обнаруженная нами способность р53 трансактиви-ровать ген MIG-7 (Migratory protein 7; рис. 3, б), белковый продукт которого стимулирует мотогенный эффект HGF/SF и других факторов.31 Интересно, что экспрессируясь во многих типах опухолевых клеток, белок Mig-7 обнаруживается только в одном типе нормальных клеток организма — ци-тотрофобластах плаценты, обладающих, подобно неопластическим клеткам, способностью к инвазии и стимуляции образования сети кровоснабжающих сосудоподобных структур, которые в отличие от истинных сосудов не содержат эндотелиальных клеток (так называемая «васкулогенная мимикрия).32-34
В эпителиальных клетках р53-зависимая регуляция миграционной способности включает также модуляцию экспрессии на поверхности клетки белка Е-кадгерина, образующего межклеточные контакты. Как известно, подавление экспрессии Е-кадгерина и связанное с ним разрушение межклеточных контактов — важнейший элемент так называемой эпителиально-мезенхимальной транзиции, ответственной за повышение миграционной способности и инвазию раковых клеток.35,36 р53, подобно ряду классических онкогенов (RAS и др.), уменьшает содержание белка Е-кадгерина, а инактивация р53 в опухолевых клетках может приводить к восстановлению межклеточных контактов, сопровождающемуся уменьшением инвазивной способности (рис. 3, в).
И, наконец, регулируя активность гена VEGF-C (рис. 3,
б), р53 может стимулировать размножение и миграцию не только некоторых типов опухолевых клеток, но и лимфатического эндотелия, индуцируя таким образом лимфангио-генез в опухоли и региональных лимфоузлах. В результате могут увеличиваться скорость лимфотока, дренаж опухолевых клеток и, как следствие, лимфогенное метастазирова-ние.37,38
ИЗМЕНЕНИЯ АКТИВНОСТЕЙ р53 В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ
В значительной части (35—60 %) опухолей более чем 60 различных типов, в том числе в наиболее распространенных, обнаруживаются мутации гена ТР53.39-42 В клетках лейкозов и лимфом частота мутаций ТР53 несколько ниже —~10 и ~30% соответственно. В отличие от других опухолевых супрессоров, для которых характерны мутации, прекращающие синтез белка (делеции, образование стоп-кодонов, сдвиг ко-
Рис. 5. Различия в распределении мутаций по кодонам р53 при разных формах опухолей (по базе данных http://p53.free.fr/).
дирующей рамки, нарушения сплайсинга мРНК), подавляющее большинство (более 90%) мутаций ТР53 представляет собой миссенс-мутации, приводящие к замене одной из аминокислот в белковой молекуле на другую. Еще одной особенностью мутаций р53 в опухолевых клетках является то, что они в отличие от мутаций других опухолевых супрессоров часто являются гетерозиготными, т. е. поражают только один из двух аллелей гена.
6
Клиническая онкогематология
Белок p53
Мутации обнаруживаются в разных участках молекулы р53, но чаще всего в его эволюционно консервативном ДНК-связывающем домене, причем с наибольшей частотой в кодонах 175, 245, 248, 249, 273 и 282 (так называемые горячие точки; рис. 4). Интересно, что спектр мутаций несколько меняется в зависимости от типа опухоли. Например, в гепатокарциномах, вызываемых канцерогеном афлатокси-ном B1, преимущественно выявляются мутации кодона 249, а в раках легкого довольно часто обнаруживаются не характерные для других новообразований мутации в кодонах 157 и 158 (рис. 5). Такие различия могут отражать последствия воздействия определенных канцерогенных факторов. Так, афлатоксин В1 специфически связывается с кодоном 249 TP53, а связывающийся с ДНК метаболит канцерогенного компонента табачного дыма бенз(а)пирена имеет исключительно высокую аффинность к кодонам 157 и 158.42
Герминальные (произошедшие в половой клетке и передающиеся по наследству) мутации в одном из аллелей гена р53 вызывают, как уже упоминалось, синдром Ли—Фраумени, заключающийся во врожденном предрасположении к развитию в молодом возрасте различных новообразований, в первую очередь сарком, рака молочной железы, лимфолейкоза. При этом распределение таких мутаций по разным кодонам р53 не сильно отличается от распределения соматических мутаций при спорадических опухолях (рис. 4, 5).
Характерные для опухолевых клеток миссенс-мутации приводят к резкому изменению конформации молекулы белка р53, что в значительной степени затрагивает все вышеуказанные его активности: происходит потеря или ослабление способности связывать и активировать гены с р53-респонсивными элементами, репрессировать другие специфические гены-мишени, ингибировать репликацию ДНК и стимулировать репарацию ДНК.2,41,43,44 Причем, так как р53 образует тетрамерные комплексы, мутации в одном аллеле гена ТР53 вызывают инактивацию и продукта второго, неповрежденного аллеля. Дело в том, что коэкспрес-сирующиеся нормальный и мутантный белки р53 образуют неактивные гетеромерные комплексы. Таким образом, мутантный белок ингибирует функции нормального белка р53 по доминантно-негативному механизму.2,41 По-видимому, именно эта особенность мутантных р53 в значительной мере ответственна за их онкогенный потенциал. В пользу этого свидетельствует тот факт, что введение в клетки короткого полипептида, соответствующего олигомеризационному домену р53, нарушает образование полноценных тетрамерных комплексов р53 и вызывает опухолевую трансформацию. Необходимо заметить, что помимо утраты нормальных функций р53 мутантные р53 с аминокислотными заменами в горячих точках (кодоны 175, 248 и др.) приобретают новые свойства, не присущие белку р53 дикого типа.41,43,44 Так, описано приобретение мутантными р53 способности активировать промоторы протоонкогенов MYC и ERB1, антиа-поптотического гена BGL1 из семейства Bcl2, гена MDR1, детерминирующего множественную лекарственную устойчивость клеток и т. д. При этом степень проявления таких активностей мутантных р53 зависит как от конкретной аминокислотной замены, так и клеточного контекста (гистогенетического типа клеток, экспрессии других транскрипционных факторов и т. д.). Предполагается, что вновь приобретенные активности мутантных р53 обусловлены способностью некоторых их форм ингибировать по доминантно-негативному механизму активность других членов семейства р53 — белков р63 и р73, или взаимодействовать с другими транскрипционными факторами, с которыми нормальный р53 не связывается, и модифицировать экспрессию регулируемых ими генов.41,43,44
Мутации — не единственный путь нарушения функции белка р53 в опухолевых клетках. Так, для нейробластом и части случаев рака молочной железы (10—20 %) характерно нарушение транспорта р53 из цитоплазмы в ядро, где он проявляет свою функциональную активность. В части случаев остеосаркомы наблюдается амплификация гена белка Mdm2, который связывает и инактивирует белок р53. При раке шейки матки, ассоциированном с вирусами папиллом человека, происходит связывание р53 с вирусным онкобелком Е6, что вызывает деградацию белка р53 и т. д.
Характерные для опухолевых клеток аномалии р53 отменяют или ослабляют все важнейшие функции опухолевого супрессора р53.1,4,45 Его инактивация ведет к: а) менее эффективному функционированию внутриклеточных сигнальных систем, останавливающих при повреждениях клеточный цикл в G1- и Gj-фазах; б) подавлению индукции апоптоза; в) уменьшению эффективности репарации ДНК;
г) более эффективной адаптации к гипоксии и стимуляции ангиогенеза; д) ослаблению контроля над структурой теломер; е) ингибированию дифференцировки. Особо следует отметить возникновение в клетках с инактивированным р53 сильной генетической нестабильности, являющейся мотором дальнейшей опухолевой прогрессии. Потеря функциональной активности р53 значительно увеличивает темп появления размножающихся клеток с самыми разными генетическими аномалиями: измененным числом и перестройками хромосом, генными мутациями, амплификацией отдельных участков генома. Таким образом, мутации и другие изменения активности р53 вызывают одновременное появление целого набора характерных свойств неопластической клетки. Это, очевидно, и является объяснением такой частой встречаемости аномалий р53 в самых разных новообразованиях, в которых они могут являться как инициальным событием (синдром Ли—Фраумени) или детерминировать начальные этапы канцерогенеза, так и возникать и отбираться уже в ходе роста опухоли, обеспечивая приобретение новых агрессивных свойств и устойчивости к терапии. При этом одновременно может происходить инактивация и вышеописанных проонкогенных активностей р53, приводящая к ослаблению выраженности других злокачественных свойств клеток, в частности, их инвазивной активности. Очевидно, что в ходе опухолевой прогрессии эти неблагоприятные для развития опухолей последствия могут компенсироваться другими изменениями генома, восстанавливающими или даже увеличивающими проявления утрачиваемого признака.
р53 КАК ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ МАРКЕР И МИШЕНЬ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ВОЗДЕЙСТВИЙ
Участие функциональной инактивации р53 в ключевых этапах канцерогенеза и изменениях реакции неопластических клеток на различные стрессовые/повреждающие воздействия породило надежды на использование анализа статуса р53 в прикладных целях — для прогнозирования течения заболевания и/или ответа на химиотерапию. Кроме того, предпринимаются попытки разработать новые методы таргетной терапии, основанные на восстановлении/усилении нормальной функции р53.
К сожалению, результативность таких исследований пока оставляет желать лучшего, что связано с рядом обстоятельств, как объективных (существование множества изоформ р53, сложность их регуляции и многогранность выполняемых ими функций), так и субъективных (неадекватность использованных методов анализа статуса р53 во многих работах). Последнее, главным образом, связано с широким ис-
www .medprint.ru
7
Б.П.Копнини соавт.
пользованием иммуногистохимического окрашивания как единственного метода анализа. Работы с использованием такого подхода, во множестве проводившиеся в 1990-х годах, основывались на оказавшейся впоследствии ложной предпосылке, что позитивная реакция с антителами на р53 свидетельствует о присутствии мутантного р53, который, как правило, более стабилен, чем белок дикого типа. Однако проведенное позже прямое сопоставление результатов сек-венирования гена TP53 и иммуногистохимического анализа продемонстрировало отсутствие корреляции между содержанием белка р53 и мутациями его гена (позитивная окраска может быть обусловлена стрессиндуцированной стабилизацией белка дикого типа, а инактивирующие мутации TP53 могут уменьшать или не изменять содержание белка).46 Кроме того, недавно выяснилось, что использованные в этих работах антитела (DO1 и др.) не способны реагировать с рядом изоформ белка р53.3 Другая часто встречающаяся неадекватность методов детекции мутантного р53 заключалась в секвенировании только его центрального корового домена, что не позволяло выявить реже встречающиеся мутации других участков гена (неправильная классификация 10—20% случаев).46 И, наконец, работы не учитывали активность природного ингибитора р53 — белка Mdm2, связанную с полиморфизмом его гена у разных индивидуумов (впоследствии выяснилось, что присутствие определенных аллелей гена MDM2 сильно влияет на возраст, в котором у пациентов с синдромом Ли—Фраумени возникают опухоли).47 В результате более 500 опубликованных статей, в 400 из которых использовался иммуногистохимический анализ, содержали весьма противоречивые сведения о влиянии статуса р53 на прогноз заболевания.46
Тем не менее секвенирование полной последовательности гена TP53 позволило выявить ряд закономерностей, которые могут быть использованы для прогнозирования болезни. Так, показано, что мутации TP53 могут быть неблагоприятным прогностическим фактором при раке молочной железы, мочевого пузыря, опухолях головы и шеи46,48 (полный список таких публикаций содержится на вебсайте IARC http://www.iarc.fr/p53/). Менее выражена прогностическая значимость мутаций TP53 при раке легкого, пищевода, толстой кишки, а при опухолях мозга исследователи либо не нашли никаких корреляций, либо, наоборот, отметили более благоприятное течение заболеваний при мутациях TP53.46 Значение мутаций TP53 для прогнозировании течения различных форм лейкозов изучено недостаточно, хотя имеются единичные работы об их неблагоприятном характере 46,49,50
В значительной степени неблагоприятный прогноз при мутациях TP53 связан с меньшей эффективностью терапии. Так, опухоли молочной железы с мутантным TP53 хуже отвечают на доксорубицин, 5-фторурацил, тамоксифен.46,48 При
этом существенное значение может иметь то обстоятельство, в каком из полиморфных по кодону 72 аллельных вариантов гена TP53 произошла мутация. Например, показано, что опухоли головы и шеи с мутацией TP53 в аллеле 72R менее чувствительны к цисплатину, чем опухоли с точно такой же мутацией TP53 в аллеле 72R так как мутантный белок р53/72R эффективнее ингибирует функцию белка р73, ответственную за индукцию апоптоза при воздействии циспла-тина.51 Следует заметить, однако, что значение такого полиморфизма TP53 не универсально. Так, недавно появилось сообщение, что чувствительность к терапии В-клеточного хронического лимфолейкоза не зависит от полиморфизма р53 в кодоне 72.52
Существенным представляется также вопрос о значении конкретной аминокислотной замены в мутантном р53. Во многих работах продемонстрировано, что мутации в разных кодонах в различной степени инактивируют транскрипционную функцию р53 и, кроме того, придают ему разные новые активности. Зависимость прогноза от типа мутации р53 пока изучена довольно плохо, но, тем не менее, уже сейчас ясно, что мутации, нарушающие контакты р53 с ДНК (L2 и L3 петли ДНК-связывающего домена) оказывают более неблагоприятный эффект на чувствительность различных новообразований к химиотерапии.46 Безусловно, быстрое развитие и удешевление технологий секвенирования ДНК позволит в скором времени оценить прогностическое значение большинства часто встречающихся мутаций р53.
Исходя из ключевой роли нарушений функции р53 в развитии различных новообразований, многие исследователи предпринимают попытки разработать новые терапевтические подходы, основанные на восстановлении/усилении активности белка р53 в опухолевых клетках. Следует отметить ряд успешных попыток, в которых путем скрининга больших химических библиотек были выявлены низкомолекулярные соединения (PRIMA и др.), способные восстанавливать конформацию и/или активность мутантных р53 и реактивировать, таким образом, опухоль-супрессирующие функции р53.53,54 Найдены также соединения (нутлин и др.), блокирующие взаимодействие р53 с его природным ингибитором — белком Mdm2, что обеспечивает усиление функции белка р53 в опухолевых клетках, не несущих мутаций гена TP53.55 Кроме того, разработан оригинальный подход, позволяющий снизить токсичность радиотерапии для нормальных клеток организма путем временного выключения в них функции р53 с помощью низкомолекулярного соединения пифитрина.56 Многие из этих агентов находятся на разных стадиях предклинических и клинических испытаний, и хочется надеяться, что в скором времени в клиниках появятся новые таргетные препараты, существенно расширяющие возможности терапии новообразований путем модификаций функции мутантного или нормального р53.
ЛИТЕРАТУРА
1. Peller S., Rotter V. TP53 in hematological cancHarris S.L., Levine A.J. The p53 pathway: positive and negative feedback loops. Oncogene 2005; 24(17):2899-908.
2. Joerger A.C., Fersht A.R. Structure-function-rescue: the diverse nature of common p53 cancer mutants. Oncogene 2007; 26(15):2226-42.
3. Bourdon J.C. p53 and its isoforms in cancer. Br J Cancer 2007; 97(3):277-82.
4. Levine A.J., Hu W., Feng Z. The P53 pathway: what questions remain to be explored? Cell Death Differ. 2006; (6):1027-36.
5. Pietsch E.C., Humbey O., Murphy M.E. Polymorphisms in the p53 pathway. Oncogene 2006; 25(11):1602-11.
8
6. Stiewe T. The p53 family in differentiation and tumorigenesis. Nat Rev Cancer 2007; 7(3):165-8.
7. Deyoung M.P., Ellisen L.W. p63 and p73 in human cancer: defining the network. Oncogene 2007; 26(36):5169-83.
8. Sablina A.A., Budanov A.V., Ilyinskaya G.V. et al. The antioxidant function of the p53 tumor suppressor. Nat Med. 2005; 11(12):1306—13.
9. Sengupta S., Harris C.C. p53: traffic cop at the crossroads of DNA repair and recombination. Nat Rev Mol Cel. Biol. 2005; 6(1):44-55.
10. Tarapore P., Fukasawa K. Loss of p53 and centrosome hyperamplification. Oncogene 2002; 21(40):6234-40.
11. Horn H.F., Vousden K.H. Coping with stress: multiple ways to activate p53. Oncogene 2007; 26(9):1306-16.
12. Moll U.M., Wolff S., Speidel D., Deppert W. Transcription-independent pro-apoptotic functions of p53. Curr Opin Cell Biol. 2005; 17(6):631-6.
13. Xu Y., Lin T., Chao C., Saito S. et al. p53 induces differentiation of mouse embryonic stem cells by suppressing Nanog expression. Nat Cell Biol. 2005; 7(2):165-71.
14. Aylon Y., Oren M. Living with p53, dying of p53. Cell 2007; 130(4):597-600.
15. Shats I., Milyavsky M., Tang X. et al. p53-dependent down-regulation of telomerase is mediated by p21waf1. J Biol Chem. 2004; 279(49):50976-85.
16. Teodoro J.G., Evans S.K., Green M.R. Inhibition of tumor angiogenesis by p53: a new role for the guardian of the genome. J Mol Med. 2007; 85(11):1175-86.
Клиническая онкогематология
Белок p53
17. Bensaad K., Vousden K.H. p53: new roles in metabolism. Trends Cell Biol. 2007; 17(6):286-91.
18. Kim, J.W., Dang C.V. Multifaceted roles of glycolytic enzymes. Trends Biochem. Sci. 2005; 30(3):142-150.
19. Bonnet S., Archer S.L., Allalunis-Turner J. et al. A mitochondria-k(+) channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell 2007; 11(1): 37-51.
20. Donehower L.A., Harvey M., Slagle B.L. et al. Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumours. Nature 1992; 356(6366):215-21.
21. Jacks T., Remington L., Williams B.O. et al. Tumor spectrum analysis in p53-mutant mice. Curr Biol. 1994; 4(1):1-7.
22. Garcia-Cao I., Garcia-Cao M., Martin-Caballero J. et al. «Super p53» mice exhibit enhanced DNA damage response, are tumor resistant and age normally. EMBO J. 2002; 21(22):6225-35.
23. Villunger A., Michalak E.M., Coultas L. et al. p53- and drug-induced apoptotic responses mediated by BH3-only proteins puma and noxa. Science 2003; 302(5647):1036-8.
24. Jeffers J.R., Parganas E., Lee Y. et al. Puma is an essential mediator of p53-dependent and -independent apoptotic pathways. Cancer Cell 2003; 4(4):321-8.
25. Philipp-Staheli J., Kim K.H., Liggitt D. et al. Distinct roles for p53, p27Kip 1, and p21 Cip 1 during tumor development. Oncogene 2004; 23(4):905-13.
26. Yang A., McKeon F. P63 and P73: P53 mimics, menaces and more. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000; 1(3):199-207.
27. Deyoung M.P., Ellisen L.W. p63 and p73 in human cancer: defining the network. Oncogene 2007; 26(36):5169-83.
28. Stiewe T. The p53 family in differentiation and tumorigenesis. Nat Rev Cancer 2007; 7(3):165-8.
29. Komarova E.A., Krivokrysenko V., Wang K. et al. p53 is a suppressor of inflammatory response in mice. FASEB J. 2005; 19(8):1030-2.
30. Sablina A.A., Chumakov P.M., Kopnin B.P. Tumor suppressor p53 and its homologue p73alpha affect cell migration. J Biol Chem. 2003; 278(30):27362-71.
31. Crouch S., Spidel C.S., Lindsey J.S. HGF and ligation of alphavbeta5 integrin induce a novel, cancer cell-specific gene expression required for cell scattering. Exp Cell Res. 2004; 292(2):274-87.
32. Phillips T.M., Lindsey J.S. Carcinoma cell-specific Mig-7: a new potential marker for circulating and migrating cancer cells. Oncol Rep. 2005; 13(1):37-44.
33. Petty A.P., Garman K.L., Winn V.D. et al. Overexpression of carcinoma and embryonic cytotrophoblast cell-specific Mig-7 induces invasion and vessel-like structure formation. Am J Pathol. 2007; 170(5):1763-80.
34. Robertson G.P. Mig-7 linked to vasculogenic mimicry. Am J Pathol. 2007; 170(5):1454-6.
35. Guarino M., Rubino B., Ballabio G. The role of epithelial-mesenchymal transition in cancer pathology. Pathology 2007; 39(3):305-18.
36. Huber M.A., Kraut N., Beug H. Molecular requirements for epithelial-mesenchymal transition during tumor progression. Curr Opin Cell Biol. 2005; 17(5):548-58.
37. Nathanson S.D. Preclinical models of regional lymph node tumor metastasis. Cancer Treat Res. 2007;135:129-56.
38. Sundar S.S., Ganesan T.S. Role of lymphangiogenesis in cancer. J Clin Oncol. 2007; 25(27):4298-307.
39. Soussi T. p53 alterations in human cancer: more questions than answers. Oncogene 2007; 26(15):2145-56.
40. Soussi T., Wiman K.G. Shaping genetic alterations in human cancer: the p53 mutation paradigm. Cancer Cell 2007; 12(4):303-12.
41. Soussi T. Analysis of p53 gene alterations in cancer: a critical view. In: 25 Years of p53 Research, Ed. by P.Hainaut and K.G.Wiman. Springer, Dordrecht-Berlin-Heidelberg-New York, 2005, pp. 255-292.
42. Shi H., Calvez F.L., Olivier M., Hainaut P. Patterns of TP53 mutations in human cancer: interplay between mutagenesis, DNA repair, and selection. In: 25 Years of p53 Research, Ed. by P.Hainaut and K.G.Wiman. Springer, Dordrecht-Berlin-Heidelberg-New York, 2005, pp. 293-320.
43. Strano S., Dell’Orso S., Di Agostino S. et al. Mutant p53: an oncogenic transcription factor. Oncogene 2007; 26(15):2212-9.
44. Li Y., Prives C. Are interactions with p63 and p73 involved in mutant p53 gain of oncogenic function? Oncogene 2007; 26(15):2220-5.
45. Vousden K.H., Lane D.P. p53 in health and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007; 8(4):275-83.
46. Olivier M., Hainaut P., Borresen-Dale A.-L. Prognostic and predictive value of TP53 mutations in human cancer. In: 25 Years of p53 Research, Ed. by P.Hainaut and K.G.Wiman. Springer, Dordrecht-Berlin-Heidelberg-New York, 2005, pp. 321-338.
47. Bond G.L, Levine A.J. A single nucleotide polymorphism in the p53 pathway interacts with gender, environmental stresses and tumor genetics to influence cancer in humans. Oncogene 2007; 26(9):1317-23.
48. Petitjean A., Achatz M.I., Borresen-Dale A.L. et al. TP53 mutations in human cancers: functional selection and impact on cancer prognosis and outcomes. Oncogene 2007; 26(15):2157-65.
49. Peller S., Rotter V. TP53 in hematological
cancer: low incidence of mutations with
significant clinical relevance. Hum Mutat. 2003; 21(3):277-84.
50. Thornton P.D., Gruszka-Westwood A.M., Hamoudi R.A. et al. Characterisation of TP53 abnormalities in chronic lymphocytic leukaemia. Hematol J. 2004; 5(1):47-54.
51. Bergamaschi D., Gasco M., Hiller L. et al. p53 polymorphism influences response in cancer chemotherapy via modulation of p73-dependent apoptosis. Cancer Cell 2003; 3(4):387-402.
52. Sturm I., Bosanquet A.G., Hummel M. et al. In B-CLL, the codon 72 polymorphic variants of p53 are not related to drug resistance and disease prognosis. BMC Cancer 2005; 5:105.
53. Selivanova G., Wiman K.G. Reactivation of mutant p53: molecular mechanisms and therapeutic potential. Oncogene 2007; 26(15):2243-54.
54. Bouchet B.P, de Fromentel C.C., Puisieux A., Galmarini C.M. p53 as a target for anti-cancer drug development Crit Rev Oncol Hematol. 2006; 58(3):190-207.
55. Vassilev L.T. MDM2 inhibitors for cancer therapy. Trends Mol Med. 2007; 13(1):23-31.
56. Gudkov A.V., Komarova E.A. Dangerous habits of a security guard: the two faces of p53 as a drug target. Hum Mol Genet. 2007; 16(1):R67-72.
www .medprint.ru
9
