Микроклональное размножение Citrus limon (L. ) Osbeck сорта Павловский Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА

2018 БИОЛОГИЯ Вып. 1

БИОТЕХНОЛОГИЯ

УДК 581.143.6:634.334

DOI: 10.17072/1994-9952-2018-1-57-61.

Н. Л. Шибанова, М. В. Орлова

Пермский государственный национальный исследовательский университет, Пермь, Россия

МИКРОКЛОНАЛЬНОЕ РАЗМНОЖЕНИЕ CITRUS LIMON (L.) OSBECK СОРТА ПАВЛОВСКИЙ

Представлены результаты по клональному микроразмножению Citrus limon L. Osbeck сорта Павловский. Установлено, что для стерилизации эксплантов наиболее подходящим является следующий порядок использования стерилизующих агентов: 96% этанол (5 сек.) и 8% раствор гипохлорита натрия (20 мин.). Выход стерильной культуры составил 70%. Для введения лимона сорта Павловский в культуру in vitro оптимальной оказалась твердая питательная среда MS с добавлением 1.0 мг/л бензиламинопурина и 0.5 мг/л нафтилуксусной кислоты. Выход жизнеспособных эксплантов составил 77.5%. Культивирование микропобегов проводилось на среде DKW c добавлением фитогормонов 2.0 мг/л бензиламинопурина и 2.0 мг/л гибереллиновой кислоты. С каждого материнского экспланта удалось получить 2.45±0.78 дочерних микропобега. Оптимальной для ризогенеза регенерантов является среда / MS с добавлением 1.0 мг/л нафтилуксусной кислоты и 1.0 мг/л индолилуксусной кислоты. Процент укорененных микропобегов составил 65.1. Растения, полученные в культуре in vitro, были перенесены в условия закрытого грунта в почвенный субстрат: торф, перлит, вермикулит, песок в соотношении 7:2:3:2. Приживаемость растений составила 87.5%.

Ключевые слова: микроклональное размножение; Citrus limon (L.) Osbeck; регуляторы роста.

N. L. Shibanova, M. V. Orlova

Perm State University, Perm, Russian Federation

MICROC1ONAL PROPAGATION CITRUS LIMON (L.) OSBECK CULTIVAR PAVLOVSKY

There is the results of clonal micropropagation of Citrus limon L. Osbeck of Pavlovsky variety. It was established that the following procedure of the use of sterilizing agents is most suitable for the sterilization of explants: 96% ethanol (5 sec) and 8% sodium hypochlorite solution (20 min). The yield of the sterile culture was 70%. It was found that the solid MS nutrient medium with the addition of 1.0 mg/l benzylaminopurine and 0.5 mg/l naphthylacetic acid was optimal to introduce the lemon Pavlovsky into the culture in vitro. The yield of viable explants was 77.5%. Cultivation of microshoots was carried out on DKW medium with the addition of phytohormones 2.0 mg/l benzylaminopurine and 2.0 mg/l gibellic acid. 2.45±0.78 child microshoots was get from each parental explant. Optimum for rhizogenesis of regenerants is medium /MS with addition of 1.0 mg/l naphthylacetic acid and 1.0 mg/l indolylacetic acid. The percentage of rooted microshoots was 65.1. Plants obtained from in vitro culture were transferred to conditions of closed soil in the soil substrate: peat, perlite, vermiculite, sand in a ratio of 7:2:3:2. Plant survival was 87.5%.

Key words: microclonal propagation; Citrus limon (L.) Osbeck; growth regulators.

Введение

Лимон является одной из важнейших сельскохозяйственных культур, которая все больше пользуется потребительским спросом на рынке. Его плоды богаты эфирными маслами, органическими кислотами, витаминами А, В, С, Р и могут использоваться в кондитерской, парфюмерной, консерв-

ной отраслях [Капцинель, 1953; Егорова, 1981; FAO, 2013].

Климатические условия нашей страны не являются подходящими для разведения лимона, так как оптимальная температура для вегетационного периода составляет +20...+22°С [Самарина, Коло-миец, 2009]. Однако с каждым годом увеличивается число любителей-цитрусоводов, среди которых наибольшей популярностью пользуются сорта

© Шибанова Н. Л., Орлова М. В., 2018

Павловский, Уральский, Майкопский.

Для получения качественных и здоровых сеянцев может быть использован метод микроклональ-ного размножения, который имеет немало преимуществ перед традиционными способами размножения. К таким преимуществам относятся высокий коэффициент размножения, возможность работать вне зависимости от времени года, получение генетически однородного потомства и безвирусной базы, ювенилизация посадочного материала, которая является важной для адаптации к условиям in vivo [Сорокина, Старичкова, Решетникова, 2002; Черевченко, Лаврентьева, Иванни-ков, 2008; Самарина, 2013].

Цель данной работы - оптимизация этапов микроклонального размножения лимона сорта Павловский.

Материал и методы исследования

Исследования проводились в 2017 г. в лаборатории микроклонального размножения кафедры ботаники и генетики растений и в Учебном ботаническом саду Пермского государственного национального исследовательского университета (ПГНИУ).

В качестве первичных эксплантов были использованы пазушные вегетативные почки лимона сорта Павловский с частью стебля длиной 1.3-2.2 см. Стерилизацию материала проводили следующим образом: раствор нейтрального детергента (25 мин.); промывка проточной водой (15 мин.); 96% этанол (5 сек.); 8% раствор гипохлорита натрия (20-30 мин.), с последующей промывкой в трех сменах стерилизованной дистиллированной воды (по 5 мин. в каждой).

На этапе введения в культуру и адаптации экс-планты высаживались на питательные среды Мура-сиге и Скуга (MS) и КМО - MS с пониженным содержанием нитрата аммония (250 мг/л) без нитрата калия, но с добавлением сульфата аммония 1500 мг/л. [Murashige, Skoog, 1962], 2.5%-ной сахарозы, 0.7%-ного агар-агара. В среду добавляли регуляторы роста - нафтилуксусную кислоту (НУК), бензиламинопурин (БАП) и витамины: тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту. На этапе собственно микроразмножения использовалась среда DKW [Driver, Kuniyuki, 1984] с фитогормонами БАП и ГК (гибереллиновая кислота). На этапе укоренения микропобеги помещали на среду / MS с добавлением ауксинов - НУК 2.0 мг/л и ИУК 1.0 мг/л.

Стерилизация питательной среды проводилась в автоклаве Sanyo MLS-3780 при температуре 120°С, давлении 1 атм, в течение 15 мин. Все этапы микроразмножения проводились в стерильных условиях в ламинар-боксе. Экспланты содержали в условиях искусственного освещения (2790 люкс), период 14/10, при температуре + 20 ± 2°С. Часть растений, полученных в культуре in vitro, в декабре 2017 г. и в январе 2018 г. была перенесена в Учебный ботанический

сад ПГНИУ, где выращивалась в условиях закрытого грунта.

Для статистической обработки экспериментальных данных использовали программу Microsoft Office Excel. Различия по критерию Фишера считали статистически значимыми при p < 0.05.

Результаты и их обсуждение

Микроклональное размножение лимона сорта Павловский проводилось в четыре этапа, выделение которых является общепринятым [Бутенко, Шевелуха, 1960].

Первый этап включал стерилизацию эксплан-тов и их посадку на твердую питательную среду MS. Стерилизация материала проводилась в три этапа с разной экспозицией в основном стерилизующем агенте (табл. 1).

Таблица 1

Выход стерильной культуры в зависимости от экспозиции в основном стерилизующем агенте

Основное стери- Экспози- Выход сте-

лизующее веще- рильной куль-

ство ция, мин. туры, %

Гипохлорит Na 15 49.2

(«Белизна»), 8% 20 70.1

25 58.4

Исходя из данных, представленных в табл. 1, можно сделать заключение, что для обработки экспланта 8%-ным раствором гипохлорита натрия необходимо не менее 20 мин. Разница с экспозицией в 15 мин. оказалась достоверной (р=0.04, р<0.05). Самый высокий процент выхода стерильной культуры отмечался при экспозиции 20 мин. -70.1%. В работе О.В. Дорощёнка [2016] при использовании 10%-ного раствора гипохлорита № в течение 15 мин. наблюдался примерно такой же процент выхода стерильной культуры - 68.2.

Результаты по развитию экплантов лимона на твердой питательной среде MS представлены в табл. 2.

Таблица 2

Выход жизнеспособных эксплантов на твердой питательной среде MS, %

Варианты среды Жизнеспособные

экспланты

MS+1.0 мг/л БАП+0.5 мг/л НУК 77.5

MS+1.0 мг/л НУК 63.6

MS+ 1.0 мг/л БАП 69.2

KMO+БАП 2.0 мг/л+ ГК 2.0 мг/л 47.3

При анализе результатов по развитию эксплан-тов лимона сорта Павловский на твердой питательной среде MS установлено, что оптимальной является среда с добавлением 1.0 мг/л БАП и 0.5 мг/л НУК, на которой получен самый высокий процент жизнеспособных эксплантов - 77.5. На

среде КМО с добавлением 2.0 мг/л БАП и 2.0 мг/л ГК наблюдался самый низкий процент выхода жизнеспособных эксплантов - 47.3. Разница между первым и четвертым вариантами среды оказалась достоверной (р=0.03, р<0.05). Полученные результаты отличаются от данных Л.С. Самариной [2013] по другим сортам лимона, у которых выход жизнеспособных эксплантов на среде КМО был высоким и составил 84.7%.

Вторым этапом является активация роста побегов с последующим микроразмножением. Культивирование проводилось на среде DKW с добавлением 2.0 мг/л БАП и 2.0 мг/л ГК. Через неделю наблюдалось возобновление роста, через 4-5 недель начиналось образование микропобегов. С каждого материнского экспланта удалось получить 2.45±0.78 дочерних микропобега.

Для укоренения микрочеренков была использована питательная среда MS с уменьшенной вдвое концентрацией минеральных солей и сахарозы (^ MS), в двух вариантах: с добавлением 3.0 мг/л НУК и 1.0 мг/л НУК+1.0 мг/л ИУК. Результаты влияния ауксинов на ризогенез представлены на рис. 2.

Для оценки эффективности ризогенеза посчитывали частоту укоренения, то есть число корней на одном микропобеге. На первом варианте среды она составила 65.1% укорененных микропобегов с длиной корней 3.6±0.81 см и числом - 2.6±0.49 шт. на побег. На втором варианте среды наблюдалось 62.8% укорененных микропобегов с длиной корней 4.2±1.16 см и числом - 1.2±0.34 шт. на побег. В работе Л.С. Самариной [2013] для других сортов лимона наилучшей для укоренения была среда c добавлением 1.0-2.0 мг/л НУК и 1.0 мг/л ИМК. При этом процент укорененных побегов варьировал от 83.7 до 95.1. Длина корней составила 4.2-5.2 см, а число - 3.1-3.8 шт. на побег.

Растения, полученные в культуре in vitro, были перенесены в условия закрытого грунта Учебного ботанического сада ПГНИУ. Они были высажены

среды наблюдалось через неделю после посадки, на втором и третьем - через 1.5 недели, на четвертом - через 2 недели. Появление первого листа отмечалось через 2-3 недели на первом варианте среды и через 3-4 недели - на остальных вариантах. Остановка роста эксплантов происходила через 5-7 недель после посадки вне зависимости от варианта среды. Развитие экспланта на питательной среде MS представлено на рис. 1.

Рис. 2. Влияние ауксинов на ризогенез микрочеренков лимона сорта Павловский

Заключение

В результате проведенных исследований можно предложить следующую схему микроклонального размножения лимона сорта Павловский. На этапе введения в культуру можно использовать твердую питательную среду MS с добавлением 1.0 мг/л БАП и 0.5 мг/л НУК. На этапе микроразмножения хорошие результаты получены на среде DKW с

Начало роста микропобегов на первом варианте

1 неделя

2 неделя

3 неделя

Рис. 1. Развитие экспланта лимона сорта Павловский на питательной среде MS+1.0 мг/л БАП+0.5 мг/л НУК

в почвенный субстрат: торф, перлит, вермикулит, песок в соотношении 7:2:3:2. Выход адаптированных растений составил 87.5%.

1 вариант - / MS +3.0 2 вариант - / MS

мг/л НУК MS+1.0 мг/л НУК+1.0

мг/л ИУК

добавлением БАП 2.0 мг/л и ГК 2.0 мг/л. Для этапа укоренения предлагается питательная среда У MS с уменьшенной вдвое концентрацией минеральных солей и сахарозы с добавлением ауксинов 1.0 мг/л НУК+1.0 мг/л ИУК. Для перенесения в закрытый грунт можно использовать почвенный субстрат следующего состава: торф, перлит, вермикулит, песок в соотношении 7:2:3:2.

Библиографический список

Бутенко Р.Г., Шевелуха Е.А. Биология культивируемых клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе. М.: ФБК-Пресс Москва, 1960. 152 с. Дорощёнок О.В. Микроклональное размножение двух видов рода Citrus L. // Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии: материалы регион. с междунар. участием студ. науч. конф. Пермь, 2016. С. 31-33. Егорова Т.В. Семейство рутовые (Rutaceae) // Жизнь растений. М.: Просвещение, 1981. Т. 5, ч. 2. Цветковые растения. С. 236-245. Капцинель М.А. Выращивание цитрусовых культур в Ростовской области. Ростов н/Д: Кн. изд-во, 1953. 84 с.

Самарина Л.С. Оптимизация приёмов микроразмножения и сохранения лимона in vitro: авто-реф. дис. ... канд. биол. наук. М., 2013. 23 с. Самарина Л.С., Коломиец Т.М. Особенности микроразмножения C. limon в условиях in vitro // Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: материалы IX молодеж. науч. конф. М., 2009. С. 25-26. Сорокина И.К., Старичкова Н.И., Решетникова Т.Б. Основы биотехнологии растений. Культура растительных клеток и тканей: учеб. пособие. Саратов: Изд-во СГУ, 2002. 45 с. Черевченко Т.М., Лаврентьева А.Н., Иванников Р.В. Биотехнология тропических и субтропических растений in vitro. Киев: Наук. думка, 2008. 633 с.

Driver J.A., Kuniyuki A.H. In vitro propagation of paradox walnut rootstock // Hort. Sci. 1984. Vol. 19. P. 507-509. FAO Citrus Fruit Production . Food And Agriculture Organization (FAO) Of The United Nations. FAOSTAT [Электронный ресурс]. Rome, 2013. URL: http://faostat3.fao.org/compare/E Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with to-bacco tissued cultures // Physiol. plant. 1962. Vol. 15. P. 473-497.

References

Butenko R.G., Shevelukha E.A. Biologija kultivirue-mych kletok vyssich rastenij in vitro i biotech-

nologii na ich osnove [Biology of cultivated cells of higher plants in vitro and biotechnology on their basis]. Moscow, FBK-Press Moscow Publ., 1960. 152 p. (In Russ.).

Cherevchenko T.M., Lavrentyeva A.N., Ivannikov R.V. Biotechnologija tropiceskich i sub-tropiceskich rastenij in vitro [Biotechnology of tropical and subtropical plants in vitro]. Kiev, Nauk. dumka Publ., 2008. 633 p. (In Russ.).

Doroshenok O.V. [Micropropagation of two species of the genus Citrus L.]. Fundamental'nje i prik-ladnye issledovanija v biologii i ekologii [Fundamental and applied research in biology and ecology: materials of the regional student conference with international participation]. Perm, 2016, pp. 31-33. (In Russ.).

Driver J.A., Kuniyuki A.H. In vitro propagation of paradox walnut rootstock. Hort. Sci. V. 19 (1984): pp. 507-509.

Egorova T.V. [Family Rutacea (Rutaceae)]. Zizn' ras-tenij. Cvetkovye rastenija [Life of plants. Flowering plants]. Moscow, Prosvescenie Publ., 1981, V. 5, p. 2, pp. 236-245. (In Russ.).

FAO Citrus Fruit Production . Food And Agriculture Organization (FAO) Of The United Nations. FAOSTAT [Electronic resource]. Rome. 2013. Available at: http://faostat3.fao.org/compareZE

Kaptsinel M.A. Vyrascivanie citrusovych kul'tur v Rostovskoj oblasti [Cultivation of citrus crops in the Rostov Region]. Rostov-on-Don: Kniznoe izd-vo Publ., 1953. 84 p. (In Russ.).

Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with to-bacco tissued cultures. Physiol. plant. V. 15 (1962): pp. 473-497.

Samarina L.S. Optimizacija priemov mikrorazmno-zenija i sochranenija limona in vitro. Avtoref. diss. kand. biol. nauk [Optimization of micropropagation and lemon conservation methods in vitro. Abstract Cand. Diss.]. Moscow, 2013. 23 p. (In Russ.).

Samarina L. S., Kolomiec T.M. [Features of C. limon micropropagation under in vitro conditions]. Bio-technologija v rastenievodstve, zivotnovodstve i veterinarii [Biotechnology in crop production, animal husbandry and veterinary science. Materials of the IX youth scientific conference]. Moscow, 2009, pp. 25-26. (In Russ.).

Sorokina I.K., Starichkova N.I., Reshetnikova T.B. Osnovy biotechnologii rastenij. Kul'tura rastitel-nych kletok i tkanej [Fundamentals of plant biotechnology. Culture of plant cells and tissues]. Saratov, SSU Publ., 2002. 45 p. (In Russ.).

Поступила в редакцию 06.02.2018

Об авторах

Шибанова Наталья Леонидовна, кандидат биологических наук, доцент кафедры ботаники и генетики растений

ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» ORCID: 0000-0002-9404-6821 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; [email protected]; (342)2396229

Орлова Мария Вячеславовна, студентка биологического факультета ФГБОУВО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» ORCID: 0000-0002-4134-9087 614990, Пермь, ул. Букирева, 15; [email protected]; (342)2396229

About the authors

Shibanova Natalya Leonidovna, candidate of

biology, associate professor Department of Botany

and Plant Genetics

Perm State University.

ORCID: 0000-0002-9404-6821

15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990;

[email protected]; (342)2396229

Orlova Mariya Vyacheslavovna, student Faculty of Biology

Perm State University. ORCID: 0000-0002-4134-9087 15, Bukirev str., Perm, Russia, 614990; [email protected]; (342)2396229

Информация для цитирования:

Шибанова Н.Л., Орлова М.В. Микроклональное размножение Citrus limon (L.) Osbeck сорта Павловский // Вестник Пермского университета. Сер. Биология. 2018. Вып. 1. С. 57-61. DOI: 10.17072/1994-9952-2018-1-57-61.

Shibanova N.L., Orlova M.V. [Microclonal propagation Citrus limon (L.) Osbeck cultivar Pavlovsky]. Vestnik Permskogo universiteta. Biologija. Iss. 1 (2018): pp. 57-61. (In Russ.). DOI: 10.17072/1994-99522018-1-57-61.