CC BY
279
ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
ЗАОЧНАЯ АКАДЕМИЯ ПОСЛЕДИПЛОМНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
© ТИТОВ В.Н., 2014 УДК 612.014.1:577.1
Титов В.Н.
МИКРОЧАСТИЦЫ ПЛАЗМЫ КРОВИ, МИКРОВЕЗИКУЛЫ, ЭКЗОСОМЫ, ТЕЛЬЦА АПОПТОЗА И МАКРОФАГИ КУПФЕРА В ПЕЧЕНИ — ПОЗДНЯЯ В ФИЛОГЕНЕЗЕ СИСТЕМА РЕАЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ФУНКЦИИ ЭНДОЭКОЛОГИИ (ЛЕКЦИЯ)
ФГБУ "Российский кардиологический научно-производственный комплекс" Минздрава России, 121552, Москва
Возможно на ранних ступенях филогенеза, на этапе первых контактов единичных клеток во внешней среде, был отработан способ общения путем образования ими микровезикул (МВ). Не исключено, что столь сложным путем в течение миллионов лет проходило формирование самых ранних сообществ функционально разных клеток. Позже диффузия гуморальных медиаторов в рамках группы клеток, но уже без везикул, привела к формированию самых ранних регулируемых сообществ из разных клеток. Через миллионы лет эти паракринно регулируемые сообщества клеток (СК) стали структурными и функциональными единицами каждого из органов. Трудно представить, что способ раннего в филогенезе, гуморального общения клеток мог сохранить значение в современных условиях. В то же время, согласно методологическому подходу биологической преемственности в становлении биологических функций и биологических реакций, МВ продолжают функционировать, но с несколько иными целями. Мы полагаем, что микрочастицы (МЧ) плазмы крови — гетерогенная популяция изначально образуемых клетками МВ, экзосом и телец апоптоза, которые являются основой спонтанного, физико-химического формирования в плазме крови комплексов на принципах абсорбции, гидрофоб-ности и ионного взаимодействия нерастворимых в водной среде структурных компонентов клеток. Мы считаем, что функционально образование МЧ в крови сейчас — это реализация в межклеточной среде, в локальном пуле внутрисосуди-стой плазмы крови филогенетически позднего варианта биологической функции эндоэкологии. Он включает: а) МЧ, МВ, экзосомы и тельца апоптоза — элементы биологической реакций поддержания "чистоты " межклеточной среды; б) во многом высокоспециализированный вариант фагоцитоза микрочастиц макрофагами Купфера в печени. В совокупности это филогенетически поздняя система реализации биологической функции эндоэкологии на уровне организма.
Ключевые слова: функция эндоэкологии; апоптоз; микровезикулы; микроРНК; эндотелий. V.N. Titov
THE MICRO-PARTICLES OF BLOOD PLASMA, MICRO-VESICLES, EXOSOMES, APOPTOTIC BODIES AND KUPFFER MACROPHAGE IN LIVER: LATE IN PHYLOGENESIS SYSTEM OF REALIZATION OF BIOLOGICAL FUNCTION OF ENDOECOLOGY
Probably, at early stages of phylogenesis and on the stage of first contacts of single cells in environment the mode of intercommunication was developed via formation of micro-vesicles. It is quite possible that this so complicated way was used during billions of years to develop the very early cenosises of functionally different cells. Later on, diffusion of humoral mediators within the framework of group of cells but without vesicles resulted in formation of very early regulated cenosises of various cells. In billions years, these paracrin regulated cenosises became structural and functional units of every organ. It is difficult to imagine that mode of early in phylogenesis humoral intercommunication of cells could preserve its significance in present conditions. At the same time, according to methodological approach of biological continuity in becoming of biological functions and biological reactions, micro-vesicles continue to function but with somehow different purposes. It is surmised that micro-particles of blood plasma consist a heterogeneous population of micro-vesicles initially formed by cells, exosomes and apoptotic bodies. This population is a foundation of spontaneous, physical chemical formation of complexes in blood plasma on principles of absorption, hydrophobicity and ionic interaction of structural cells' components insoluble in water medium. It is assumed that presently formation of micro-particles in blood is functionally a kind of realization of phylogenetically late variant of biological function of endoecology in inter-cellular medium, in local pool of intravascular blood plasma. This variant includes: a)micro-particles, micro-vesicles, exosomes and apoptotic bodies as elements of biological reaction of support of "purity" of inter-cellular medium; b) in many respects highly specialized variant of phagocytosis of micro-particles by Kupffer macrophages in liver. In the aggregate, this is a phylogenetically late medium of realization of biological function of endoecology at the level of organism.
Keywords: function of endoecology; apoptosis, micro-vesicles; microRNA; endothelium.
В последние годы среди диагностических тестов, основанных на современных высокотехнологичных физико-химических способах измерения, большое внимание привле-
Для корреспонденции:
Титов Владимир Николаевич, д-р мед. наук, проф., рук. лаб. клин. биохимии липидов
Адрес: 121552, Москва, ул. 3-я Черепковская, 15-а E-mail: [email protected]
кают методы количественного и качественного определения содержания в плазме крови микрочастиц (МЧ), микровезикул (МВ), экзосом и телец апоптоза. Довольно сложно перечислить все функции, которые приписывают МЧ на основании того, что они реально содержат более тысячи компонентов, в том числе биологически активных. К ним относятся короткие фрагменты матричной РНК (микроРНК), разнообразные биологически активные пептиды (ангиотензин II, лептин, адипонектин), факторы адгезии клеток, перилипин, клатрин, кавеолин, фрагменты плазматических мембран с на-
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 11, 2011
тивными интегральными белками, биологически активные гуморальные медиаторы, гидрофобные домены плазматической мембраны клеток — рафты, полярные липиды, включая фосфолипиды (ФЛ) разных классов, неэтерифицированные жирные кислоты (ЖК), как связанные с альбумином, так и в виде свободных ЖК, прямых, гомо- и гетерогенных мицелл, инвертированные фрагменты плазматических мембран разных клеток, факторы адгезии клеток и т. д.
Структурные и функциональные особенности, которые позволяют рассматривать МЧ, МВ, экзосомы и тельца апоп-тоза как потенциальные, неспецифичные, прогностические биомаркеры патологических процессов в клинической биохимии, определяют следующее.
1. МЧ, МВ, экзосомы и тельца апоптоза можно выявить во всех биологических средах; их можно оценить как количественно при использовании физико-химических методов, так и качественно, — размеры, содержание фосфатидилхоли-на, ЖК, параметры седиментации, иные специфичные пептиды и компоненты липидов.
2. МЧ, МВ и экзосомы содержат специфичные белки, которые переходят в них от клеток-доноров; их можно выявить как на поверхности, так и глубже, за фрагментами плазмати-
ческой мембраны как иммуноферментными, так и энзимати-ческими, кинетическими методами.
3. Состав пептидов и микроРНК дает представление о наиболее реальных клетках-донорах, которые образовали большинство МВ путем физиологичного (афизиологичного) процесса блеббинга (blebb — англ. пузырек воздуха) — образования МВ с мембраной.
4. Характерные параметры МЧ, МВ могут дать ранние представления о развитии патологического процесса на уровне паракринных сообществ клеток в ткани, органе до формирования более органоспецифичных биологических маркеров.
5. Определить количественные и качественные параметры МЧ можно при неинвазивном сборе биологического материала; МЧ содержат все биологические жидкости in vivo, включая плазму крови, мочу, слюну, слезную и синовиальную жидкость, лаважные воды при промывании бронхов, желудочный сок.
6. Потенциальные возможности органоспецифичной диагностики можно определить на основании количественных и качественных параметров МЧ, МВ; они могут быть образованы одновременно разными клетками-донорами; важно научиться достоверно их различать. Для этих целей используют как неспецифичные методы физико-химического определения, так и специфичные иммунохимические биомаркеры в МЧ.
7. МЧ, МВ, экзосомы и тельца апоптоза характеризуются определенной степенью органоспецифичности, поскольку отражают взаимоотношение клеток в ткани или органе.
8. Отработано много высокотехнологичных способов определения количественных и качественных параметров МЧ при использовании препаративного ультрацентрифугирования, индуцированной лазером многоволновой флюоресценции, способов иммунохимии с меченными флюорофора-ми специфичными антителами, методов электронной микроскопии, протеомики и липидомики.
1. Функциональная роль микрочастиц плазмы крови — филогенетически поздняя система реализации биологической функции эндоэкологии. Биологическую функцию эн-доэкологии, поддержание "чистоты" межклеточной среды в
Коагуляция
Фибринолиз
Cell Survival
АРС
EPCR
РЕСАМ-1 VCAM-1
Адгезия
ICAM-1 E-selectin
S-Endo VE-cadherin
endoglin eNOS
T-cadherin
VE-cadheri? ФУНКЦИЯ .............
эндотелия..............
о° О ° .......2О ° О о о"
£оо
Эндотелий
Рис. 1. Структура сформированных в плазме крови физико-химических ассоциатов из сотен разнообразных компонентов (биологического "мусора") с суррогатной мембраной.
многоклеточном организме реализуют, по нашему мнению, биологические реакции экскреции, воспаления, фагоцитоза макрофагами Купфера, трансцитоза, гидродинамического (артериального) давления, эндотелийзависимой вазодила-тации и гипертермии. Становление биологических реакций происходит на разных ступенях филогенеза и уровнях регуляции метаболизма: на аутокринном (клеточном) уровне, в паракринно регулируемых сообществах клеток (СК), органах и организме в целом.
В связи со значительным разночтением относительно возможной функции МЧ стремясь избежать обсуждения неаргументированных представлений, мы полагаем, будет правильно сразу высказать наше мнение о биологической роли МЧ, МВ и экзосом, объединив их вместе с поздней в филогенезе специализированной системой макрофагов Купфера в печени.
Длительная циркуляция МЧ в крови и не очень быстрое поглощение и утилизация их оседлыми макрофагами вначале в пуле рыхлой соединительной ткани (РСТ) паракринных СК, в интиме артерий, а позже в филогенезе в специализированных макрофагах Купфера определены формированием на поверхности МЧ суррогатной мембраны. Она формируется из фрагментов плазматической мембраны разных клеток-доноров, в том числе из афизиологичных мембран, которые покрывают тельца апоптоза. Часть фрагментов плазматической мембраны, вероятно, являются инвертированными, афизиологичными с увеличенным количеством аминоФЛ (фосфатидилсерина — ФС и фосфатидилэтаноламина) на поверхности и скоплением гидрофобных доменов плазматической мембраны — рафтов. Наличие ФС на поверхности МЧ определяют в иммунохимической реакции с аннексином (индуктор биологической реакции апоптоза). Определение аннексина в МЧ рассматривают как тест апоптоза, предвестника внутрисосудистого диссеминированного тромбоза, который отчасти формируется и на тромбогенной поверхности МЧ. Особые сложности возникают с выяснением возможной биологической роли в составе МВ короткоцепочечной ми-кроРНК (микРНК) (рис. 1).
МикРНК — некодируемая РНК, последовательность из 22 нуклеотидов, экпрессирована у животных, растений и вирусов. Все микРНК имеют в основе кольцевую незамкнутую структуру; в силу формирования молчащих комплексов микРНК происходит ингибирование ее трансляции при наличии дополнительного этапа посттрансляционной регуляции. Включение микРНК в МВ происходит как в культуре клеток in vitro, так и в плазме крови. Увеличенное количество микРНК можно обнаружить в составе МЧ у практически здоровых добровольцев. Это может отражать состояние биологической функции гомеостаза и метаболизм в гемопо-этических клетках. Содержание микРНК в МВ не отражает содержание РНК в клетках-донорах; селективная упаковка микРНК в МЧ, образуемых клетками-донорами, пока окончательно не ясна. Однако МВ, которые освобождают Т-клетки, В-лимфоциты, дендритные клетки, являются депо для микРНК.
У некоторых авторов нет сомнения в том, что микРНК принимают активное участие в регуляции физиологичных процессов; у всех животных они отличаются разнообразием и высокой специфичностью. МикРНК могут быть подвержены действию не только внешних, но и геномных факторов; вероятно, они задействованы в регуляции активности генов. In vivo идентифицировано более тысячи микРНК. В живой клетке поток информации между ядром и цитоплазмой никогда не прекращается. Достижением биологии ХХ века можно считать открытие молекул информационных (матричных) мРНК, которые переносят информацию, "сообщения" из ядра (с хромосом) в органеллы цитоплазмы. Обращается внимание и на то, что биологическое значение микРНК — физиологичного компонента генной регуляции можно рассматривать как один из способов обновления генетической
информации. Полагают также, что МВ выполняют роль челночного механизма для передачи генетической информации между клетками-донорами и акцепторами при экспрессии (активации) молчащих генов.
Поскольку РНК менее гидрофобна, чем ДНК (замена де-зоксирибозы на рибозу), она более лабильна и может относительно свободно перемещаться в клетке, а, следовательно, и доставлять короткоживущие реплики генетической информации (мРНК) к месту, где начинается синтез белка. Важно, что микРНК в клетках является выраженно нестабильной. О какой же регуляции при этом может идти речь? Поддерживать стабильность РНК даже в клетке трудно; она начинает деградировать уже при незначительных изменениях температуры и величины рН. Кроме нестабильности самой РНК, высока в цитозоле и активность рибонуклеаз (РНКаз); они активно расщепляют РНК и проявляют свое действие в широком интервале физико-химических параметров, отличаясь высокой стабильностью. В отличие от РНК ДНК может храниться сотни лет. Многие годы на короткие "обломки" микРНК, которые "загрязняют" реакционную среду, внимания не обращали. Однако со временем стало ясно, что несмотря на все усилия по поддержанию гомогенности инкубационной среды in vitro, образование "обломков" продолжалось и in situ. Позже было установлено, что в цитоплазме всегда присутствуют
Рис. 2. Основы интерференции РНК; разнообразные микРНК выполняют конкретные функции и постепенно становятся продуктами деградации.
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 11, 2011
тысячи коротких двуцепочечных РНК, которые, возможно, выполняют определенные, неясные функции; необходимы для физиологии клетки и организма, а, может быть, являются продуктами физиологичного катаболизма.
В противоположность цитозолю микРНК в составе МЧ является более стабильной, чем ее предшественники в клетках-донорах; она стабильна при длительном хранении и повторных циклах замораживание/оттаивание. Это позитивное условие для использования микРНК в МВ в качестве биологических маркеров. При заболеваниях и полиэтиологичных патологических процессах выделенные МЧ являются формой, которая содержит увеличенную концентрацию специфичной микРНК; ее содержание в плазме крови практически здоровых добровольцев намного ниже. Например, уровень ш1Я-133а микРНК в составе МЧ достоверно выше у пациентов с дилатационной кардиомиопатией. Содержание микРНК повышено в циркулирующих в крови МВ у пациентов с нарушением метаболизма миокарда. При введении антагониста ш1Я-133а состояние гипертрофированного миокарда улучшается. Двуцепочечные молекулы РНК не характерны для нормальных клеток. Специфичный белок Dicer при выявлении в цитозоле клетки двуцепочечной незамкнутой РНК "режет" ее на небольшие фрагменты, которые сходны с микРНК. Судьба этих молекул — выведение из клеток. Для многих организмов (простейших, моллюсков, червей, насекомых, растений) выведение микРНК в межклеточную среду является физиологичным процессом (рис. 2).
Экспрессия микРНК у животных проходит в два этапа. Сначала с гена РНК считывается первичная копия; это могут быть несколько копий РНК, которые выходят в цитоплазму. В ней фермент Dicer (функционально это РНКаза III) вырезает из предшественника микРНК, далее она остается в составе МЧ в межклеточной среде. Изменения в генах микРНК могут быть причастны и к развитию заболеваний. Отмечена возможная роль микроРНК при шизофрении; микРНК miR-140, вероятно, участвует в патогенезе остеоартрита. У мышей с экспрессией микРНК-140 нарушена пролиферация хондроцитов.
Суррогатно афизиологичная мембрана МЧ, возможно, блокирует физиологичное взаимодействие компонентов комплемента, опсонизацию МЧ и поглощение их оседлыми макрофагами в локальном пуле РСТ паракринно регулируемых СК. Фагоцитоз большого биологического "мусора" (макромолекул белка) оседлыми макрофагами в паракринных СК проходит комплементзависимо. К тому же преодоление монослоя эндотелия при реализации биологической реакции трансцитоза в обменных капиллярах обычного типа требует больших затрат энергии. Поэтому в отличие от макромолекул белка и липопротеинов (ЛП) (липидпереносящих белковых макромолекул) комплементзависимый фагоцитоз МЧ оседлыми макрофагами РСТ в филогенетически ранних пара-кринных СК, в том числе в интиме артерий эластического типа, происходит в малой мере.
Удаление МЧ из кровотока, из внутрисосудистого локального пула межклеточной среды осуществляют главным образом макрофаги Купфера в синусоидальных обменных капиллярах и пространствах Диссе печени, в окружении пе-рипортальных гепатоцитов. На поздних ступенях филогенеза макрофаги Купфера, как и окружающие их перипортальные гепатоциты, стали инсулинзависимыми. Основными опсони-нами при фагоцитозе МЧ макрофагами Купфера являются не компоненты комплемента, а филогенетически ранний IgM в форме пентамера. Вероятно, при этом активность опсони-нов и процесса опсонизации определены и особенностями физико-химического состава МЧ. Не исключено, что IgM с функциональными свойствами опсонина синтезируют и сами макрофаги Купфера. При всем уважении к возможному прогностическому значению определения разных МЧ в плазме крови мы полагаем, что это все-таки проявление былой специфичной активности предшественников биологического
"мусора", которая ими окончательно еще не утрачена. Утрата биологической функции является отсроченной и происходит параллельно деградации структур.
Если внимательно рассмотреть становление на ступенях филогенеза и в онтогенезе многочисленные биохимические процессы, которые суммарно именуют "изнанкой метаболизма", многоэтапный катаболизм in vivo биологически активных молекул можно признать реальным, как и поэтапную деструкцию биологически активных структур клеток. В этих структурах биологически активные молекулы далеко не одновременно и не сразу в реакциях катаболизма теряют биологическую активность. В то же время катаболиты гумо-рально активных медиаторов могут приобретать и иную биологическую активность, которая в процессах физиологичной регуляции не была задействована; при катаболизме же она начинает проявляться. Насколько поэтапно происходит разрушение (катаболизм) активных структур клеток, настолько длительно биологически активные молекулы могут проявлять активность, вероятно, в силу изменения параметров их функции; далее за деструкцией клеточных структур следует катаболизм и биологически активных молекул. Более вероятно, что объективно определенная биологическая активность компонентов в составе МЧ в экспериментах in vitro in vivo является иллюзорной, остаточной, убывающей и исчезающей.
В процессе биологической реакции блеббинга в составе МВ может остаться, например, фрагмент физиологичной плазматической мембраны с аминоФЛ и интегральным белком. Этим протеином может быть фермент, комплекс ферментов, клеточная помпа, функционально разные транспортеры и рецепторы, которые можно при использовании иммунохи-мических методов определить в составе МВ. Не исключено, что в МЧ при отделении от клетки-донора может остаться и комплекс ферментов, которые называют метаболоном. При этом объективное иммунохимическое выявление интегральных белков и каталитической активности ферментов все же не является доказательством их участия в регуляции активности клеток и реакций метаболизма in vivo. Вероятно, можно проследить динамику многих подобных процессов в составе МЧ, которая изменяется по убывающей.
Между тем полагают, что МЧ плазмы крови, МВ содержат многие активные молекулы белка, которые задействованы в процессах межклеточной и внутриклеточной сигнализации. Считают, что МВ как субклеточные структуры могут выполнять функцию транспортеров биологически активных молекул между клетками, между МЧ и клетками. Они могут быть вовлечены в регуляцию биологических реакций воспаления, гемокоагуляции, эндотелий(поток)зависимой вазодилатации, апоптоза и пролиферации клеток. Они могут быть звеньями патогенеза заболеваний, в частности ревматоидного артрита и антифосфолипидного синдрома. Показано, что микРНК- 33 может регулировать отток спирта холестерина (ХС) от клеток в составе ЛП высокой плотности (ЛПВП). При этом гепато-циты поглощают ЛПВП путем опосредованного рецепторами эндоцитоза в составе кассетных АВС-транспортеров. Гепатоциты освобождают ЛПВП от принесенного от клеток спирта ХС; после этого ЛПВП опять выходят в кровоток и межклеточную среду с целью связывать из гидрофильной среды новые молекулы ХС. Филогенетически ранний синтез спирта ХС в каждой из животных клеток регулируется на уровне транскприпции и посттрансляционно.
В дополнение к этому микРНК-122 и микРНК-370 могут участвовать в метаболических превращениях триглицери-дов — эфиров ЖК со спиртом глицерином. Это рассматривают как эпигенетическую регуляцию метаболизма ЖК и спиртов, которые вместе формируют неполярные липиды. Напомним, что эпигеномика (эпигенетика) оценивает регуляторные изменения экспрессии генов или фенотипов клеток, опосредованные механизмами, которые не затрагивают изменения в последовательности нуклеотидов в ДНК. Показано, что примерно 10% микРНК в плазме крови ассоциировано с разными
Ф
32
Сопоставление размеров, механизмов образования и переносимых маркеров в составе экзосом, эктосом и телец апоптоза
Структуры Размер, нм Механизмы образования Биомаркеры
Экзосомы 40—100 Внутри клетки, почкованием в эндосому Белки Alix, ESCRT, трансмембранные белки — тетраспа-нины; CD63, CD81 и CD9
Эктосомы 50—1000 Почкованием — выпячиванием плазменной мембраны клетки наружу Интегрины, селек-тины, маркеры родительских клеток, маркер внешней мембраны клетки — ФС
Апотельца До 5000 Распад клеток на части, каждая из которых окружена мембраной Геномная ДНК и цельные органеллы, ФС на внешней мембране
Примечание. Эктосомы — другое название МВ.
классами ЛП, главным образом с ЛПВП. Долгое время МЧ в плазме крови рассматривали как продукты активации тромбоцитов и дали им название "тромбоцитарная пыль".
Несмотря на сходство морфологии и структуры МЧ, МВ, экзосом и телец апоптоза, а также единение методов физико-химического их определения, они отличаются по происхождению (их формируют разные клетки-доноры), составу молекул и способности по-разному реагировать на действие гуморальных медиаторов. Наличие МЧ в плазме крови, МВ и экзосом установлено несколькими десятилетиями ранее; авторы проследили образование МЧ ретикулоцитами, клетками-донорами в процессе физиологичного превращения в эритроциты и потере ядра. При этом рецепторы к трансфер-рину, оставшиеся в МЧ, связывали лиганд столь же активно, как и образованные эритроциты. Следовательно, часть МЧ в плазме крови — это продукты, которые образованы в ходе физиологичных превращений клеток, в частности ретикуло-цитов в эритроциты. Полагаем, что подобное действие не является единственным.
2. Пути образования микровезикул, эндосом и телец апоптоза в крови в реализации биологической функции эндо-экологии. Кроме МВ и экзосом, МЧ в плазме крови являются тельца апоптоза. Они образуются при запрограммированной в онтогенезе гибели клеток, распаде их на отдельные фрагменты; все они окружены афизиологичной плазматической мембраной. Первой является стадия обратимых изменений, при которой апоптоз может быть остановлен и клеточные структуры восстановятся. Далее следует стадия необратимых изменений, во время которой структуры клеток разрушаются и образуются тельца апоптоза (см. таблицу).
Апоптоз (греч. опадание листьев) — программируемая клеточная гибель, регулируемая самоликвидация, в результате которой клетка распадается на отдельные тельца апоптоза. Фрагменты клетки быстро фагоцитируют макрофаги или соседние клетки в рамках физиологичной, биологической реакции воспаления. Морфологически прослеженный апоптоз продолжается 1—3 ч.
Биологическое предназначение апоптоза — реализация биологической функции эндоэкологии, поддержание "чистоты" межклеточной среды in vivo, утилизация дефектных (поврежденных, мутантных, инфицированных) клеток. На ступенях филогенеза апоптоз задействован в дифференцировке клеток и морфогенезе, реализации биологической функции адаптации, становлении биологической реакции врожденного и приобретенного (адаптивного) иммунитета. Биологическая реакция апоптоза реализована у всех эукариотов — от одноклеточных, простейших до высших организмов, позвоночных и приматов. В программируемой смерти прокарио-
Рис. 3. Нарушение при апоптозе асимметрии наружного и внутреннего монослоев плазматической мембраны при действии гиперкальциемии и комплекса ферментов.
Рис. 4. Различие в гибели клеток in vivo по типу некроза с разрывом клеточной мембраны и локальной реакцией воспаления и по типу апоптоза при образовании телец апоптоза, окруженных мембраной.
тов участвуют функциональные аналоги эукариотических белков биологической реакции апоптоза.
Процесс апоптоза начинается только в клетках с сохранившейся функцией митохондрий и требует затрат энергии. Клетки, в которых развивается биологическая реакция воспаления и которые несостоятельны в плане наработки энергии и синтеза аденозинтрифосфата (АТФ), погибают по типу некроза. Апоптоз — генетически контролируемая гибель клеток, некроз — генетически не контролируемая гибель клеток, которая наступает при действии патологических факторов. По типу апоптоза погибают клетки, когда они: а) исполнили функцию in vivo в онтогенезе и перестали быть
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 11, 2011
Рис. 5. Молекулярные механизмы образования МВ: отпочкование, отторжение МВ и гидрофобных рафтов (плотов) плазматической мембраной с "заякоренными" белками.
нужными; б) отработали свой срок и далее исполнять функцию не могут; в) подверглись афизиологичному внешнему воздействию и продолжать функцию не могут.
В организме взрослого путем апоптоза ежедневно гибнут десятки миллиардов клеток. У ребенка 8—14 лет число клеток, которые гибнут путем апоптоза, составляет 20—30 млрд в день. Суммарно масса клеток, на протяжении 1 года подверженных запрограммированному апоптозу, сравнима с массой тела. Восполнение утраченных клеток обеспечивает биологическая реакция пролиферации — увеличение популяции клеток путем деления. Все клетки имеют выраженную асимметрию бислоя ФЛ плазматической мембраны; ее поддерживает специфичный, энергозависимый комплекс ферментов. Он включает флиппазу, флоппазу и скрамблазу; белок активирует перемещение аминоФЛ (в первую очередь ФС) между наружным и внутренним монослоями плазматической мембраны по типу "флип-флоп" (рис. 3). Отрицательно заряженные аминоФЛ, ФС и фосфатидилэтаноламин располагаются во внутреннем монослое мембраны. Фосфа-тидилхолины, доминирующие в наружном монослое мембраны, заряда не имеют.
При поступлении в цитоплазму Са++, содержание которого контролируют гуморальные механизмы на аутокринном уровне, при контролируемом апоптозе градиент концентрации анионных ФЛ в бислое мембраны клеток нарушается. При гиперкальциемии цитозоля локальное ослабление связи мембраны с цитоскелетом сопровождает переход ФС из внутреннего монослоя в наружный с образованием тромбоген-ной поверхности. В этих условиях на мембране эндотелия начинается образования МВ и экзосом. В составе МВ оказываются одновременно с фрагментами мембраны и цитоплаз-матические белки, в частности тканевой фактор. Выставление на мембрану ФС активирует связывание плазменных факторов свертывания и последующую каскадную реакцию гемокоагуляции (рис. 4).
Клетками-донорами, которые образуют МВ, являются ади-поциты, монослой клеток эндотелия (мезотелия), гладкомы-шечные клетки, кардиомиоциты, энтероциты, тучные клетки, моноциты и эритроциты, тромбоциты, нейтрофилы и лимфоциты, гепатоциты, макрофаги Купфера, клетки иммунной системы, пневмоциты и метаплазированные клетки. МЧ, МВ и экзосомы присутствуют во всех биологических средах in vivo: в моче, бронхоальвеолярных промывных водах, слюне, желчи, асцитической и спинномозговой жидкости, грудном молоке. В плазме крови их образуют клетки при многих формах новообразований. МЧ могут преодолеть гематоэнцефалический барьер; их секретируют и клетки эпителия кишечника со стороны как апикальной, так и базолатеральной стороны.
Содержание МЧ в плазме крови здоровых добровольцев составляет 5—50 мкг/мл. Хотя обобщающее название — МЧ не является в полной мере достоверным, его часто
употребляют. Методом цитометрии в потоке показано, что основную массу МЧ, МВ и экзосом образуют клетки крови, главным образом тромбоциты, на долю которых приходится более 80% всех МВ и экзосом плазмы крови. МЧ, образованные не тромбоцитами, можно пытаться использовать в дифференциальной диагностике заболеваний (рис. 5). Циркулируя в большом количестве в плазме крови, МЧ формируют обширную, подвижную тромбогенную поверхность, в которой в афизиологичном количестве присутствуют анионные прокоагулянтные ФЛ — ФС. Давно установлено, что свертывания плазмы крови в отсутствие тромбоцитов не происходит. Это доказывает, что прокоагулянтные структуры присутствуют в плазме крови и их можно удалить путем седиментации при центрифугировании. Реализовать функцию плазматической мембраны тромбоцитов может и "тромбоцитарная пыль".
Часть МВ клетки-доноры подвергают эндоцитозу. Сливаясь с цистернами эндоплазматической сети, подвергаясь гидролизу в лизосомах, они превращаются в экзосомы меньшего размера, которые опять оказываются в межклеточной среде, в плазме крови. Различия в составе МЧ, МВ и экзосом могут стать биомаркерами в диагностике уже существующих и только развивающихся in vivo патологических процессов. На рис. 6 представлены этапы образования экзосом. Кроме того, как указано выше, они содержат факторы адгезии клеток, селектины, кадгерины, эндотелиальную NO-синтазу, матриксные металлопротеиназы, активаторы плазминогена и тромбомодулин. Активность некоторых интегральных ферментов плазматической мембраны можно определять в составе МЧ в течение длительного времени.
В настоящее время механизмы формирования МВ в полной мере не выяснены. Вместе с тем показано, что фрагменты плазматической мембраны клеток отделяются в форме МВ, далее они оказываются в плазме крови или в межклеточной среде. Высокая концентрация Са2+ в цитозоле клеток и реорганизация структуры цитоскелета активируют образование МВ и экзосом. Мелкие белки, которые содержат экзосомы, оказываются компонентами межклеточной среды; будучи гидрофобными, они в гидрофильной плазме крови ассоциируются с МВ, формируя многокомпонентные МЧ. Они содержат фрагменты плазматических мембран, на которые уже подействовали ферменты биологической реакции апоптоза. Возможно присутствие на поверхности МЧ и просто инвертированных фрагментов плазматической мембраны клеток. В зависимости от того, какие клетки являются донорами МВ и экзосом, МЧ могут содержать и биологически активные
Рис. 6. Повторный экзоцитоз отторгнутых МВ и превращение их в экзосомы после гидролиза в лизосомах при циркуляции цитозоль ^ внешняя, межклеточная среда.
34
07_14.¡ndd 34
Ф
24.07.2014 15:08:49
пептиды; последние можно рассматривать как специфичные маркеры деструкции клеток и тканей.
Описано образование экзосом, в которых задействованы тетраспанины, семейство протеинов плазматической мембраны клеток. Это интегральные белки с 4 доменами; с ними с высокой аффинностью физико-химически (не ковалентно) связываются белки и пептиды цитозоля и клеточных орга-нелл, при этом также происходит формирование неспецифичных и гетерогенных по структуре МЧ. Функционально структуры из тетраспанинов по гидрофобности сходны с рафтами из сфинголипидов и спирта ХС; они всегда присутствуют в плазматических мембранах клеток. Тетраспанины могут инициировать физико-химическое межклеточное взаимодействие, миграцию клеток и «по старой памяти» какое-то время передавать гуморальные сигналы при взаимодействии функционально связанных молекул. Методами иммуноэлек-тронной микроскопии показано, что тетраспанины СБбЗ и СБ82 содержат большое количество экзосом.
Полагают, что в физиологичных условиях тетраспанины СБ9 и СБ82 формируют сигнальные комплексы, которые обеспечивают взаимодействие с плазматической мембраной клеток белков адгезии клеток. Кроме того, их вместе с катгерином и фактором транскрипции рассматривают как комплекс факторов образования экзосом. После ультрацентрифугирования разделить МВ и экзосомы довольно сложно. Однако гликосфинголипиды и "заякоренные" ими белки плазматической мембраны чаще можно выявить в экзосомах. Экзосомы активно секретируют ретикулоциты в процессе превращения их в эритроциты. Протеины и ФЛ экзосом являются главным образом компонентами плазматической мембраны клеток-доноров. Экзосомы могут принимать форму инвагинатов, формируя четырехслойные структуры липидов. Реально считать, что возможно более чем однократное превращение МВ в экзосомы, первичных экзосом во вторичные и т. д. при реализации биологической функции эндоэкологии (см. рис. б).
В формировании в плазме крови МЧ, МВ и экзосом участвуют как белки-агонисты, так и белки-антагонисты. Важно понять, что образование как МВ, так и экзосом происходит не только при гибели клеток по типу апоптоза. Возможно, это может быть контролируемый самими клетками процесс "структурного обновления" плазматических мембран. В тромбоцитах формирование и отделение МВ и экзосом, вероятно, является стимулом для поддержания постоянно высокой функциональной активности клеток. К индукторам тромбоцитов относятся адреналин, аденозиндифосфат (АДФ), тромбин, коллаген, Са2+. Кроме того, тромбоциты реагируют на комплекс С5Ь-9 и антитела к тромбоцитам; результатом этого является обратный процесс — ингибирование активности тромбоцитов, однако в этом случае также происходит образование МВ и экзосом. При этом биологические и химические стимулы, механические факторы, вероятно, подобно "реакции сдвига" на поверхности эндотелия, вызывают "обновление" мембраны тромбоцитов, а, возможно, и иных функционально активных клеток.
Гликозилфосфатидилинозитол (ГФИ)-"заякоренные" белки функционируют во всех эукариотических клетках. Это домены структуры плазматической мембраны, образованные наиболее гидрофобными ФЛ с высоким содержанием спирта ХС; в большом количестве их содержат и структуры МВ. Биологическая необходимость подобных структур и особенности их становления на ступенях филогенеза не до конца поняты. Стабилизированными являются ферменты, рецепторы, связывающие протеины, которые вовлечены в реализацию многих физиологичных процессов, в том числе функции "клеточной помпы". Они активируют реакции биохимического катализа, проведение сигнала, функцию адгезии клеток и систему компонентов комплемента. Их роль велика в эмбриогенезе и внутриутробной летальности эмбрионов. Уста -новлена роль ГФИ белков (астроглии) в закрытии нервной
трубки; нарушение этого процесса приводит к такой врожденной патологии, как spina bifida.
Первые доказательства того, что ферменты могут быть прочно стабилизированы в структуре мембраны, получены в 1963 г. Показано, что фосфолипаза бактерий может освобождать из клеток (и из МЧ) щелочную фосфатазу. Нарушение синтеза ГФИ лежит в основе патогенеза парок-сизмальной ночной гемоглобинурии. Отсутствие синтеза регуляторных протеинов С55 и С59 является причиной ком-плементзависимого лизиса эритроцитов. Второй в количественном отношении популяцией МВ является популяция, для которой клетками-донорами служат мононуклеарные фагоциты. Это контрастирует с малым количеством МВ, донорами которых являются Т-лимфоциты и нейтрофилы. Небольшую субпопуляцию МВ составляют те из них, для которых донорами служат клетки эндотелия (мезотелия); они часто имеют антигенные детерминанты, расположенные на поверхности.
Биологической средой для оценки количества и свойств МЧ является моча; клетки-доноры МВ и экзосом в моче представлены эпителием канальцев паракринно регулируемого СК — нефрона, структурной и функциональной единицы почек. В последнее время экзосомы мочи стали определять более тщательно, используя методы протеомики. Протеин ак-вапорин-2 выявлен в составе МВ мочи и отсутствует в иных биологических средах in vivo. Этот протеин рассматривают как тест дисфункции наиболее дистальной части капилляра нефрона, расположенного перед собирательными трубочками. Повышение уровня филогенетически раннего порина расценивают как тест диабетической нефропатии.
Образование МВ из тромбоцитов, клеток, циркулирующих в крови, монослоя эндотелия, а также МЧ из тубуляр-ного эпителия нефрона в моче можно обоснованно считать прогностически важными тестами. В отличие от осуществления клетками биологической реакции экзоцитоза МЧ не преодолевают плазматическую мембрану клеток, они из нее образуются. Преодоление же экзосомами плазматических мембран клеток может происходить и в биологической реакции трансцитоза. На ранних ступенях филогенеза трансцитоз может инициировать система комплемента как часть биологической реакции врожденного иммунитета. Компоненты комплемента могут формировать в мембране белковые поры, которые структурно соответствуют функции филогенетически ранних р-складчатых поринов.
Имеется еще одна возможность выхода МВ и экзосом в межклеточную среду при участии небольших лейциновых протеогликанов, таких как декорин. Этот компонент клеточного матрикса усиливает выход МВ между вновь образованными клетками эндотелия сосудов в процессе их диф-ференцировки. Поскольку бигликан и декорин регулируют в мембране активный и пассивный перенос субстратов, возможен перенос в составе МВ, экзосом и гормонов. Содержание бигликана достоверно увеличено в крови крыс с ожирением и атеросклерозом, при моделировании метаболического синдрома и сахарного диабета 2-го типа. В условиях экспресии стромальных клеток вновь образованных артериол в жировой ткани экспрессия бигликанов и компонентов экстраваскуляр-ного матрикса может модулировать освобождение МВ из ткани и клеток-доноров и перенос их к тем клеткам, которые поглощают МВ, экзосомы и сформированные из них МЧ.
Клетками-донорами могут быть и эритроциты; они тоже образуют МВ и экзосомы, хотя в меньшем количестве, чем тромбоциты. Образование МЧ стимулирует поступление в цитоплазму избытка Са++. МВ эритроцитов не содержат элементов цитоскелета, но в них много белков цитозоля, фрагментов плазматических мембран и гемоглобина. Полагают, что образование эритроцитами МВ предохраняет их от опсо-низации компонентами комплемента. Эритроцитарные МВ с ФС на поверхности суррогатной мембраны могут участвовать в образовании и протромбинового комплекса.
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 11, 2011
Образование МВ из мембраны эритроцитов выражено в большей мере при переливании крови, которую хранили дольше 4 нед. В течение 120 дней циркуляции в кровотоке клетки "тратят" на образование МВ более 20% своего объема. При этом содержание гемоглобина в «старых», малых и более плотных эритроцитах увеличивается на 16%. В эритроцитах постепенно возрастает содержание денатурированного гемоглобина, С-9 компонента комплемента и IgG. Считают, что от денатурированного гемоглобина эритроциты избавляются путем включения его в МВ, удлиняя тем самым время циркуляции клеток в крови. Неясным остается формирование МВ и экзосом при гемолизе эритроцитов активированными эндогенными медиаторами и при серповидно-клеточной анемии. Последняя представляет собой врожденное нарушение первичной структуры гемоглобина (появление в цепи при замещении лишней молекулы валина); гидрофобный валин не дает молекуле возможность сформировать кон-формацию глобулы. Усилено образование эритроцитами МВ и при паразитировании в клетках малярийного плазмодия.
Рассматривают МВ и как факторы иммуномодуляции, как возможную передачу гуморальной информации в везикулах между клетками крови и эндотелием, которые разделены по сути внешней для клеток межклеточной средой, плазмой крови. Несмотря на филогенетические разночтения, все сходятся во мнении, что образование МВ и экзосом эритроцитами-донорами является фактором риска гиперкоагуляции, которая в свою очередь чревата тромбоэмболическими осложнениями. Это состояние призвано всеми как реальное осложнение после трансфузии. МВ эритроцитов способны после переливания крови вызывать состояние выраженной иммуносупрессии. Одновременно с действием МВ эритроцитов связывают и выраженное противовоспалительное действие; доказательства получены при их инкубации с макрофагами. In vitro МВ выраженно ингибировали активацию клеток при действии зимозана А и липополисахарида (ЛПС) бактерий. Одновременно показано, что МВ эритроцитов вызывают снижение секреции макрофагами интерлейкинов (ИЛ) — ИЛ-8 и ИЛ-10, а также фактора некроза опухоли а.
МВ из лейкоцитов-доноров активируют клетки монослоя эндотелия, индуцируя синтез тканевого фактора (ТФ), адгезивных и воспалительных белков и соединений. Уровень
МВ лейкоцитов-доноров в крови повышен при артериальной гипертензии, остром коронарном синдроме, инфаркте миокарда, тяжелой травме, диабете, ВИЧ-инфицировании. Оценка роли МВ и экзосом лейкоцитов связана с анализом регуляции функции клеток и многих гуморальных медиаторов, которые эти функции обеспечивают: молекул адгезии, рецепторов, сигнальных ИЛ, эйкозаноидов — производных эссенциальных полиеновых ЖК. Активированные моноциты экспрессируют образование ТФ, который вместе с адгезивными белками может переходить в состав МЧ.
ТФ — трансмембранный белок, локализованный в мембране фибробластов, макрофагов и гладкомышечных клеток. Вероятно, он присутствует и на базальной мембране эндотелия; на апикальной мембране он может появляться при активации клеток. В физиологичных условиях ТФ отсутствует на мембране циркулирующих лейкоцитов или эритроцитов. При связывании фактора Vila с ТФ формируется активный комплекс, который в присутствии Са++ активирует фактор X свертывания крови. По современным представлениям это есть основной физиологичный путь инициации свертывания крови. ТФ обладает и высокой тромбогенной активностью. При патологии он выявлен и на клетках опухоли как фактор риска тромбозов при онкологической патологии.
Макрофаги интимы артерий и моноциты при стимуляции ЛПС бактерий и ИЛ-1 выставляют на мембрану ТФ. При повреждении клеток синтез ТФ может происходить de novo. Повышение его экспрессии на моноцитах показано при биологической реакции воспаления, сепсисе, опухолях, сердечно-сосудистой патологии, особенно инфаркте миокарда, вне-сосудистой циркуляции крови. Стероидные контрацептивы при приеме per os, курение вызывают повышение содержания ТФ в системе циркуляции, что увеличивает риск формирования тромбов. Экспрессию ТФ на моноцитах определяют методом проточной цитометрии.
После активации разными агонистами тромбоциты начинают образовывать МВ и экзосомы. МЧ имеют на поверхности фрагменты мембранных белков тромбоцитов. Особое значение придается функциональному комплексу адгезии, образуемому гликопротеинами Ib-V-IX, IIb-IIIa и P-селектином. МВ тромбоцитов способны связываться с
TNFa LPS
Camptothesin CRP PAI Trombin Uremic toxins OX-LDL Cytokines ROS
Low shear stress?
Рис. 7. Действие пато- и афизиологичных факторов на эндотелий как клеток-доноров вызывает формирование МВ и экзосом, уменьшает ангиогенез, продукцию N0, активирует тромбоз и гибель клеток по типу апоптоза.
Ф
Рис. 8. Отложение фибрина на поверхности МЧ в кровотоке при отсутствии свертков белка на мембране эндотелия; большое количество в плазме крови МЧ, МВ, экзосом и телец апоптоза.
моноцитами, фибрином и белками матрикса интимы артерий эластического типа. Наличие на поверхности клеток ФС обеспечивает связывание факторов свертывания II, VII, IX, X. Пока нет доказательств присутствия в тромбоцитах ТФ. Между тем МВ тромбоцитов индуцируют образование ТФ моноцитами. МВ тромбоцитов могут индуцировать экспрессию генов, которые инициируют сигнализацию, клеточный рост и пролиферацию, развитие биологической реакции воспаления. МВ тромбоцитов обеспечивают активацию гемоко-агуляции, а также подключение компенсаторных реакций in vivo в ответ на повреждение тканей.
Монослой эндотелия физиологично препятствует свертыванию крови, продуцируя ингибиторы адгезии и агрегации тромбоцитов и лейкоцитов (NO, простациклины групп 2 и 3). Он выставляет на плазматическую мембрану молекулы со свойствами антикоагулянтов: тромбомодулин, ингибитор ТФ, рецепторы активаторов плазминогена, гли-
козаминогликаны. В условиях патологии (изменение величины напряжения сдвига на мембране эндотелия, действие ИЛ, тромбоксана, ЛПС, тромбина, адгезия тромбоцитарных и лейкоцитарных МВ, уремических токсинов, активных форм О2 и окисленных ЛП) (рис. 7) происходит подавление антикоагулянтной активности и начинает преобладать прокоагулянтное действие монослоя эндотелия. Его обеспечивает секреция фактора фон Виллебранда, фактора активации тромбоцитов, АДФ, экспрессия на мембране ТФ и ФС. Все это потенцирует образование МВ на мембране эндотелия. МВ и экзосомы проявляют прокоагулянтные свойства, поскольку непосредственно активируют гемостаз подобно тромбоцитарным и лейкоцитарным МВ, а также путем стимулирования тромбогенного ответа тромбоцитов и лейкоцитов. В зависимости от фазы образования тромба и местонахождения в нем эндотелиальные МВ могут также обеспечивать на поверхности превращение плазминогена в плазмин.
Увеличение количества циркулирующих в крови МВ из эндотелия-донора отмечено у больных с артериальной ги-пертензией, ишемическим инсультом и антифосфолипид-ным синдромом. Свертывание крови и формирование нитей фибрина и агрегатов тромбоцитов происходят не только на функционально измененной плазматической мембране эндотелия, но и на суррогатной, иногда инвертированной, мембране МЧ и МВ, которые циркулируют в крови. На рис. 8 можно видеть, что в крови сформированы агрегаты МЧ и МВ с отложением на них массы фибрина, и эти агрегаты свободно циркулируют в кровотоке. Одновременно, глядя на количество циркулируюших в крови МЧ и МВ на рисунке, можно представить, какова может быть ситуация, если отложение фибрина и агрегатов тромбоцитов будет происходить на большем количестве МЧ, тромбогенной, инвертированной поверхности МВ и тельцах апоптоза. Вероятно, вся кровь может превратиться в единую массу МЧ + МВ + тельца апоптоза + клетки крови + эндотелий; все они связаны молекулярными нитями полимеризованного фибрина. Подобным образом, возможно, формируется синдром диссеминирован-ного внутрисосудистого тромбоза.
<9
/тха2
/
Hyperreactivity Hyperactivity
MPs^
Smooth muscle cells
- /iNO-synthase ^
_ I Relaxation --O,
Endotheliol cells
MPs
MPs
MPs
Рис. 9. Нарушение биологической реакции эндотелийзависимой вазодилатации при действии МЧ плазмы крови. MPs — МЧ. Вверху — гладкомышечная клетка, внизу — монослой эндотелия. COX — циклооксигеназа.
КЛИНИЧЕСКАЯ ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА, № 11, 2011
Образование МЧ, МВ, экзосом и поступление их в кровь происходит как в физиологичных условиях, так и при патологии. В норме при кратковременной стимуляции клеток МВ обеспечивают локальное усиление тромбообра-зования. В зависимости от клеток-доноров МВ имеют на поверхности молекулы клеточной адгезии, ТФ, рецепторы, антигены, мембранные транспортеры, медиаторы иммунных реакций и апоптоза. Можно предположить, что именно МЧ и МВ обеспечивали (обеспечивают) функциональное взаимодействие клеток крови и филогенетически ранний вариант обмена информацией между ними в межклеточной среде. Однако более вероятно, что взаимодействия клетки ^ МЧ на более поздних ступенях филогенеза специализировались на реализации все-таки биологической функции эндоэкологии, поддержании "чистоты" межклеточной среды in vivo.
При активации апоптоза или гибели клеток по типу некроза происходит длительное, латентное или острое дис-семинированное внутрисосудистое свертывание крови с повышением ее вязкости и нарушением кровообращения во всем артериальном русле. Это наблюдается и при некоторых инфекционных, вирусных заболеваниях. Подобное состояние может быть активированным и как осложнение гемотрансфузии.
МЧ плазмы крови активируют гемокоагуляцию с разных сторон. Наличие на суррогатной мембране МЧ увеличенного количества молекул ФС активирует протеазы каскада гемо-коагуляции и функцию тромбоцитов. МЧ, содержащие ТФ, создают одновременно условия как для инициирования, так и для поддержания гемокоагуляции; одновременно МЧ активируют и тромбообразование. Наличие в крови повышенной концентрации МЧ, МВ и экзосом создает условия для их длительного нахождения на грани норма ^ гиперкоагуляция + тромбоз. МЧ активируют свертывание крови, оказывая действие на два фактора — фактор VII свертывания крови/ ТФ. На основании прокоагулянтного действия МЧ показано, что лишенная тромбоцитов плазма крови от пациентов с антифосфолипидным синдромом обладает повышенной активностью тромбина по сравнению со здоровыми добровольцами. Она определена присутствием МЧ и позитивно коррелирует с их количеством.
Действие фактора некроза опухоли а на культивируемые клетки эндотелия пупочной вены увеличивает образование МВ и ТФ. Большее количество МЧ эндотелия сокращало время образования свертка по сравнению с таким же количеством МЧ от клеток-доноров, которые не были стимулированы фактором некроза опухоли а. Это действие отсутствовало в плазме крови с дефицитом VII фактора свертывания крови. Другие авторы выделили из плазмы крови здоровых добровольцев МЧ, которые в малой мере активировали образование тромбина. МЧ способствуют отложению тромбоцитов и фибрина в местах повреждения стенки сосудов, в местах накопления ТФ. В модельной системе у мышей показано, что флюоресцентно меченные МЧ концентрировались в очагах формирования тромбов.
Увеличение содержания МЧ в плазме крови отмечено при многих заболеваниях. Корреляционные отношения между количеством МЧ в плазме крови, клетками-донорами и функцией монослоя эндотелия определяют протеины, включая тромбомодулин и молекулы адгезии клеток. Растворимые молекулы адгезии имеют прямое отношение к формированию дисфункции эндотелия. Как следует из рис. 9, афизиологичное действие МЧ и МВ на функцию монослоя эндотелия и биологическую реакцию эндотелий(поток) зависимой вазодилатации является многоплановым. Клетки эндотелия поглощают МЧ из плазмы крови путем кавеолин-зависимого эндоцитоза, после чего биологически активные компоненты МВ ингибируют активность эндотелиальной NO-синтазы. С другой стороны, МВ активируют системы продукции активных форм О2; они инактивируют синтези-
рованный эндотелием N0, блокируя его биодоступность для гладкомышечных клеток. Вместе с тем компоненты МЧ ингибируют синтез клетками простациклина, фактора гиперполяризации, без которых будет отсутствовать биологический ответ в форме расслабления гладкомышечных клеток под действием N0.
Основу патогенеза преэклампсии беременных составляет нарушение физиологичной проницаемости бислоя клеток на границе локального амниотического и единого пула межклеточной среды. Бислой клеток со стороны единого пула среды матери — монослой эндотелия, со стороны плода — монослой трофобластов плаценты; преодоление бислоя происходит при реализации биологической реакции трансцитоза. Нарушение проницаемости бислоя может сформироваться отдельно за счет нарушений в монослое эндотелия, но чаще все-таки трофобластов. При любом из этиологических факторов это будет причиной увеличения градиента субстратов, метаболитов, О2, кислотно-основного равновесия, уровня электронов между матерью и плодом. Более выраженные изменения параметров, повышение содержания катаболитов и СО2 происходит у плода. Это приведет к гибели клеток, формированию в плаценте биологической реакции воспаления, метаболическому ацидозу, усилению нейтрофилами секреции активных форм О2, инактивации ими N0, усилению оседлыми макрофагами утилизации биологического "мусора" и формированию клетками-донорами МЧ, МВ, экзосом и телец апоптоза, изменению активности циклооксигеназы и синтеза простациклина — фактора гиперполяризации мембраны. Одновременно происходит усиление функции оседлых макрофагов, утилизация ими биологического "мусора", нарушение биологической функции эндотелия. Нарушение микроциркуляции в плаценте, биологической функции трофологии и гомеостаза вызывает спазм артериол мышечного типа, увеличивая периферическое сопротивления кровотоку. Одновременно вегетативная информация с уровня локальных интерорецепторов по афферентным путям достигнет со-судодвигательного центра продолговатого мозга.
Далее эфферентная сигнализация на миокард компенсаторно повысит артериальное давление в проксимальном отделе артериального русла, и начнется развитие артериальной гипертензии беременных, которое может осложниться клиническим состоянием преэклампсии. Пропорционально тяжести преэклампсии в плазме крови повышается концентрация МЧ, МВ и экзоцитов, что происходит пропорционально повышению и иных неспецифичных тестов биологической функции эндоэкологии, биологической реакции воспаления: а) снижению биодоступности N0 для гладко-мышечных клеток; б) повышению концентрации ионов ни-трозила (ООО№); в) увеличению концентрации активных форм О2 в биологических средах; г) формированию состояния гиперкоагуляции и д) активированного тромбоза. Если все происходящие изменения реально определены формированием биологической реакции воспаления, то будет ли физиологично ее ингибирование снижению в плазме крови содержания МЧ, МК и экзосом. Прием ш-3 эссенциальных полиеновых ЖК пациентами, перенесшими инфаркт миокарда, снижал концентрацию МЧ и МВ, образованных эндотелием и тромбоцитами как клетками-донорами. Это происходило параллельно с нормализацией тестов гемокоа-гуляции и тромбообразования.
Для подведения итога вернемся к рассмотрению биологической роли МВ с учетом содержания в них большого количества гуморальных медиаторов (регуляторов) и даже коротких цепей РНК. Некоторые авторы расценивают МВ как средство иммуномодуляции, возможное средство передачи гуморальной информации в форме везикул между отдельными клетками и монослоем эндотелия. Все клетки отделены друг от друга межклеточной (внешней) средой, но вынуждены общаться и единственным способом общения выбрали материально и энергетически очень затратный путь обмена
Ф
38
гуморальными медиаторами в форме МВ, отдавая "кусочки себя ради дела, жертвуя собой".
В то же время все авторы, которые придерживаются этой точки зрения, не упоминали о поэтапном становлении биологических функций и биологических реакций на ступенях филогенеза. Не исключено, что на его ранних ступенях, на этапе первых контактов единичных, разрозненных клеток во внешней среде подобный способ общения был единственно возможным. Возможно, столь сложным путем в течение сотен миллионов лет происходило формирование самых ранних паракринных СК. В них диффузия гуморальных медиаторов в рамках группы клеток, но уже без везикул, привела к формированию самых ранних регулируемых сообществ из функционально разных клеток. Через миллионы лет эти па-ракринно регулируемые СК стали структурными и функциональными единицами каждого из органов.
Трудно представить, что возможный способ самого раннего в филогенезе гуморального общения клеток сохранит свое значение в современных условиях. Вместе с тем, согласно методологическому подходу биологической преемственности в становлении биологических функций и биологических реакций, биологические реакции МВ продолжают функционировать, но с несколько иными целями. Ведь продолжается in vivo одна из самых древних биологических реакций — внеклеточное пищеварение. Ее реализуют оседлые макрофаги в интиме артерий эластического типа при секреции ими металлопротеиназ — функция та же, а цели уже иные.
Мы полагаем, что МЧ плазмы крови — это гетерогенная популяция изначально образуемых клетками-донорами МВ, экзосом и телец апоптоза, которые затем становятся основой спонтанного, физико-химического формирования в плазме крови комплексов на принципах абсорбции, гидрофобности и ионного взаимодействия в водной среде нерастворимых структурных компонентов клеток. С функциональной точки
зрения мы считаем, что образование МЧ в крови в локальном пуле внутрисосудистой плазмы крови есть филогенетически поздняя система реализации биологической функции эндоэкологии. Она включает: а) МЧ, МВ, экзосомы и тельца апоптоза — элементы реализации биологической реакции поддержания "чистоты" межклеточной среды; б) высокоспециализированный фагоцитоза МЧ макрофагами Купфера в печени. В совокупности это филогенетически поздняя система биологической функции эндоэкологии на уровне организма.
Вопросы для самоконтроля
1. Какова роль в организме биологической функции апо-птоза?
2. Каково различие в плазме крови МЧ, МВ, экзосом и телец апоптоза?
3. Какие клетки-доноры образуют в кровотоке МВ?
4. Каковы взаимоотношения МЧ в крови и биологической реакции эндотелий(поток)зависимой вазодилатации?
5. Каковы представления о физиологичной роли МЧ и МВ в крови, какую физиологичную функцию они реализуют?
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Bolanger C.M., Amabile N., Tedgui A. Circulating microparticles a potential prognostic marcer for atherosclerotic vascular disease. Hypertension. 2006; 48: 180-6.
2. Lynch S.F., Ludlam C.A. Plasma microparticles and vascular disorders. Br. J. Haematology. 2007; 137: 36—48.
3. Rubin O., Canellini G., Delobel J. et al. Red blood cell macroparticles: clinical relevance. Transfus. Med. Hemother. 2012; 39: 342—7.
4. Turco S., Basta G., Lazzerini G. et al. Effect of the administration of n-3 polyunsaturated fatty acids on circulating levels of microparticles in patients with a previous myocardial infarction. Haemotologica. 2008; 93(6): 892—9.
Поступила 17.12.13
