CC BY
0OECD+WoS: 1.06+RQ (Mycology) https://doi.org/10.31993/2308-6459-2024-107-3-16677
Полнотекстовая статья
МИКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЗЕРНА ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ УРОЖАЯ 2023 ГОДА ИЗ КРАСНОДАРСКОГО КРАЯ
Е.П. Арабина12, А.С. Орина1*, О.П. Гаврилова1, Н.Н. Гогина3
'Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург 2Национальный исследовательский университет ИТМО, Санкт-Петербург 3Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства, Сергиев Посад
* ответственный за переписку, e-mail: [email protected]
C помощью количественной ПЦР (кПЦР) и высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС/МС) выявлено повсеместное присутствие грибов Fusarium и Alternaría и продуцируемых ими микотоксинов в зерне озимой пшеницы, выращенной в Краснодарском крае в 2023 году. Во всех образцах обнаружена ДНК грибов Fusarium, продуцирующих трихотеценовые микотоксины (Tri-Fusarium) в диапазоне количеств 244-23537 пг/мкг. Доля образцов, в которых выявлена ДНК грибов Fusarium, продуцирующих фумонизины (Fum-Fusarium), в количестве от 27 до 923 пг/мкг, составила 35 %. В зерне всех образцов выявлена ДНК грибов Alternaria: содержание ДНК Alternaria секции Alternaria в среднем оказалось 3630±144 пг/мкг, а ДНК Alternaria секции Infectoriae - 6814±214 пг/мкг. Из анализированных 36 микотоксинов в зерне обнаружены 17, в каждом образце от 3 до 11 соединений. Среди микотоксинов грибов Fusarium чаще других в зерне встречались дезоксиниваленол (ДОН) (в 79 % образцов), дезоксиниваленол-3-глюкозид (в 50 %), НТ-2 токсин (в 47 %) и боверицин (в 70 %). В двух образцах зерна (6 % от общего числа) обнаружено превышение предельно допустимой концентрации ДОН в 2 и 3 раза. Установлена достоверная положительная связь между количествами ДНК Tri-Fusarium и ДОН, а также зеараленоном, что указывает на доминирование гриба F. graminearum среди возбудителей фузариоза зерна в этом регионе. Продемонстрирована высокая встречаемость в зерне микотоксинов грибов Alternaria - альтернариола (82 % загрязнённых образцов), тентоксина (ТЕН) (100 %) и тенуазоновой кислоты (79 %). Установлены достоверные связи между содержанием ДНК Alternaria секции Alternaria и двух микотоксинов - метиловым эфиром альтернариола и ТЕН. Выявлены достоверные различия между образцами из разных районов Краснодарского края по контаминации зерна грибами Fusarium и Alternaria, а также их микотоксинами.
Ключевые слова: грибы, ДНК, Alternaria, Fusarium, количественная ПЦР, микотоксины, ВЭЖХ-МС/МС Поступила в редакцию: 05.09.2024 Принята к печати: '8.10.2024
В России лидером по площади выращивания озимой пшеницы является Южный федеральный округ (ФО), в котором расположены 43.7 % посевов этой культуры (15688 тыс. га) в 2023 г., преимущественно сосредоточенных в Краснодарском крае (Федеральная служба государственной статистики, 2024).
Одним из наиболее экономически значимых заболеваний озимых и яровых зерновых культур в Краснодарском крае является фузариоз, вызываемый различными видами грибов рода Fusarium. Кроме прямой потери урожая, ухудшения семенных качеств зерна, вредоносность фузариоза также заключается в загрязнении получаемой продукции микотоксинами - токсичными вторичными метаболитами грибов Fusarium. К наиболее опасным из них относятся трихотеценовые микотоксины, включающие дезоксинива-ленол (ДОН), Т-2 токсин, ниваленол (НИВ) и др., а также фумонизины (ФУМ). В продовольственном зерне пшеницы и продуктах его переработки нормируется содержание трёх микотоксинов, образуемых грибами рода Fusarium: количество Т-2 токсина не должно превышать 100 мкг/кг, ДОН - 700 мкг/кг и зеараленона (ЗЕН) - 1000 мкг/кг (ТР ТС 021/2011; ТР ТС 015/2011).
Из всего разнообразия грибов рода Fusarium, колонизирующих зерно, в Южном ФО превалирует агрессивный патоген F. graminearum, продуцирующий ДОН и ЗЕН, однако также могут встречаться другие виды этого рода с разнообразными жизненными стратегиями и взаимодействующие с растением как эндофиты, сапротрофы или патогены (Жалиева, 2010; Гагкаева и др., 2012; Гагкаева, Гаврилова, 2014; Шипилова и др., 2014; Горьковенко и др., 2017; Мустафина, Таракановский, 2018; Жемчужина и др., 2020).
Начиная с 2010 г. в образцах зерна из Краснодарского края стали массово выявлять грибы F. sporotrichioides и F. langsethiae, которые активно синтезируют Т-2 и НТ-2 токсины, что приводит к накоплению этих микотоксинов в зерне (Гагкаева и др., 2012; Гаврилова, Гагкаева, 2020). В то же время отмечена низкая (не более 3 %) заражённость зерна пшеницы F. proliferatum и F. verticillioides - представителями комплекса видов Fusarium fujikuroi (FFSC), -продуцентами ФУМ (Гагкаева и др., 2012). Однако ранее сообщалось о загрязнённости ФУМ 50 % образцов пшеницы, выращенной в 2011-2014 гг. на юге России (Дробин и др., 2015), а также об обнаружении этих микотоксинов в
© Арабина Е.П., Орина А.С., Гаврилова О.П., Гогина Н.Н. Статья открытого доступа,
публикуемая Всероссийским институтом защиты растений (Санкт-Петербург) и распространяемая на условиях Creative Commons Attribution License 4.0 (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
двух образцах пшеницы из Краснодарского края урожая 2017 г. в количестве 410 и 1990 мкг/кг (Kononenko et al., 2020).
Чаще грибов рода Fusarium, в образцах зерна из Южного ФО встречаются грибы рода Alternaria (до 100 % образцов), преимущественно представители секций Alternaria и Infectoriae, частота обнаружения которых в разные годы может значительно варьировать (Ганнибал, 2018). Эти грибы повсеместно распространены в микобиоте зерновых культур и, по всей видимости, обитают в зерне как эндофиты (Sun et al., 2023; Sharon et al., 2024), при этом не оказывая существенного влияния на показатели качества зерна (Kosiak et al., 2004; Орина и др., 2020). Однако, грибы Alternaria продуцируют разнообразные микотокси-ны, среди которых наиболее часто в зерне обнаруживают альтернариол (АОЛ), монометиловый эфир альтернарио-ла (АМЭ), тентоксин (ТЕН) и тенуазоновую кислоту (ТК) (Tralamazza et al., 2018; Masiello et al., 2022). В России содержание этих и других альтернариотоксинов в зерне не регламентируется, несмотря на их негативное действие на организм потребителей зернопродукции (Chen et al., 2021; Аксёнов и др., 2023). Ранее неоднократно выявляли критически высокие значения микотоксинов, продуцируемых Alternaria, в зерне из разных регионов РФ (Kononenko et al., 2020; Орина и др., 2020, 2021; Седова и др., 2024).
Наличие проблемы заражённости зерновых культур токсинопродуцирующими грибами ведет к необходимости микотоксикологической характеристики получаемого
Материалы
Образцы зерна
Проанализировано 34 образца озимой пшеницы, выращенной в 19 хозяйствах из восьми районов Краснодарского края (Белоглинский, Динской, Калининский, Каневской, Кореновский, Красноармейский, Тбилисский и Успенский) в 2023 г. Из них 26 были отобраны из партий зерна товарного, а остальные - из партий семенного назначения (табл. 1). Лабораторные анализы выполнены в период апрель - май 2024 г.
Из каждого среднего образца отбирали навески по 20 г зерна, которые затем размалывали с помощью лабораторной мельницы Stegler ЛЗМ-1-02 (Stegler, Китай) при 22000 об/мин в течение 1 мин. Полученные размолы хранили при -20 °C.
Экстракция ДНК и измерение её концентрации
Экстракцию общей ДНК из 200 мг муки каждого образца проводили по адаптированному ранее протоколу (Orina et al., 2018). Из мицелия коллекционных штаммов грибов Fusarium и Alternaria выделяли ДНК согласно общепринятой методике с помощью 2 % раствора цетилтримети-ламмоний бромида и хлороформа. Все использованные в исследовании референсные штаммы грибов идентифицированы с помощью молекулярно-генетических методов и хранятся в коллекции лаборатории микологии и фитопатологии ФГБНУ ВИЗР (табл. 2).
Концентрацию ДНК, выделенной из мицелия грибов, измеряли с использованием набора Quant-iT dsDNA HS Assay Kit (0-100 ng), ДНК из зерновой муки - Quant-iT dsDNA BS Assay Kit (0-1000 ng) на флуорометре Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific, США). ДНК штаммов грибов
зерна. Благодаря способности одного вида одновременно продуцировать различные метаболиты, встречаемость в зерне нескольких разных грибов может представлять угрозу его загрязнения спектром микотоксинов.
За последние годы количественная ПЦР (кПЦР) зарекомендовала себя как объективный аналитический метод количественного выявления биомассы грибов, выраженного через содержание их ДНК, в растительном материале, и успешность его применения для оценки заражённости зерна разными таксономическими группами продемонстрирована неоднократно (Гагкаева и др., 2017; Gagkaeva et al., 2019; Orina et al., 2018, 2020, 2021; Каракотов и др., 2019). Определяемое этим методом содержание ДНК целевого объекта (токсинопродуцирующего гриба или группы близкородственных видов) во многих случаях позволяет уверенно прогнозировать содержание продуцируемых им/ими микотоксинов вследствие высокой достоверной положительной связи между этими количественными показателями (Gagkaeva et al., 2018, 2019; Orina et al., 2021; Лебедин и др., 2021). Другими преимуществами использования кПЦР являются её высокая специфичность, объективность и быстрота получения результатов, что может являться решающим фактором при принятии решения о целевом назначении той или иной партии зерна.
Цель работы - охарактеризовать образцы озимой пшеницы, выращенной в Краснодарском крае в 2023 г., по заражённости грибами Alternaria и Fusarium и контаминации микотоксинами.
и методы
разводили деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл и использовали в качестве стандартов для построения калибровочных кривых при проведении кПЦР. Концентрацию ДНК, выделенной из зерновой муки, выравнивали до 30-80 нг/мкл в каждом образце.
Анализ содержания ДНК грибов
Содержание ДНК видов Fusarium, способных продуцировать трихотеценовые микотоксины (Tri-Fusarium) и ДНК видов Fusarium, продуцирующих фумонизины (Fum-Fusarium) оценивали методом кПЦР с пробами TaqMan. Реакции проводили в объеме 20 мкл, содержащем 10 мкл мастер-микса 2*TaqAB (АлкорБио, Россия), по 300 нМ каждого праймера, 100 нМ флуоресцентного зонда (АлкорБио, Россия) и 2 мкл раствора ДНК. Содержание ДНК грибов секций Alternaria и Infectoriae рода Alternaria выявляли методом кПЦР с красителем SYBR Green. Реакцию проводили в объеме 20 мкл, содержащем 4 мкл мастер-микса 5*qPCRmix-HS SYBR (Евроген, Россия), по 500 нМ каждого праймера и 2 мкл раствора ДНК. Последовательности праймеров и протоколы амплификации приведены в таблице 3. Реакции проводили на термоци-клере CFX96 Real-Time System (BioRad, США) минимум в двух повторностях. Среднее и стандартные ошибки рассчитывали с использованием программного обеспечения Bio-Rad CFX Manager 1.6. В каждом образце оценивали долю ДНК грибов к общей ДНК (пг/нг). Нижний достоверный предел выявления содержания ДНК грибов в пробе общей ДНК из образца муки установлен на уровне 5х10-4 пг/нг.
Таблица 1. Образцы зерна озимой пшеницы, Table 1. Grain samples of winter wheat grown in
выращенной в Краснодарском крае в 2023 г. Krasnodarskiy Krai in 2023
№ п/п Район Сорт пшеницы Назначение партии зерна ## Disctrict Wheat variety Grain batch purpose
1 Безостая 100 Товарное 1 Bezostaya 100 Food / feed
2 Маркиз Семенное 2 Markiz Seed
3 Классика Товарное 3 Classika Food / feed
4 Стиль Товарное 4 Stil Food / feed
5 6 Гром Школа Товарное Товарное 5 6 Grom Shkola Food / feed Food / feed
7 Стиль Товарное 7 Stil Food / feed
8 Белоглинский Школа Товарное 8 Beloglinskiy Shkola Food / feed
9 Стиль Товарное 9 Stil Food / feed
10 Степь Товарное 10 Step Food / feed
11 Ахмат Товарное 11 Akhmat Food / feed
12 Таня Товарное 12 Tanya Food / feed
13 Васса Семенное 13 Wassa Seed
14 Гром Семенное 14 Grom Seed
15 Стиль Семенное 15 Stil Seed
16 Динской Ахмат Товарное 16 Dinskoy Akhmat Food / feed
17 Таня Товарное 17 Tanya Food / feed
18 19 Калининский Ахмат неизв. Товарное Товарное 18 19 Kalininskiy Akhmat unknown Food / feed Food / feed
20 неизв. Товарное 20 unknown Food / feed
21 22 Каневской сортосмесь Гром Товарное Товарное 21 22 Kanevskoy variety mix Grom Food / feed Food / feed
23 Юка Товарное 23 Yuka Food / feed
24 25 Кореновский Ахмат неизв. Товарное Товарное 24 25 Korenovskiy Akhmat unknown Food / feed Food / feed
26 Красноармейский Стан Товарное 26 Krasnoarmeyskiy Stan Food / feed
27 Алексеич Товарное 27 Alekseich Food / feed
28 Федор Семенное 28 Fedor Seed
29 Классика Семенное 29 Classika Seed
30 31 Тбилисский сортосмесь Безостая-100 Семенное Товарное 30 31 Tbilisskiy variety mix Bezostaya-100 Seed Food / feed
32 Таня Товарное 32 Tanya Food / feed
33 Стиль-18 Товарное 33 Stil-18 Food / feed
34 Успенский неизв. Семенное 34 Uspenskiy unknown Seed
Таблица 2. Штаммы грибов Alternaría и Fusarium, использованные в исследованиях
Вид Штамм Происхождение Растение-хозяин, субстрат Год выделения
F. graminearum (Tri-Fusarium *) MFG 58746 Беларусь рожь, зерно 2009
F. verticillioides (Fum-Fusarium) MFG 59009 Грузия кукуруза, зерно 2016
A. tenuissima (секц. Alternaría) MFP 556101 Россия, Астраханская обл. томат, лист 2008
Alternaria sp. (секц. Infectoriae) MFP 094161 Россия, Ленинградская обл. пшеница, зерно 2006
* Tri-Fusarium и Fum-Fusarium - группы видов грибов Fusarium, продуцирующих трихотеценовые микотоксины или
фумонизины соответственно.
Table 2. Alternaria and Fusarium strains used in the study
Species Strain Origin Host, substrate Year
F. graminearum (Tri-Fusarium *) MFG 58746 Belarus rye, grain 2009
F. verticillioides (Fum-Fusarium) MFG 59009 Georgia corn, grain 2016
A. tenuissima (sect. Alternaria) MFP 556101 Russia, Astrakhan Oblast tomato, leaf 2008
Alternaria sp. (sect. Infectoriae) MFP 094161 Russia, Leningrad Oblast wheat, grain 2006
* Tri-Fusarium & Fum-Fusarium - species groups of the Fusarium fungi producing trichotechene mycotoxins and fumosinins, respectively.
Таблица 3. Праймеры, зонды и протоколы количественной ПЦР, использованные в работе
Целевой объект* Праймеры и зонды Нуклеотидные последовательности (5' ^ 3') Схема ПЦР Литературный источник
Tri-Fusarium TMTri,f TMTri,r TMTri,p CAGCAGMTRCTCAAGGTAGACCC AACTGTAYACRACCATGCCAAC Cy5-AGCTTGGTGTTGGGATCTGTCCTTACCG-BHQ2 95o - 3 мин; [95o - 15 с; 60o - 60 с]х40 Halstensen et al., 2006
Fum-Fusarium fum1_fw fum1_rev fum1_probe ATGCAAGAGGCGAGGCAA GGCTCTCAGAGCTTGGCAT Cy5-CAATGCCATCTTCTTGAAACCT-BHQ2 95o - 3 мин; [95o - 15 с; 58o - 45 с]х40 Preiser et al., 2015
Alternaria секц. Alternaria AAF2 AAR3 TGCAATCAGCGTCAGTAACAAA ATGGATGCTAGACCTTTGCTGAT 50o - 2 мин; 95o - 10 мин; [95o - 15 с; 67o - 60 с; 72o - 5 с]х40 Konstantinova et al., 2002, Orina et al., 2021
Alternaria секц. Infectoriae AinfF3 AinfR4 CTCGATGTCCGCCTCAGTAG GAGGATAGCACGGCTGGTAG 50o - 2 мин; 95o - 10 мин; [95o - 15 с; 67o - 60 с; 72o - 3 с]х40 Gannibal et al., 2007; Orina et al., 2021
* см. примечание к таблице 2. Table 3. Primers, probes and PCR protocols used in the study
Target* Primers and probes Nucleotide sequences (5' ^ 3') PCR protocol Reference
Tri-Fusarium TMTri,f TMTri,r TMTri,p CAGCAGMTRCTCAAGGTAGACCC AACTGTAYACRACCATGCCAAC Cy5-AGCTTGGTGTTGGGATCTGTCCTTACCG-BHQ2 95° - 3 min; [95° - 15 sec; 60° - 60 sec]x40 Halstensen et al., 2006
Fum-Fusarium fum1_fw fum1_rev fum1_probe ATGCAAGAGGCGAGGCAA GGCTCTCAGAGCTTGGCAT Cy5-CAATGCCATCTTCTTGAAACCT-BHQ2 95° - 3 min; [95° - 15 sec; 58° - 45 sec]x40 Preiser et al., 2015
Alternaria sect. Alternaria AAF2 AAR3 TGCAATCAGCGTCAGTAACAAA ATGGATGCTAGACCTTTGCTGAT 50° - 2 min; 95° - 10 min; [95° - 15 sec; 67° - 60 sec; 72° - 5 sec]x40 Konstantinova et al., 2002, Orina et al., 2021
Alternaria sect. Infectoriae AinfF3 AinfR4 CTCGATGTCCGCCTCAGTAG GAGGATAGCACGGCTGGTAG 50° - 2 min; 95° - 10 min; [95° - 15 sec; 67° - 60 sec; 72° - 3 sec]x40 Gannibal et al., 2007; Orina et al., 2021
* see the Table 2 footnote.
Анализ содержания микотоксинов Экстракцию проводили из 5 г зерновой муки путем добавления 20 мл экстракционного растворителя (аце-тонитрил/вода/уксусная кислота, 79:20:1, об/об/об) и перемешивания на ротационной шейкере ПСУ-20 (Biosan, Латвия) за 90 мин. Затем экстракты центрифугировали 2 мин при 3000 об/мин (Polycom CLn-16, Россия). По 500 мкл каждого экстракта без какой-либо очистки переносили в стеклянные флаконы и добавляли 500 мкл раствора ацетонитрил: вода: уксусная кислота 20:79:1. Затем флаконы герметично закрывали и встряхивали в течение 30 с на Vortex Genius3 (IKA, Германия). Для анализа отбирали по 5 мкл каждого раствора экстракта автосамплером Agilent (Agilent Technologies, Германия). Детекцию и количественное определение микотоксинов проводили на системе AB SCIEX Triple Quad™ 5500MS/MS (Applied Biosystems, США), оснащенной источником электрораспылительной ионизации TurboV и системой ВЭЖХ серии 1290 (Agilent Technologies, Германия). Хроматографическое разделение проводили при 25 °C на колонке Gemini C18, 150*4.6 мм (Phenomenex, США). В экстрактах анализировали содержание 36 микотоксинов: дезоксиниваленол (ДОН), 3-ацетил-дезоксиниваленол (3-АцДОН), 15-ацетил-де-зоксиниваленол (15-АцДОН), дезоксиниваленол-3-глю-козид (ДОН-3-гл), ниваленол (НИВ), фузаренон-Х, зеа-раленон (ЗЕН), а-зеараленол, p-зеараленол, Т-2 токсин, НТ-2 токсин, Т-2 триол, диацетоксцисцирпенол (ДАС),
неосоланиол (НЕО), монилиформин (МОН), фумонизин В1, фумонизин В2, фумонизин В3, боверицин (БОВ), аль-тернариол (АОЛ), альтернариола метиловый эфир (АМЭ), тентоксин (ТЕН), тенуазоновая кислота (ТК), афлатоксин В1, афлотоксин В2, афлатоксин G1, афлатоксин G2, охра-токсин А, охратоксин В, стеригматоцистин (СТЕ), мико-феноловая кислота, цитринин, пенициллиновая кислота, рокфортин С, патулин, циклопиазоновая кислота.
Валидацию методики для изучения восстановления аналитов при анализе зерна пшеницы и количественный анализ содержания микотоксинов проводили согласно общепринятым руководствам (Malachova et al., 2014; ГОСТ 34140-2017). Для количественного определения мико-токсинов в зерне применялись методы калибровки, соответствующие матрице, с использованием стандартных растворов микотоксинов (Romer Labs, Австрия). Предел обнаружения (LOD) для анализируемых микотоксинов устанавливался путем 20 измерений каждой чистой матрицы и расчета среднего значения. Предел количественного определения (LOQ) для анализируемых микотоксинов определялся путем добавления каждого анализируемого микотоксина к чистой матрице. Когда значение S/N (сигнал-шум) 20 параллельных измерений было выше пяти, а воспроизводимость была выше 80 %, устанавливался LOQ для каждой матрицы. Показатели LOD и LOQ для выявленных микотоксинов представлены в таблице 4.
Таблица 4. Восстановление аналита, предел обнаружения (LOD) и предел количественного определения (LOQ) для выявленных микотоксинов в зерне озимой пшеницы
Table 4. Analyte recovery, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) for detected mycotoxins in winter wheat grain
Аналит Восстановление аналита, % LOD, мкг/кг LOQ, мкг/кг Analyte Analyte recovery, % LOD, Mg/kg LOQ, Mg/kg
Дезоксиниваленол 11O 5.00 5.67 Deoxynivalenol 110 5.00 5.67
3-ацетил-дезоксиниваленол 9O 9.56 11.45 3-acetyl-deoxynivalenol 90 9.56 11.45
15-ацетил-дезоксиниваленол S6 26.00 33.80 15-acetyl-deoxynivalenol 86 26.00 33.80
Дезоксиниваленол-3-глюкозид so 5.20 5.67 Deoxynivalenol-3-glucoside 80 5.20 5.67
Ниваленол S5 5.20 5.67 Nivalenol 85 5.20 5.67
Зеараленон 89 0.56 1.08 Zearalenone 89 0.56 1.08
Т-2 токсин 76 2.52 3.50 T-2 toxin 76 2.52 3.50
НТ-2 токсин 80 3.00 3.50 HT-2 toxin 80 3.00 3.50
Т-2 триол 80 4.95 5.30 Т-2 triol 80 4.95 5.30
Неосоланиол 80 4.50 5.67 Neosolaniol 80 4.50 5.67
Монилиформин 92 5.00 5.78 Moniliformin 92 5.00 5.78
Боверицин 90 0.30 0.34 Beauvericin 90 0.30 0.34
Альтернариол 85 0.79 0.98 Alternariol 85 0.79 0.98
Метиловый эфир альтернариола 85 0.69 0.98 Alternariol monomethyl ether 85 0.69 0.98
Тентоксин 86 0.79 0.98 Tentoxin 86 0.79 0.98
Тенуазоновая кислота 79 6.30 11.31 Tenuazonic acid 79 6.30 11.31
Стеригматоцистин 91 0.38 0.57 Sterigmatocystin 91 0.38 0.57
Статистический анализ
В программе Microsoft Excel 2010 рассчитывали средние значения и доверительные интервалы. В программе STATISTICA 10.0 оценивали связи между количественными
признаками с использованием линейного коэффициента корреляции Пирсона (г), а также оценивали влияние конкретного фактора на анализированные показатели с помощью однофакторного дисперсионного анализа.
Результаты
Количество ДНК грибов Fusarium и Alternaría в зерне Методом кПЦР выявлено присутствие ДНК Tri-Fusarium в зерне 100 % анализированных образцов в количестве (28008±7228)*10"4 пг/нг в среднем. В образцах зерна из Динского, Калининского и Тбилисского районов
выявлены наиболее высокие значения количества ДНК этой группы грибов, тогда как в зерне образцов из Бело-глинского района количество ДНК Тп^шагшт было в среднем в 2.0-8.5 раз достоверно ниже, чем в образцах из других районов (табл. 5).
Таблица 5. Содержание ДНК грибов Fusarium и Alternaría в зерне озимой пшеницы
Район (число образцов) Кол Tri-Fusarium ячество ДНК грибов*1 Fum-Fusarium 0-4 в среднем* (мин - макс), п Alternaria секц. Alternaria г/нг Alternaria секц. Infectoriae
Белоглинский (15) Динской (1) Калининский (4) Каневской (2) Кореновский (3) Красноармейский (1) Тбилисский (7) Успенский (1) 10566±2172(2439-30287) 90152 34205±20325 (3368-95431) 13725; 31229 21389±7981 (11774-37583) 23299 55856±30179 (6163-235372) 43407 1436±493 (0-5538) 0 2308±2262 (0-9232) 0; 0 354±347 (0-1063) 0 39±39 (0-275) 273 11851±1062 (6368-19608) 13384 16468± 6897 (5723-36296) 26204;27560 18091± 8267 (5487-34106) 32398 16879± 2856 (9091-31356) 10806 33071±3311 (18190-68137) 13763 18953±4221 (9661-30515) 32507; 48208 13991±2797 (8291-17125) 39541 30097±3383 (21185-46328) 18498
*в таблице приведены средние значения с доверительным интервалом при уровне значимости 95 %.
Table 5. The content of Fusarium and Alternaria DNA in the grain samples of winter wheat
District (number of samples) Am Tri-Fusarium íount of fungal DNA*' Fum-Fusarium 0-4 on average* (min - max), Alternaria sect. Alternaria pg/ng Alternaria sect. Infectoriae
Beloglinskiy (15) Dinskoy (1) Kalininskiy (4) Kanevskoy (2) Korenovskiy (3) Krasnoarmeyskiy (1) Tbilisskiy (7) Uspenskiy (1) 10566±2172 (2439-30287) 90152 34205±20325 (3368-95431) 13725; 31229 21389±7981 (11774-37583) 23299 55856±30179 (6163-235372) 43407 1436±493(0-5538) 0 2308±2262(0-9232) 0; 0 354±347 (0-1063) 0 39±39 (0-275) 273 11851±1062 (6368-19608) 13384 16468± 6897 (5723-36296) 26204; 27560 18091± 8267 (5487-34106) 32398 16879± 2856 (9091-31356) 10806 33071±3311 (18190-68137) 13763 18953±4221 (9661-30515) 32507; 48208 13991±2797 (8291-17125) 39541 30097±3383 (21185-46328) 18498
Доля образцов, заражённых Риш-Ршапит, была значительно ниже - 35 %, а количество ДНК этих грибов в зерне в среднем составило (2698±778)*10-4 пг/нг, что оказалось в 10 раз меньше, чем ДНК Тп-Р^ап'ит. В образцах зерна из Динского, Каневского и Красноармейского районов ДНК Тиш-Ршагшт не обнаружена.
Также в зерне всех образцов выявлена ДНК грибов АЫетапа: содержание ДНК АЫетапа секц. АЫетапа в среднем составило (36296±1443)*10-4 пг/нг, а ДНК АШтапа секц. Пе^опае - (68137±2137)*10-4 пг/нг. Выявлено достоверное влияние фактора «район отбора образцов» (р=0.0013) на количество ДНК АШтапа секц. Infectoriae: в образцах зерна из Белоглинского, Тбилисского и Успенского районов среднее количество ДНК грибов
из этой секции оказалось в 1.7-2.8 раз выше, чем количество ДНК Alternaria секц. Alternaria.
Группы образцов семенного и товарного назначения в среднем не различались по количеству ДНК грибов Fusarium и Alternaria.
Количество микотоксинов в зерне В зерне всех проанализированных образцов выявлены микотоксины грибов Fusarium и Alternaria, однако их число и количество значительно варьировали (рис. 1, табл. 6). Каждый из образцов был загрязнён не менее чем тремя вторичными метаболитами грибов. Большинство образцов (58 %) содержали в зерне 5-7 микотоксинов, а их максимальное разнообразие (11) выявлено в образце пшеницы с. Юка из Кореновского района.
Рисунок 1. Распределение образцов озимой пшеницы по числу микотоксинов, обнаруженных в зерне Figure. 1. Distribution of grain samples of winter wheat by the number of detected mycotoxins
Таблица 6. Содержание микотоксинов в зерне озимой пшеницы
Table 6. The content of mycotoxins in the grain of winter wheat
Микотоксин Доля загрязнённых образцов, % Выявленное количество (мин - макс), мкг/кг Mycotoxin Quote of contaminated samples, % Revealed amount (min - max), Mg/kg
Дезоксиниваленол 79 % 5.0-2038.6 Deoxynivalenol 79 % 5.0-2038.6
3-ацетил-дезоксиниваленол 3 % 50.9 3-acetyl-deoxynivalenol 3 % 50.9
15-ацетил-дезоксиниваленол 6 % 28.5; 49.5 15-acetyl-deoxynivalenol 6 % 28.5; 49.5
Дезоксиниваленол-3-глюкозид 50 % 20.1-267.5 Deoxynivalenol-3-glucoside 50 % 20.1-267.5
Ниваленол 12 % 7.2-47.8 Nivalenol 12 % 7.2-47.8
Зеараленон 9 % 3.7-4.9 Zearalenone 9 % 3.7-4.9
Т-2 токсин 6 % 5.4; 16.0 T-2 toxin 6 % 5.4; 16.0
НТ-2 токсин 47 % 8.3-288.5 HT-2 toxin 47 % 8.3-288.5
Т-2 триол 3 % 8.5 Т-2 triol 3 % 8.5
Неосоланиол 18 % 3.7-7.3 Neosolaniol 18 % 3.7-7.3
Монилиформин 6 % 9.5; 15.7 Moniliformin 6 % 9.5; 15.7
Боверицин 79 % 0.4-4.1 Beauvericin 79 % 0.4-4.1
Альтернариол 82 % 1.3-55.4 Alternariol 82 % 1.3-55.4
Метиловый эфир альтернариола 29 % 1.1-3.9 Alternariol monomethyl ether 29 % 1.1-3.9
Тентоксин 100 % 1.8-44.8 Tentoxin 100 % 1.8-44.8
Тенуазоновая кислота 74 % 22.8-490.6 Tenuazonic acid 74 % 22.8-490.6
Стеригматоцистин 3 % 9.4 Sterigmatocystin 3 % 9.4
Из проанализированных 36 вторичных метаболитов в зерне обнаружены 17 (табл. 6). Микотоксины 3-АцДОН, 15-АцДОН, ЗЕН, Т-2 токсин, Т-2 триол, МОН и СТЕ встречались единично или редко (в одном-трёх образцах), тогда как частота встречаемости остальных доходила до 100 %.
Анализ микотоксинов, продуцируемых грибами рода Fusarium, выявил, кроме трёх нормируемых, ещё 9 токсичных вторичных метаболитов. Чаще других в зерне встречались ДОН, ДОН-3гл, НТ-2 токсин и БОВ. В двух образцах - с. Ахмат из Динского района и с. Безостая-100 из Тбилисского района обнаружено превышение ПДК ДОН в зерне в 2 и 3 раза. Образцы зерна, полученные из Белоглинского района, можно охарактеризовать как относительно благополучные с точки зрения контаминации зерна ДОН и ДОН-3гл, по сравнению с образцами из других шести районов (табл. 7).
Превышения ПДК ЗЕН и Т-2 токсина не выявлено. Однако в двух образцах зерна с. Маркиз из Белоглинского района и с. Юка из Кореновского района суммарное содержание химически сходных соединений - Т-2 и НТ-2 токсинов составило 112 мкг/кг и 305 мкг/кг, соответственно.
Анализ микотоксинов, продуцируемых грибами рода Alternaria, показал не только их высокую встречаемость в зерне, но и значительные количества этих метаболитов. В 21 % образцов АОЛ выявлен в количествах
10.7-55.4 мкг/кг, а в зерне с. Маркиз из Белоглинского района содержание ТК составило 490 мкг/кг.
В одном из образцов, кроме микотоксинов, продуцируемых Fusarium и Alternaria, обнаружен СТЕ - биосинтетический предшественник афлатоксинов, продуцентами которого являются грибы рода Aspergillus (Rank et al., 2011; Кононенко и др., 2017). Ранее сообщалось о выявлении СТЕ в 3 пробах пшеницы из Северо-Кавказского ФО урожая 2023 г. в количестве от 1 до 53 мкг/кг (Седова и др., 2024).
Выявленные взаимосвязи между анализированными показателями
Результаты корреляционного анализа показали, что существует высокая достоверная положительная связь между количеством ДНК Tri-Fusarium и количеством ДОН, его ацетильных производных и ДОН-3гл в сумме (r=0.81, p<0.0001), а также с количеством ЗЕН (r=0.52, p=0.002). Связи между количеством ДНК этой группы грибов и другими трихотеценовыми микотоксинами не выявлены. Также установлена высокая достоверная связь между количеством ДНК Fum-Fusarium и БОВ (r=0.67, p<0.0001).
Между содержанием ДНК грибов Alternaria и продуцируемыми ими вторичными метаболитами выявлены достоверные положительные связи между количеством ДНК Alternaria секц. Alternaria и двух альтернариотоксинов -АМЭ (r=0.40, p=0.018), а также ТЕН (r=0.62, p<0.0001).
Таблица 7. Загрязнённость основными микотоксинами грибов Fusarium и Alternaria зерна озимой пшеницы
Количество микотоксинов*, мкг/кг
Район (число образцов) Дезоксини-валенол Дезоксинива-ленол-3-глю-козид НТ-2 токсин Боверицин Альтерна-риол Метиловый эфир аль-тернариола Тентоксин Тенуазоно-вая кислота
Белоглинский (15) 33.8±15.0 3.0±2.0 12.8±7.1 0.9±0.2 4.3±1.0 0.3±0.2 7.5±1.7 98.1±34.2
Динской (1) 2038.6 196.7 0 0.4 1.8 0 4.9 99.3
Калининский (4) 136.8±59.1 29.5±11.7 8.9±5.1 1.8±0.9 7.9±3.9 1.2±0.7 7.5±2.0 151.0±78.0
Каневской (2) 0; 62.9 0; 32.2 28.8; 0 0; 1.0 1.9; 55.4 0; 3.9 11.7; 3.5 307.6; 84.9
Кореновский (3) 155.9±104.2 34.0±17.3 124.7±81.0 0.6±0.4 2.4±1.4 1.0±0.9 21.6±11.4 99.0±27.3
Красноармейский (1) 63.0 59.2 0 0.9 3.0 0 21.0 85.7
Тбилисский (7) 402.4±192.4 78.8±32.3 15.8±5.7 0.7±0.2 6.0±2.5 0.4±0.2 15.1±3.7 38.4±19.1
Успенский (1) 459.1 122.5 58.2 0.5 0 0 16.0 0
*в таблице приведены средние значения с доверительным интервалом при уровне значимости 95 %.
Table 7. The contamination of grain samples of winter wheat with main mycotoxins produced by Fusarium and Alternaria fungi
The amount of mycotoxins*, ^g/kg
District (number of samples) Deoxyniva-lenol Deoxyni-valenol-3-glucoside HT-2 toxin Beauvericin Alternariol Alternariol monomethyl ether Tentoxin Tenuazonic acid
Beloglinskiy (15) 33.8±15.0 3.0±2.0 12.8±7.1 0.9±0.2 4.3±1.0 0.3±0.2 7.5±1.7 98.1±34.2
Dinskoy (1) 2038.6 196.7 0 0.4 1.8 0 4.9 99.3
Kalininskiy (4) 136.8±59.1 29.5±11.7 8.9±5.1 1.8±0.9 7.9±3.9 1.2±0.7 7.5±2.0 151.0±78.0
Kanevskoy (2) 0; 62.9 0; 32.2 28.8; 0 0; 1.0 1.9; 55.4 0; 3.9 11.7; 3.5 307.6; 84.9
Korenovskiy (3) 155.9±104.2 34.0±17.3 124.7±81.0 0.6±0.4 2.4±1.4 1.0±0.9 21.6±11.4 99.0±27.3
Krasnoarmeyskiy (1) 63.0 59.2 0 0.9 3.0 0 21.0 85.7
Tbilisskiy (7) 402.4±192.4 78.8±32.3 15.8±5.7 0.7±0.2 6.0±2.5 0.4±0.2 15.1±3.7 38.4±19.1
Uspenskiy (1) 459.1 122.5 58.2 0.5 0 0 16.0 0
Обсуждение
К основным токсинопродуцирующим видам грибов Fusarium, часто встречающимся на зерновых культурах, относятся как агрессивные патогены F. graminearum и F. avenaceum, так и виды, характеризующиеся как слабые патогены, сапрофиты и эндофиты: F. cerealis, F. sporotrichioides, F. poae, F. langsethiae, F. proliferatum, F. oxysporum и др. Поэтому, как ранее было отмечено, из-за участия в инфекционном процессе множества видов грибов Fusarium, характеризующихся различной патогенно-стью и профилем образуемых вторичных метаболитов, установить порог вредоносности фузариоза зерна достаточно сложно (Гагкаева, Гаврилова, 2014).
В нашем исследовании заражённость зерна грибами Fusarium оценивали на основании содержания в зерне ДНК не отдельных видов грибов, а групп с общим признаком - способностью продуцировать трихотеценовые мико-токсины (Tri-Fusarium) или фумонизины (Fum-Fusarium). Преимуществом такого подхода является одновременный учёт вклада в инфицированность зерна разных видов грибов, включающих не только высоко агрессивные патогены, но и те, которые не оказывают заметного вреда растению, но при этом синтезируют опасные микотоксины. Связь между количеством ДНК Tri-Fusarium и риском загрязнения зерна трихотеценовыми микотоксинами, включающими не только ДОН и Т-2 токсин, была показана ранее (Gagkaeva et al. 2019; Лебедин и др., 2021).
В данном исследовании установлена ожидаемо высокая достоверная связь между количеством ДНК Tri-Fusarium и количеством ДОН и его производных (3-АцДОН, 15-АцДОН, ДОН-3гл), что указывает на превалирование F. graminearum в комплексе Tri-Fusarium по сравнению с другими видами. Проведённый ранее мониторинг заражённости грибами зерна, полученного из Южного ФО, выявлял доминирование F. graminearum на всей территории Краснодарского края, однако чаще этот патоген обнаруживали на юго-востоке региона, а также в Каневском районе (Гагкаева, Гаврилова, 2014). Регулярный анализ содержания микотоксинов в зерне пшеницы как продовольственного, так и фуражного назначения, показал, что основная доля образцов из этого региона РФ, как правило, контаминирована ДОН, и его количество в ряде случаев оказалось выше установленной ПДК (Kononenko et al., 2020; Киселева и др., 2021; Седова и др., 2024). В данном исследовании превышение ПДК ДОН выявлено в образцах зерна, полученных из Динского и Тбилисского районов центральной части Краснодарского края, которые в среднем также содержали наибольшие количества ДНК Tri-Fusarium.
Кроме ДОН, в образцах зерна с редкой частотой выявлены два других регламентируемых микотоксина - ЗЕН и Т-2 токсин в количествах 5-16 мкг/кг, что значительно ниже установленных ПДК. Однако, если учитывать присутствие Т-2 токсина вместе с часто встречающимся в зерне НТ-2 токсином, обладающим сходной высокой токсичностью, то в двух образцах зерна суммарное содержание этих микотоксинов превышало ПДК Т-2 токсина в 1.1-3.1 раз.
На основании ранее проведённых нами модельных экспериментов был предложен нижний критический предел (КП) обнаружения ДНК Tri-Fusarium в зерне
- 3955*10-4 пг/нг, превышение которого сигнализирует о необходимости в последующей токсикологической экспертизе образца, поскольку высока вероятность обнаружения трихотеценовых микотоксинов (Лебедин и др., 2021). В нашем исследовании 5 образцов содержали ДНК Tri-Fusarium в количествах, ниже рекомендованного КП, и содержание микотоксинов в них было незначительным. Среди остальных образцов, содержащих ДНК Tri-Fusarium выше КП, доля образцов с превышением ПДК ДОН или суммой Т-2 и НТ-2 токсинов выше 100 мкг/кг составила 14 %.
Несмотря на то, что в 35 % анализированных образцов обнаружена ДНК грибов, способных продуцировать ФУМ, эти микотоксины в зерне не выявлены. Группа Fum-Fusarium включает в себя морфологически-сходные виды комплекса FFSC, из которых на зерне пшеницы в Краснодарском крае ранее были выявлены F. proliferatum, F. subglutinans, F. verticillioides (Гагкаева и др., 2012; Горь-ковенко и др., 2017), F. fujikuroi (Жемчужина и др., 2020). Количество продуцируемых ФУМ может значительно различаться у изолятов F. verticillioides и F. proliferatum (Tancic et al., 2012; Zhou et al., 2018; Qiu et al., 2020) и во многом зависит от условий среды (Cendoya et al., 2017; Peter Mshelia et al., 2020; Deepthi et al., 2022; Dong et al., 2023). В настоящее время в РФ, выявление ФУМ в зерне пшеницы является примером нетипичной контаминации микотоксинами этой зерновой культуры, в отличие от кукурузы, в зерне которой содержание ФУМ часто достигает значений, превышающих установленную ПДК (Седова и др., 2018; Кононенко и др., 2019). Тем не менее число сообщений из разных стран об обнаружении ФУМ при проведении микотоксикологического анализа пшеницы растёт (Cendoya et al., 2018; Gagkaeva et al., 2018; Kononenko et al., 2020; Senatore et al., 2023). Кроме того показано, что между количествами ДНК F. proliferatum и ФУМ в зерне-существует достоверная связь (Senatore et al., 2023).
Кроме ФУМ, грибы комплекса видов F. fujikuroi способны продуцировать ряд других микотоксинов, например, МОН и БОВ (Stçpierï, 2014). Среди проанализированных образцов зерна доля загрязнённых БОВ составила 79 %, тогда как МОН выявлен только в двух. Выявлена достоверная положительная связь между количеством ДНК Fum-Fusarium и количеством БОВ в зерне. В настоящее время БОВ относят к группе остроактуальных микоток-синов, а его функции и токсический эффект находятся на стадии активного изучения (Wu et al., 2018; Hasuda, Bracarense, 2024).
Выявление заражённости образцов зерна грибами Alternaria также проводили на основании содержания в зерне ДНК не отдельных видов грибов, а групп, включающих представителей двух секций - Alternaria и Infectoriae. Эти грибы наиболее обильно представлены в микобио-те семян культурных и диких злаков (Ганнибал 2018; Poursafar et al., 2018; Somma et al., 2019; Sun et al., 2023), тогда как виды других секций - Chalastospora, Panax, Pseudoalternaria и Ulocladioides, - которые могут присутствовать в том же субстрате, встречаются спорадически и менее представлены (Poursafar et al., 2018; Masiello et al., 2022; Gannibal et al., 2022). Ранее показано, что в зерне из Краснодарского края встречаются виды A. tenuissima,
реже A. alternata и A. arborescens, относящиеся к секц. Alternaria, и представители секц. Infectoriae (Гагкаева и др., 2012; Ганнибал, 2018).
В одном из недавних исследований было установлено, что пшеница из Южного ФО контаминирована микоток-синами Alternaria в меньшей степени, чем образцы из других ФО: в образцах зерна из Краснодарского края урожая 2018 г. выявлен только ТЕН (в 13 % образцов), а АОЛ, АМЭ и ТК не обнаружены (Киселёва и др., 2021). Результаты нашего исследования показывают не только повсеместную встречаемость грибов Alternaria секций Alternaria и Infectoriae в зерне озимой пшеницы, выращенной на территории края, но и высокую частоту загрязнения образцов всеми четырьмя анализированными микотоксинами АОЛ, АМЭ, ТЕН и ТК, продуцируемыми этими грибами. Выявленное количество ДНК грибов Alternaria секц. Alternaria было в среднем в 1.9 раз ниже, чем ДНК грибов Alternaria секц. Infectoriae, что контрастирует с ситуацией в Уральском регионе и Западной Сибири, где доминировали представители секц. Alternaria (Орина и др., 2020, 2021).
Выявлена высокая достоверная положительная связь между содержанием ДНК грибов Alternaria секц. Alternaria и двух микотоксинов - АМЭ и ТЕН. Ранее нами уже были продемонстрированы связи между количеством ДНК Alternaria секц. Infectoriae и количеством ТЕН (Орина и др., 2020), а также ДНК Alternaria секц. Alternaria и ТК (Орина и др., 2021). Известно, что представители
разных видов из обеих секций Alternaria способны продуцировать анализированные вторичные метаболиты (Oviedo et al., 2013; Tralamazza et al., 2018; Masiello et al., 2020; Gannibal et al., 2022). Между тем, в ряде исследованиях показано, что в условиях чистой культуры представители секц. Infectoriae в среднем продуцируют в 8-95 раз меньшие АОЛ, чем грибы из секц. Alternaria (Kahl et al., 2015; Gannibal et al., 2022), однако токсинопродуци-рующая способность индивидуальных штаммов может значительно варьировать и существенно зависит от факторов среды (Tralamazza et al., 2018; Masiello et al., 2020; Gannibal et al., 2022).
Несмотря на отсутствие регламентации допустимого содержания микотоксинов грибов Alternaria в сельскохозяйственной продукции на территории РФ, на территории Европейского Союза существует проект рекомендаций, устанавливающий безопасные уровни содержания АОЛ, АМЭ и ТК в пищевых продуктах для детей на основе злаков - не выше 5, 5 и 500 мкг/кг, соответственно (Food Chemistry Institute, 2020). Низкие уровни допустимого содержания АОЛ и АМЭ обусловлены генотоксичностью и тератогенной активностью этих соединений (EFSA, 2016; Chen et al., 2021). По нашим данным, 29 % образцов зерна из Краснодарского края урожая 2023 г. содержали АОЛ в количествах, превышающих рекомендованный уровень в 1.3-11 раз.
Заключение
В зерне пшеницы, выращенной в Краснодарском крае в 2023 г., с помощью высокоточных аналитических методов - кПЦР и ВЭЖХ-МС/МС, выявлено повсеместное присутствие грибов Fusarium и Alternaria и продуцируемых ими микотоксинов.
Установлена достоверная положительная связь между количествами ДНК Tri-Fusarium и ДОН, а также ЗЕН, что указывает на доминирование F. graminearum среди возбудителей фузариоза зерна в этом регионе. В 6 % образцов выявлено превышение ПДК ДОН. В наиболее представительной в исследовании выборке образцов зерна из Бело-глинского района, содержание ДНК Tri-Fusarium и ДОН было ниже, по сравнению с образцами из других семи районов Краснодарского края.
Несмотря на отсутствие ФУМ в зерне, обнаружение ДНК Fum-Fusarium предполагает возможность загрязнения пшеницы микотоксинами, продуцируемыми этими грибами в определённых условиях, и указывает на необходимость регулярного мониторинга.
Выявлено высокое количество ДНК грибов двух секций Alternaria в зерне всех анализированных образцов. Установлены достоверные связи между количеством ДНК видов Alternaria секц. Alternaria и содержанием микотоксинов АМЭ и ТЕН.
Достоверные связи между количеством ДНК грибов и их вторичными метаболитами, позволяют использовать результаты кПЦР для объективной оценки рисков загрязнения зерна микотоксинами.
Благодарности
Авторы благодарят специалиста региональной группы маркетинга по Северному Кавказу и ЮФО фирмы «Август» Клепцову Е.В. за предоставленные для исследований образцы зерна и к.б.н. Гагкаеву Т.Ю. (ВИЗР) за ценные замечания при подготовке рукописи.
Работа выполнена при поддержке РНФ (проект № 19-76-30005).
Библиографический
Аксенов ИВ, Седова ИБ, Чалый ЗА, Тутельян ВА (2023) Альтернариатоксины как фактор риска для здоровья населения. Анализ риска здоровью (4):146-157. http://doi. org/10.21668/health.risk/2023.4.14 Гаврилова ОП, Гагкаева ТЮ (2020) Новые сведения о распространении на территории России гриба Fusarium langsethiae, продуцирующего Т-2 и НТ-2 токсины. Вестник защиты растений 103(3):201-206. https://doi. org/10.31993/2308-6459-2020-103-3-13282
список (References)
Гагкаева ТЮ, Гаврилова ОП (2014) Зараженность зерна грибами Fusarium в Краснодарском и Ставропольском краях. Защита и карантин растений (3):30-33 Гагкаева ТЮ, Гаврилова ОП, Орина АС, Казарцев ИА и др (2017) Сравнение методов выявления в зерне токси-нопродуцирующих грибов рода Fusarium. Микология и фитопатология 51(5):292-298 Гагкаева ТЮ, Ганнибал ФБ, Гаврилова ОП (2012) Зараженность зерна пшеницы грибами Fusarium и Alternaria
на юге России в 2010 году. Защита и карантин растений (1):37-41
Ганнибал ФБ (2018) Изучение факторов, влияющих на развитие альтернариоза зерна у злаков, возделываемых в европейской части России. Сельскохозяйственная биология 53(3):605-615. http://doi.org/10.15389/ agrobiology.2018.3.605rus Горьковенко ВС, Бондаренко ИИ, Соловьева АЮ (2017) Фузариозная инфекция в зернотравянопропашном севообороте в Краснодарском крае. Агротехнический метод защиты растений от вредных организмов. Материалы VIII международной научно-практической конференции, посвящается 95-летию Кубанского государственного аграрного университета. 110-114 ГОСТ 34140-2017. Продукты пищевые, корма, продовольственное сырьё. Метод определения микотоксинов с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием (2017) М.: Стандартинформ Дробин ЮД, Солдатенко НА, Сухих ЕА, Коваленко АВ (2015) Итоги мониторинга контаминации фуражного зерна пшеницы, ячменя и кукурузы на юге России. Проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии 4(16):27-30
Жалиева ЛД (2010) Грибы рода Fusarium в агроценозе озимой пшеницы в условиях Краснодарского края. Иммунопатология, аллергология, инфектология (1):101 Жемчужина НС, Киселева МИ, Александрова АВ, Коло-миец ТМ (2020) Микромицеты на озимой пшенице в Краснодарском крае и Ростовской области. Защита и карантин растений (6):22-26 Каракотов СД, Аршава НВ, Башкатова МБ (2019) Мониторинг и контроль заболеваний пшеницы в Южном Зауралье. Защита и карантин растений (7):18-25 Киселева МГ, Седова ИБ, Чалый ЗА, Захарова ЛП и др. (2021) Анализ продовольственного зерна в Российской Федерации на загрязненность широким спектром микотоксинов (на примере урожая 2018 года). Сельскохозяйственная биология 56(3):559-577. http://doi. org/10.15389/agrobiology.2021.3.559rus Кононенко ГП, Пирязева ЕА, Зотова ЕВ, Буркин АА (2017) Видовой состав и токсикологическая характеристика грибов рода Aspergillus, выделенных из грубых кормов. Сельскохозяйственная биология 52(6):1279-1286. http:// doi.org/10.15389/agrobiology.2017.6.1279rus Кононенко ГП, Буркин АА, Зотова ЕВ, Смирнов АМ (2019) Микотоксикологическое исследование кормового зерна кукурузы (1998-2018 гг.). Российская сельскохозяйственная наука (3):28-31. http://doi.org/10.31857/ S2500-26272019328-31 Лебедин ЮС, Орина АС, Гаврилова ОП, Гагкаева ТЮ и др (2021) Применение аналитических методов для выявления критических пределов инфицирования зерна грибами рода Fusarium. Аграрная наука 344(1):52-60. https:// doi.org/10.32634/0869-8155-2021-344-1-52-60 Мустафина МА, Таракановский АН (2018) Защита от фу-зариоза колоса - определяющий фактор качества зерна. Защита и карантин растений (5):14-16 Орина АС, Гаврилова ОП, Гагкаева ТЮ, Ганнибал ФБ (2020) Микромицеты Alternaria spp. и Bipolaris sorokiniana и микотоксины в зерне, выращенном в
Уральском федеральном округе. Микология и фитопатология 54(5):365-377. http://doi.org/10.31857/ S0026364820050086 Орина АС, Гаврилова ОП. Гагкаева ТЮ, Гогина НН (2021) Контаминация зерна из Западной Сибири грибами Alternaria и их микотоксинами. Вестник защиты растений 104(3):153-162. https://doi. org/10.31993/2308-6459-2021-104-3-15019 Седова ИБ, Захарова ЛП, Киселева МГ, Чалый ЗА и др. (2021) Дезоксиниваленол как фактор риска загрязнения продовольственного зерна: мониторинг урожаев 19892018 гг. в Российской Федерации. Анализ риска здоровью (3):85-98. http://doi.org/10.21668/health.risk/202L3.08 Седова ИБ, Захарова ЛП, Киселева МГ. Чалый ЗА и др. (2018) Фузариотоксины и афлатоксин В1 в продовольственном зерне кукурузы в Российской Федерации. Научные труды Северо-Кавказского федерального научного центра садоводства, виноградарства, виноделия 21:129-137
Седова ИБ, Чалый ЗА, Спиридонова АЛ, Иванова УВ и др. (2024) Микотоксины в продовольственном зерне отечественного производства урожая 2023 г. Анализ риска здоровью - 2024. Материалы XIV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. В 2-х томах. Пермь. 359-363 Технический регламент Таможенного союза 015/2011 «О безопасности зерна» с изменениями на 15 сентября 2017 г. Приложение № 2 Технический регламент Таможенного союза 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» с изменениями от 8 августа 2019 г. Приложение № 3 Федеральная служба государственной статистики. 2024 (электронные версии). https://rosstat.gov.ru/compendium/ document/13277 (04.09.2024) Шипилова НП, Гаврилова ОП, Гагкаева ТЮ (2014) Влияние зараженности грибами Fusarium рода на качественные характеристики зерна озимой пшеницы. Вестник защиты растений (4):27-31 Cendoya E, Pinson-Gadais L, Farnochi MC, Ramirez ML et al (2017) Abiotic conditions leading to FUM gene expression and fumonisin accumulation by Fusarium proliferatum strains grown on a wheat-based substrate. Int J Food Microbiol 253:12-19. http://doi.org/10.1016/j. ijfoodmicro.2017.04.017 Cendoya E, Chiotta ML, Zachetti V, Chulze SN et al (2018) Fumonisins and fumonisin-producing Fusarium occurrence in wheat and wheat by-products. A review. J Cereal Sci 80:158-166. https://doi.org/10.1016/jjcs.2018.02.010 Chen A, Mao X, Sun Q, Wei Z et al (2021) Alternaria mycotoxins: an overview of toxicity, metabolism, and analysis in food. J Agric Food Chem 69(28):7817-7830. http://doi.org/10.1021/acs.jafc.1c03007 Deepthi BV, Deepa N, Vanitha PR, Sreenivasa MY (2022) Stress responses on the growth and mycotoxin biosynthesis of Fusarium proliferatum associated with stored poultry feeds. AFS 2:100091. http://doi.org/10.1016/j.afres.2022.100091 Dong T, Qiao S, Xu J, Shi J et al (2023) Effect of abiotic conditions on growth, mycotoxin production, and gene expression by Fusarium fujikuroi species complex strains from maize. Toxins 15(4):260. http://doi.org/10.3390/ toxins15040260
EFSA (2016) Dietary exposure assessment to Alternaria toxins
in the European population. EFSA J 14: e04654 Food Chemistry Institute of the Association of the German Confectionery Industry (2020) Alternaria toxins: occurrence, toxicity, analytical methods, maximum levels. Sweet Vision 67(1):6-7
Gagkaeva T, Gavrilova O, Orina A, Lebedin Y et al (2019) Analysis of toxigenic Fusarium species associated with wheat grain from three regions of Russia: Volga, Ural, and West Siberia. Toxins 11(5):252. https://doi.org/10.3390/ toxins11050252 Gagkaeva TYu, Orina AS, Gavrilova OP, Ablova IB et al (2018) Characterization of resistance of winter wheat varieties to Fusarium head blight. Vavilov Journal of Genetics and Breeding 22(6):685-692. http://doi.org/10.18699/VJ18.411 Gannibal PB, Orina AS, Kononenko GP, Burkin AA (2022) Distinction of Alternaria sect. Pseudoalternaria strains among other Alternaria fungi from cereals. J Fungi 8(5):423. http://doi.org/10.3390/jof8050423 Gannibal PhB, Yli-Mattila T (2007) Morphological and UP-PCR analyses and design of a PCR assay for differentiation of Alternaria infectoria species-group. Mikol Fitopatol 41:313-322
Halstensen AS, Nordby KC, Eduard W., Klemsdal SS (2006) Real time PCR detection of toxigenic Fusarium in airborne and settled grain dust and associations with trichothecene mycotoxins. J Environ Monit 8:1235-1241. http://doi. org/10.1039/b609840a. Hasuda AL., Bracarense APFRL (2024) Toxicity of the emerging mycotoxins beauvericin and enniatins. A minireview. Toxicon 239:107534. http://doi.org/10.1016/j. toxicon.2023.107534 Kahl SM, Ulrich A., Kirichenko AA, Müller ME (2015) Phenotypic and phylogenetic segregation of Alternaria infectoria from small-spored Alternaria species isolated from wheat in Germany and Russia. J Appl Microbiol 119:1637-1650
Konstantinova P, Bonants PJM, van Gent-Pelzer MPE, van der Zouwen P et al (2002) Development of specific primers for detection and identification of Alternaria spp. in carrot material by PCR and comparison with blotter and plating assays. Mycol Res 106:23-33. https://doi.org/10.1017/ S0953756201005160 Kononenko GP, Burkin AA, Zotova YeV (2020) Mycotoxilogical monitoring. Part 2. Wheat, barley, oat and maize grain. Veterinary Science Today 2:139-145. https:// doi.org/10.29326/2304-196X-2020-2-33-139-145 Kosiak B, Torp M, Skjerve E, Andersen B (2004) Alternaria and Fusarium in Norwegian grains of reduced quality — a matched pair sample study. Int J Food Microbiol 93(1):51-62. https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2003.10.006 Masiello M, El Ghorayeb R, Somma S, Saab C et al (2022) Alternaria species and related mycotoxin detection in Lebanese durum wheat grain. Phytopathol Mediter 61(2):383-393. https://doi.org/10.36253/phyto-13396 Masiello M, Somma S, Susca A, Ghionna V et al (2020) molecular identification and mycotoxin production by Alternaria species occurring on durum wheat, showing black point symptoms. Toxins 12:275. https://doi.org/10.3390/ toxins12040275
Orina AS, Gavrilova OP, Gagkaeva TYu (2018) Adaptation of the quantitative PCR method for the detection of the main representatives of cereal grain mycobiota. MIR J 5(1):78-83. https://doi.org/10.18527/2500-2236-2018-5-1-78-83 Orina AS, Gavrilova OP, Gogina NN, Gannibal PB et al (2021) Natural occurrence of Alternaria fungi and associated mycotoxins in small-grain cereals from the Urals and West Siberia regions of Russia. Toxins 13(10):681. https://doi. org/10.3390/toxins13100681 Oviedo MS, Sturm ME, Reynoso MM, Chulze SN et al (2013) Toxigenic profile and AFLP variability of Alternaria alternata and Alternaria infectoria occurring on wheat. Brazilian J Microbiol 44: 447-455 Mshelia P, Selamat J, Iskandar Putra Samsudin N, Rafii MY et al (2020) Effect of temperature, water activity and carbon dioxide on fungal growth and mycotoxin production of acclimatised isolates of Fusarium verticillioides and F. graminearum. Toxins 12(8):478. https://doi.org/10.3390/ toxins12080478 Poursafar A, Ghosta Y, Orina AS, Gannibal PB et al (2018) Taxonomic study on Alternaria sections Infectoriae and Pseudoalternaria associated with black (sooty) head mold of wheat and barley in Iran. Mycol Prog 17:343-356 Preiser V, Goetsch D, Sulyok M, Krska R et al (2015) The development of a multiplex real-time PCR to quantify Fusarium DNA of trichothecene and fumonisin-producing strains in maize. Anal Methods 7:1358-1365 Qiu J, Lu Y, He D, Lee YW et al (2020) Fusarium fujikuroi species complex associated with rice, maize, and soybean from Jiangsu Province, China: phylogenetic, pathogenic, and toxigenic analysis. Plant Dis 104(8):2193-2201. https:// doi.org/10.1094/PDIS-09-19-1909-RE Rank C, Nielsen KF, Larsen TO, Varga J et al (2011) Distribution of sterigmatocystin in filamentous fungi. Fungal Biol 115(4-5):406-420. https://doi.org/10.1016Zj. funbio.2011.02.013 Senatore MT, Prodi A, Tini F, Balmas V et al (2023) Different diagnostic approaches for the characterization of the fungal community and Fusarium species complex composition of Italian durum wheat grain and correlation with secondary metabolite accumulation. J Sci Food Agric 103(9): 45034521 https://doi.org/10.1002/jsfa.12526 Sharon O, Kagan-Trushina N, Sharon A (2023) Wheat fungal endophyte communities are inseparable from the host and influence plant development. mBio 15:e02533-23. https:// doi.org/10.1128/mbio.02533-23 Somma S, Amatulli MT, Masiello M, Moretti A, Logrieco AF (2019) Alternaria species associated with wheat black point identified through a multilocus sequence approach. Int J Food Microbiol 293:34-43. https://doi.org/10.1016/j. ijfoodmicro.2018.11.008 St^pien L (2014) The use of Fusarium secondary metabolite biosynthetic genes in chemotypic and phylogenetic studies. Crit Rev Microbiol 40(2):176-185. https://doi.org/10.3109/ 1040841X.2013.770387 Sun X, Sharon O, Sharon A (2023) Distinct features based on partitioning of the endophytic fungi of cereals and other grasses. Microbiol Spectr 11:e0061123. https://doi. org/10.1128/spectrum.0061123 Tancic S, Stankovic S, Levic J, Krnjaja V, Vukojevic J (2012) Diversity of the Fusarium verticillioides and F. proliferatum
isolates according to their fumonisin B1 production potential and origin. Genetika 44(1):163-176. https://doi. org/10.2298/GENSR1201163T Tralamazza SM, Piacentini KC, Iwase CHT, de Oliveira Rocha L (2018) Toxigenic Alternaria species: impact in cereals worldwide. Cur Opin Food Sci 23:57. https://doi. org/10.1016/j.cofs.2018.05.002
Wu Q, Patocka J, Nepovimova E, Kuca K (2018) A review on the synthesis and bioactivity aspects of beauvericin, a Fusarium mycotoxin. Front Pharmacol 9:1338. https://doi. org/10.3389/fphar.2018.01338 Zhou D, Wang X, Chen G, Sun S et al (2018) The major Fusarium species causing maize ear and kernel rot and their toxigenicity in Chongqing, China. Toxins 10(2):90. https:// doi.org/10.3390/toxins10020090
Translation of Russian References
Aksenov IV, Sedova IB, Chalyy ZA, Tutelyan VA (2023) [Alternaria toxins as a risk factor for public health] Analiz riska zdorovyu (4):146-157 (in Russian) http://doi. org/10.21668/health.risk/2023.4.14 Gavrilova OP, Gagkaeva TYu (2020) [New information on the distribution of the fungus Fusarium langsethiae in Russia, which produces T-2 and HT-2 toxins] Vestnik zashchity rasteniy 103(3):201-206 (in Russian) https://doi. org/10.31993/2308-6459-2020-103-3-13282 Gagkaeva TYu, Gavrilova OP (2014) [The contamination of grain by Fusarium fungi in the Krasnodar and Stavropol regions] Zashchita i karantin rasteniy (3):30-33 (in Russian) Gagkayeva TYu, Gavrilova OP, Orina AS, Kazartsev IA (2017) [Comparison of methods for identification of toxin-producing Fusarium fungi in the cereal grain] Mikologiya i Fitopatologiya 51(5):292-298 (in Russian) Gagkaeva TYu, Gannibal FB, Gavrilova OP (2012) [The contamination of wheat grain with Fusarium and Alternaria fungi in southern Russia in 2010] Zashchita i karantin rasteniy (1):37-41 (in Russian) Gannibal FB (2018) [Study of the factors influencing the development of Alternaria disease in grains cultivated in the European part of Russia.] Sel 'skohozyajstvennaya biologiya 53(3):605-615 (in Russian) http://doi.org/10.15389/ agrobiology.2018.3.605rus Gorkovenko VS, Bondarenko II, Soloveva AYu (2017) [Fusarium infection in grain forage crop rotation in the Krasnodar region] [The agrotechnical method of protecting plants from harmful organisms. Materials from the VIII International Scientific and Practical Conference dedicated to the 95th anniversary of the Kuban State Agrarian University] 110-114 (in Russian) GOST 34140-2017. Food products, animal feed, food raw materials. Method for determining mycotoxins using highperformance liquid chromatography with mass spectrometric detection (2017) M.: Standartinform (in Russian) Drobin YuD, Soldatenko NA, Suhih EA, Kovalenko AV (2015) [The results of the monitoring of contamination in feed grains such as wheat, barley, and corn in southern Russia] Problemy veterinarnoy sanitarii, gigieny i ekologii 4(16):27-30 (in Russian) Zhalieva LD (2010) [The fungi of the genus Fusarium in the agrocenosis of winter wheat in the Krasnodar region] Immunopatologiya, allergologiya, infektologiya (1):101 (in Russian)
Zhemchuzhina NS, Kiseleva MI, Aleksandrova AV, Kolomiets TM (2020) [Micromycetes on winter wheat in the Krasnodar region and Rostov region] Zashchita i karantin rasteniy (6):22-26 (in Russian)
Karakotov SD, Arshava NV, Bashkatova MB (2019) [Monitoring and Control of Wheat Diseases in South Ural] Zashchita i karantin rasteniy (7):18-25 (in Russian) Kiseleva MG, Sedova IB, Chalyy ZA, Zaharova LP (2021) [Analysis of food grain in the Russian Federation for contamination with a broad spectrum of mycotoxins (based on the 2018 harvest).] Sel Skohozyajstvennaya biologiya 56(3):559-577 (in Russian) http://doi.org/10.15389/ agrobiology.2021.3.559rus Kononenko GP, Piryazeva EA, Zotova EV, Burkin AA (2017) [The species composition and toxicological characteristics of Aspergillus fungi isolated from rough animal feeds] Sel Skohozyajstvennaya biologiya 52(6):1279-1286 (in Russian) http://doi.org/10.15389/ agrobiology.2017.6.1279rus Lebedin YuS, Orina AS, Gavrilova OP, Gagkaeva TYu (2021) [The application of analytical methods to identify critical thresholds for grain infection by Fusarium fungi] Agrarnaya nauka 344(1):52-60 (in Russian) https://doi. org/10.32634/0869-8155-2021-344-1-52-60 Mustafina MA, Tarakanovskiy AN (2018) [The protection against ear fusariosis is a determining factor in grain quality] Zashchita i karantin rasteniy (5):14-16 (in Russian) Orina AS, Gavrilova OP, Gagkayeva TYu, Gannibal PhB
(2020) [Micromycetes Alternaria spp. and Bipolaris sorokiniana and mycotoxins in the grain from the Ural region] Mikologiya i Fitopatologiya 54(5):365-377 (in Russian) http://doi.org/10.31857/S0026364820050086
Orina AS, Gavrilova OP. Gagkaeva TYu, Gogina NN
(2021) [Contamination of grain from Western Siberia by Alternaria fungi and their mycotoxins] Vestnik zashchity rasteniy 104(3):153-162 (in Russian) https://doi. org/10.31993/2308-6459-2021-104-3-15019
Sedova IB, Zaharova LP, Kiseleva MG, Chalyy ZA (2021) [Deoxynivalenol as a risk factor for contamination of food grains: monitoring harvests from 1989 to 2018 in the Russian Federation] Analiz riska zdorovyyu (3):85-98 (in Russian) http://doi.org/10.21668/health.risk/202L3.08 Sedova IB, Zaharova LP, Kiseleva MG. Chalyy ZA (2018) [Fusariotoxins and aflatoxin B1 in food corn grain in the Russian Federation] [Scientific works of the North Caucasian Federal Scientific Center for Horticulture, Viticulture, and Winemaking] 21:129-137 (in Russian) Sedova IB, Chalyy ZA, Spiridonova AL, Ivanova UV (2024) [Mycotoxins in domestically produced food grain of the 2023 harvest] [Health risk assessment - 2024. Proceedings of the XIV All-Russian Scientific and Practical Conference with International Participation] 359-363 (in Russian) The Technical Regulation of the Customs Union CU 015/2011 "On Grain Safety," with amendments as of September 15, 2017, is included in Appendix № 2 (in Russian)
The Technical Regulation of the Customs Union CU 021/2011 "On Food Safety," with amendments dated August 8, 2019, is included in Appendix № 3 (in Russian) Federal State Statistics Service. 2024 (electronic versions). https://rosstat.gov.ru/compendium/document/13277 (04.09.2024)
Shipilova NP, Gavrilova OP, Gagkaeva TYu (2014) [The influence of Fusarium species infection on the quality characteristics of winter wheat grain] Vestnik zashchity rasteniy (4):27-31 (in Russian)
Plant Protection News, 2024, 107(3), p. 108-120
OECD+WoS: 1.06+RQ (Mycology) https://doi.org/10.31993/2308-6459-2024-107-3-16677
Full-text article
ANALYSIS OF FUNGAL AND MYCOTOXIN CONTAMINATION OF WINTER WHEAT GRAIN GROWN IN KRASNODARSKIY KRAI IN 2023 E.P. Arabina12, A.S. Orina1*, O.P. Gavrilova1, N.N. Gogina3
1All-Russian Institute of Plant Protection, St. Petersburg, Russia 2Information Technologies, Mechanics and Optics University, St. Petersburg, Russia 3All-Russian Scientific Research and Technological Institute of Poultry, Sergiev Posad, Russia
*corresponding author, e-mail: [email protected]
Using quantitative PCR (qPCR) and high-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) ubiquitous presence of Fusarium and Alternaria fungi and their mycotoxins was detected in winter wheat grain grown in Krasnodarskiy Krai in 2023. All samples contained DNA of Fusarium producing trichothecene mycotoxins (Tri-Fusarium) in the range of 244-23537 pg/^g. DNA of Fusarium producing fumonisins was detected in 35 % of grain samples at 27-923 pg/^g. All samples contained Alternaria sect. Alternaria and sect. Infectoriae DNA at average levels of 3630±144 and 6814±214 pg/^g, respectively. Of the 36 analyzed mycotoxins, 17 metabolites were found in the grain samples: from 3 to 11 mycotoxins in each sample. Among Fusarium mycotoxins, most common were deoxynivalenol (DON) (in 79 % of samples), deoxynivalenol-3-glucoside (50 %), HT-2 toxin (47 %), and beauvericin (70 %). In two samples (6 % of the total), the maximum permissible DON concentration was exceeded by 2-3 times. A significant positive correlation between Tri-Fusarium DNA and DON content, as well as zearalenone, was found, indicating F. graminearum prevalence among the pathogens causing Fusarium head blight in this region. A high occurrence of mycotoxins produced by Alternaria fungi alternariol (82 % of contaminated samples), tentoxin (TEN) (100 %), and tenuazonic acid (79 %) in the grain was revealed. A significant correlation between the content of Alternaria sect. Alternaria DNA and two mycotoxins alternariol monomethyl ether and TEN was found. Significant distinctions were found between different Krasnodarskiy Krai locations in grain contamination levels with Fusarium, Alternaria fungi and mycotoxins.
Keywords: fungi, DNA, Alternaria, Fusarium, quantitative PCR, mycotoxins, HPLC-MS/MS
Submitted: 05.09.2024 Accepted: 18.10.2024
© Arabina E.P., Orina A.S., Gavrilova O.P., Gogina N.N., published by All-Russian Institute of Plant Protection
(St. Petersburg). This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License 4.0
(http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).
