МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ГМО Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

BIOLOGICAL SCIENCES

МЕТОДЫ СОЗДАНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ГМО

Латыпова Э.А.

Доцент кафедры «Биология, биологические технологии и ветеринарно-санитарная экспертиза» Пензенского государственного аграрного университета

Камбурова В. С.

Заведующая лабораторией Центра геномики и биоинформатики Академии наук Республики Узбекистан Кандидат биологических наук

METHODS FOR THE CREATION AND IDENTIFICATION OF GMOs

Latypova E.,

Associate Professor of the Department of Biology, Biological Technologies and veterinary and sanitary examination Penza State Agrarian University Kamburova V.

Center of genomics and bioinformatics of the Academy of Sciences of Uzbekistan Head oh Laboratory, PhD in biology

Аннотация

Современное развитие человечества не мыслимо без новейших генно-инженерных технологий, связанных, в том числе, с производством ГМО. В статье проведен обзор основных методов создания и обнаружения ГМО. Рассмотрены эффективность, особенности, недостатки и ограничения каждого представленного метода.

Abstract

The modern development of mankind is inconceivable without the latest genetic engineering technologies associated, among other things, with the production of GMOs. The article provides an overview of the main methods for the creation and detection of GMOs. The efficiency, features, disadvantages and limitations of each presented method are considered.

Ключевые слова: генная инженерия, ГМО, методы создания ГМО, идентификация ГМО, трангеноз, РНК интерференция, редактирование геномов.

Keywords: genetic engineering, GMOs, methods for creating GMOs, identification of GMOs, transgenosis, RNA interference, genome editing.

Рост человеческой популяции, глобальное изменение климата, а также появление и широкое и распространение более агрессивных и устойчивых к химикатам патогенов и вредителей сельскохозяйственных культур ставит перед учеными задачу создания в короткие сроки новых высокоурожайных и устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам сортов сельхозкультур [1]. При этом решение данной задачи невозможно без применения генно-инженерных технологий [2].

Также следует отметить, что несмотря на огромные потенциальные выгоды современной биотехнологии, законодательство многих стран ограничивает содержание ГМО в пищевых продуктах. При этом в отношении ГМО и производных пищевых продуктов и кормов международное законодательство в области генной инженерии требует специальных методов обнаружения, идентификации и количественной оценки, прежде чем они могут быть разрешены и размещены на рынке [3, 4]. В

связи с этим, для гарантированной прослеживаемо-сти ГМО было разработано несколько стратегий идентификации ГМО, классифицированных как непрямые (на основе белков) или прямые (на основе ДНК) для обнаружения ГМО в образцах пищевых продуктов/кормов с использованием различных технологий [2, 4].

В данном обзоре мы рассматриваем основные методы генетической модификации и идентификации ГМО, а также преимущества, особенности использования и возможные ограничения для каждого представленного метода.

Методы создания ГМО. В настоящее время выделяют 3 основных типа ГМО: трансгенные, цис-генные и интрагенные организмы, различающиеся методами создания: классический трангеноз, РНК интерференция и методы редактирования геномов. Рассмотрим подробнее каждый из методов.

Классические методы трансгеноза. Несмотря

на различия в классификации и методы создания генетических конструкций, методы интродукции конструкций в геном являются достаточно универсальными. При этом методы инсерции конструкций разделяют на физико-химические и биологические [2].

К физико-химическим методам относят бомбардировку частицами, электротрансфекцию, трас-нформацию с использованием нитей карбида кремния, полифекцию с использованием полимеров, трансформацию на основе липосом, микроинъекции, волновую и лучевую трансформацию, а также резорбционную трансформацию [2]. Несмотря на простоту, системы прямой трансформации имеют следующие недостатки: потребность в специализированных инструментах и расходных материалах во многих случаях, фрагментация и перегруппировка введенных последовательностей, высокая интеграция с копиями, а также совместная интеграция кассеты целевых генов с векторной последовательностью плазмиды [2].

К биологическим методам трансофрмации относят агробактериальную трансформацию с использованием Agrobacterium tumefaciens, вирусную трансформацию и трансформацию с использованием трансопозонов [2]. При биологической трансформации часто наблюдаются отрицательные процессы для клетки-реципиента, в частности, инфекции и мутагенез. Кроме того, к недостаткам также можно отнести необходимость индивидуальной оптимизации методики для каждого вида растений или растительного материла [2].

Кроме того, одним из методов трансформации является in planta трансформация, при которой конструкции вводят в интактные растения или семена с помощью физических или биологических методов и восстанавливают до целых растений по протоколам не-тканевой культуры [2, 5]. Методология включает в себя три основных протокола: метод пыльцевой трубки, метод с использованием пыльцы и трансформация меристемы [2, 5]. Основным недостатком этих методов является генерация химер и необходимость экранировать большое количество первичных трансформантов [2, 5].

РНК интерференция (RNAi). RNAi индуцируется введением специфических экзогенных dsRNA либо геномных вирусных РНК, введением синтетических dsRNA или при индукции в растениях опосредуется Agrobacterium. На первом этапе белок Dicer, относящийся к семейству РНКазы III, производит нарезание dsPHK на 21-25-членные нуклео-тидные фрагменты siPHK. На втором этапе образуются комплексы RISC (RNA-induced silencing complex), состоящие, в основном, из белков семейства Argonaute и siРНК. При этом белки семейства Argonaute разрушают одну из цепей дуплексной siРНК, так что в составе RISC остается только антисмысловая цепь siРНК. Комплексы RISC направляются к мРНК-мишени благодаря комплементарному взаимодействию между siРНК и мРНК-ми-шени. В этом комплексе Argonaute выполняет функцию эндонуклеазы (slicer), расщепляя мРНК-

мишень по механизму РНКазы H [6]. Таким образом, РНК-интерференция представляет собой процесс деградации мРНК в присутствии гомологичных молекул dsPHK. У растений наиболее эффективным путем подавления экспрессии генов служит введение в клетки шпилькообразующих (hairpin) структур, приводящих к образованию dsPHK [6].

Механизмы редактирования геномов. В настоящее время существует три основных метода редактирования генома, классифицируемых по механизму действия: генерация двухцепочечных разрывов ДНК (DSB) с использованием последовательность-специфичных нуклеаз (SSN), ODM и BE [7]. Самым ранним методом редактирования геномов является ODM, однако наиболее часто используемым в растениях является целевая генерация DSB с использованием SSN [7]. Затем эти разрывы репарируются собственными эндогенными механизмами репарации клетки либо за счет негомологичного соединения концов (NHEJ), либо за счет гомологичной рекомбинации (HDR) [7, 8]. При этом репарация последовательности ДНК-мишени приводит к возникновению точечных мутаций, изменяя рамки считывания и вызывая появление инделов и замены нуклеотидов, также хромосомные перестройки [8].

Направленная индукция DSB возможна при использовании программируемых сайт-направленных нуклеаз (SDN). Наиболее распространенными нуклеазами для редактирования генома являются нуклеазы цинковых пальцев (ZFN), эффекторные нуклеазы, подобные активатору транскрипции (TALEN), и Cas9, который является частью кластерной системы коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами (CRISPR) / Cas9. Эти три класса нуклеаз различаются по структуре, активности и механизму, что приводит к различиям в выборе мишени, эффективности, специфичности и характеру мутации [7, 8].

При этом ZFN представляют собой особый тип эндонуклеаз, образованный путем слияния ДНК-связывающего домена, содержащего несколько связанных мотивов «цинковых пальцев» (ZF), с неспецифической эндонуклеазой FokI [7, 8]. В свою очередь, TALEN также относится к эндонуклеазам, состоящим из специфических ДНК-связывающих доменов высококонсервативных повторов, происходящих от эффекторов, подобных активаторам транскрипции (TALEs), объединенных с рестрик-ционной эндонуклеазой FokI [7, 8].

Технология CRISPR/Cas основывается на применении обнаруженных у бактерий механизмов адаптивного «иммунитета» - специфической противовирусной защиты бактериальных клеток, в основе которого лежит комплементарное связывание молекул ДНК вирусов и их разрушение [7]. В этой системе малые направляющие РНК (crRNA) используются для последовательность-специфичной интерференции чужеродных нуклеиновых кислот. CRISPR-Cas включает в себя геномный локус, называемый CRISPR и содержащий короткие повторяющиеся элементы (повторы), разделенные

уникальными последовательностями (спейсерами) [8]. При этом массиву CRISPR предшествует ли-дерная последовательность, обогащенная AT, а фланкирование осуществляется набором генов Cas [8].

ODM представляет собой инструмент для направленного сайт-ориентированного мутагенеза, в котором используются мутагенные ДНК-олигонуклеотиды длиной 20-200 нуклеотидов [9]. При этом последовательность такого олигонуклео-тида совпадает с целевой последовательностью в геноме, за исключением единственной пары оснований, которая является предполагаемой мутацией, вводимой в геном [9]. Технологии ВЕ используют Cas9 никазу (nCas9) или функционально неактивную Cas9 (dCas9), объединенным с доменом цито-зин- или аденозиндезаминазы, который преобразует одно основание в другое [7, 10].

Методы обнаружения ГМО. Законодательное регулирование многих стран предусматривает идентификацию ГМО в пищевых продуктах, пищевом сырье и кормах. В связи с этим надежные методы скрининга важны как для обнаружения несанкционированных ГМ-культур, так и для контроля над маркировкой (Morisset et al., 2009). Необходимость контроля за соблюдением пороговых значений создала потребность в разработке надежных методов ГМ-анализа. Верификация ГМО требует тестирования ГМ продуктов на присутствие чужеродной ДНК или белка. В настоящее время для обнаружения ГМО в образцах продуктов питания или кормах разработаны и используются несколько стратегий, которые можно классифицировать как прямые (основанные на ДНК) и косвенные (основанные на белках) подходы, связанные с использованием различных технологий.

К косвенным подходам, при использовании которых проводится определение кодируемых трансгенами белков, относятся несколько методов, основанных на иммуноферментном анализе (ELISA). Кроме того, также применяется переносная система иммуноанализа. В качестве альтернативы идентификации ГМО используют и иммуно-ПЦР-метод [11, 12]. Методы, основанные на определении белка, включают использование технологии масс-спектрометрии в качестве инструмента, позволяющего характеризовать ГМ-культуры [4]. Однако несмотря на то, что эти методы обладают рядом преимуществ, они зависят от уровня экспрессии целевых белков, которые варьируются в зависимости от растительных тканей и периода развития растений. Кроме того, белки могут сильно деградировать или денатурироваться в процессе пищевой обработки. Любая модификация целевых белков может изменить специфичность и чувствительность анализа. Также, этот анализ неприменим, если генетическая модификация не влияет на уровень белка [3, 4].

Для решения этих проблем были разработаны множество прямых методов, основанных на определении генетических последовательностей, интро-дуцированных в геном организма рецепиента. К ним относят ПЦР анализ (применяемый для каче-

ственного определения ГМО) и ПЦР анализ в реальном времени - qPCR (используемый для количественного определения ГМО). Эти методы (а особенно qPCR) являются наиболее часто используемыми методиками для обнаружения и количественного анализа ГМО и их продуктов [4, 11, 12].

Однако, несмотря на гибкость, простоту, быстроту и высокую аналитическую чувствительность, особенно важную для обнаружения низкого количества целевых ГМО, успех стратегии qPCR зависит от некоторых факторов. Например, пропускная способность qPCR обычно ограничивается одним маркером для каждой реакции. Из-за увеличения количества ГМО с целью точного обнаружения модификации постоянно разрабатываются и используются дополнительные маркеры, что делает проведение анализа и интерпретацию результатов довольно сложными и трудоемкими [12]. Кроме того, этот подход нацелен только на известные последовательности. Поэтому отрицательные сигналы гарантируют только отсутствие известного ГМО в тестируемых образцах пищи / корма. Что касается этапа количественной оценки, его достижение зависит от наличия сертифицированных референс-стандартов [4, 12]. И наконец, присутствие ингибиторов, таких как полисахариды, полифенолы, пектин, ксилан или жир, может изменить эффективность реакции ПЦР. Следовательно, будет наблюдаться более поздний сигнал qPCR, чем теоретически ожидаемый, что вызывает недооценку или даже снижение показателя количества ГМО, присутствующего в тестируемом образце [11].

В связи с вышеизложенным, для решения этих проблем были разработаны некоторые альтернативные подходы, позволяющие, в частности, проводить более быстрое обнаружение целевых трансгенов. К альтернативным ДНК-зависимым методам обнаружения ГМО относят мультиплексную ПЦР, изотермическую амплификацию с формированием петель, одновременное обнаружение нескольких ГМО (ПЦР-капиллярный гель-электрофорез, мик-рочипирование и Luminex-технология), точное количественное определение целевых ГМО (цифровая ПЦР) или характеристика неизвестных ГМО (с использованием секвенирования нового поколения) [4, 11, 12].

Для идентификации ГМО, созданных при помощи методов редактирования геномов, используют методы, основанные на амплификации ДНК, секвенирования ДНК, тесты на нуклеазу Surveyor и Т7эндонуклеазу I, скрининг на основе анализа плавления с высоким разрешением, высокопроизводительное отслеживание мутаций, а также методы анализа гибридизации ДНК и методы, основанные на анализе белков и метаболитов [11-13].

Таким образом, суммируя вышеизложенное, следует отметить, что несмотря на возможные риски применения ГМО, разрабатываются новые методы их создания. Однако при этом в соответствии с требованиями международного законода-

тельства разрабатываются новые методы их идентификации в пищевых продуктах.

Список литературы

1. van Meijl H., Shutes L., Valin H., Stehfest E., van Dijk M., et al. 2020. Modelling alternative futures of global food security: Insights from FOODSECURE. Global Food Security. 25:100358

2. Bleotu C., Matei L., Dragu L.D., et al. 2018. Methods for Plant Genetic Modifcation. In: Grume-zescu AM, Holban AM, editors. Genetically Engineered Foods. New York: Academic Press, pp. 385-401

3. Kamle S., Ali Sh. 2013. Genetically modified crops: Detection strategies and biosafety issues. Gene. 522:123-32

4. Fraiture M-A., Herman P., Taverniers I., et al. 2015. Current and New Approaches in GMO Detection: Challenges and Solutions. BioMed Research International. 2015:392872

5. Juturu V.N., Mekala G.K., Kirti P.B. 2014. Current status of tissue culture and genetic transformation research in cotton (Gossypium spp.). Plant Cell Tiss Org Cult. 120:813-39

6. Abdurakhmonov I.Y., et al. 2016. RNA interference for functional genomics and improvement of cotton (Gossypium spp.). Front. Plant Sci.7: 202

7. Kamburova V.S., Salakhutdinov I.B., Sherma-tov Sh.E., Abdurakhmonov I.Y. 2021.Using of Genome Editing Methods in Plant Breeding. In: Abdu-rakhmonov IY, editor. Plant Breeding - Current and Future Views. London: IntechOpen. pp. 319-35

8. Imran M., Butt M., Hannan A., Manzoor A., Qaisar U. 2020. Gene editing: A potential tool to enhance field crop production. International Journal of Biotech Trends and Technology. 10(1):72-82

9. Sauer N.J., Mozoruk J., Miller R.B., Warburg Z.J., et al. 2016. Oligonucleotide-directed mutagenesis for precision gene editing. Plant Biotechnol. J.; 14:496502

10. Mishra R., Joshi R.K., Zhao K. 2020. Base editing in crops: current advances, limitations and future implications. Plant Biotechnology Journal. 18:20-31

11. Li R., et al. 2017. Molecular characterization of genetically-modified crops: Challenges and strategies. Biotechnology Advances. 35: 302-309

12. Iordache F., Maniu H., Curutiu C., et al. 2018. Identifcation of Genetically Modifed Foods. In: Grumezescu AM, Holban AM, editors. Genetically Engineered Foods. New York: Academic Press, p. 369-83.

13. Grohmann L., Keilwagen J., Duensing N., et al. 2019. Detection and Identifcation of Genome Editing in Plants: Challenges and Opportunities. Front. Plant Sci. 10:236.

ПРОБЛЕМЫ ПРОГНОЗА УСПЕШНОСТИ ИНТРОДУКЦИИ РАСТЕНИЙ В УЗБЕКИСТАНЕ

Белолипов И.В.,

Кафедра "Экологическая безопасность сельского хозяйства и ботаника " Ташкентского государственного аграрного университета.

Профессор, доктор биологических наук.

Исламов А.М., Кафедра "Экологическая безопасность сельского хозяйства и ботаника" Ташкентского государственного аграрного университета.

Старший преподаватель Латыпова Э.А.

Кафедра «Биология, биологические технологии и ветеринарно-санитарная экспертиза» Пензенского государственного аграрного университета.

Доцент

PROBLEMS OF FORECASTING THE SUCCESS OF PLANT INTRODUCTION IN UZBEKISTAN

Belolipov I.,

Department of Environmental safety agriculture and botany of the Tashkent State Agrarian University Professor, Doctor of Biological Sciences

Islamow A., Department of Environmental safety agriculture and botany of the Tashkent State Agrarian University

Senior Lecture Latypova E.

Associate Professor of the Department of Biology, Biological Technologies and veterinary and sanitary examination Penza State Agrarian University