CC BY
57
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, № 2
Санитария и экология
УДК 636/639:614.31
МЕТОДЫ САНИТАРНОГО КОНТРОЛЯ ЖИВОТНОВОДЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ. СООБЩЕНИЕ V. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ СУЛЬФАДИМИДИНА*
М.А. БУРКИН1, Г.П. КОНОНЕНКО2, А.А. БУРКИН2
Конъюгаты сульфадимидина с альбуминами и желатином, синтезированные реакцией азосочетания, использованы для индукции кроличьих антител и оптимизации условий иммуно-ферментного анализа. Антитела к конъюгату с бычьим сывороточным альбумином имели высокую специфичность и не взаимодействовали с другими сульфаниламидами. Непрямой твердофазный конкурентный иммуноферментный анализ на основе полученных антител и иммобилизованного конъюгата с яичным альбумином обеспечивал чувствительность определения сульфадимидина 0,2 нг/мл. Обсуждается возможность применения анализа для контроля остаточных количеств сульфадимидина в молоке, мясе, яйцах и норм его введения в корма.
Ключевые слова: сульфадимидин, иммуноанализ, корма, молоко, мясо, яйца.
Keywords: sulfadimidine, immunoassay, feeds, milk, meat, eggs.
Сульфаниламиды были первыми противомикробными средствами, которые нашли широкое применение в ветеринарной практике. С появлением антибиотиков, а в последние годы фторхинолонов их использование несколько сократилось, но не утратило своего значения (1). На основе сульфаниламидов созданы и успешно применяются комбинированные препараты, высокоэффективные при инфекционных заболеваниях, вызванных чувствительными к ним микроорганизмами, в частности при кокцидиозе сельскохозяйственной птицы (2).
К наиболее известным сульфаниламидам относится 4-амино-М-(4,6-диметил-2-пиримидинил)бензолсульфонамид, для которого используется эмпирическое обозначение сульфадимидин (СД) и его синонимы сульфадимезин — в отечественной литературе, сульфаметазин (sulfameta-zine) — в зарубежной:
В 1980-е годы для определения СД в кормах и животноводческой продукции наряду с хроматографическими методами (3-5) был предложен иммуноферментный анализ (ИФА) (6-8). В настоящее время за рубежом контроль за нормами введения СД в корма и за его остатками в молоке и мясе осуществляется с помощью иммуноферментных тест-систем в разных форматах — от быстрых оценочных тестов (ELISA-card, «Environmental Diagnostics, Inc.», США; ELISA-tube test, «Idetek, Inc.», США; ELISA-cap, «IDEXX Corporation», США) до полных аналитических схем в прямом или непрямом варианте (ELISA-wells, «SmithKline Animal Health Products», США; «Neogen Corporation»; США, «R-Biopharm GmbH», Германия). В России
* Сообщения I, II, III и IV см. в журналах «Сельскохозяйственная биология» № 4, № 6 за 2010 год, № 2 и № 4 за 2011 год.
исследования, направленные на поиск приемов селективного определения СД с помощью метода ИФА, не проводились.
Целью настоящей работы стало получение иммунореагентов с высокой специфичностью к сульфадимидину (СД) и их применение для индикации СД в продукции животноводства и кормах методом непрямого иммуноферментного анализа.
Методика. В работе использовали сульфаметазин («Sigma», США), нитрит натрия и органические растворители («Fluka», Германия), бычий сывороточный альбумин (БСА), кроличий сывороточный альбумин (КСА), яичный альбумин (ЯА), желатин (Жел), фармацевтические препараты: сульфадимезин, сульфасалазин, фталазол, сульгин, сульфален, сульфадиметоксин, сульфацил, этазол, норсульфазол, стрептоцид отечественного производства. Антивидовой ферментный конъюгат получали из перокси-дазы хрена (КФ 1.11.1.7) («Sigma», США) и антисыворотки осла к кроличьим иммуноглобулинам отечественного производства согласно описанию (9). ИФА выполняли на высокосвязывающих полистирольных планшетах (# 9018, «Costar», США) с использованием фотометра АКИ-Ц-01 (Россия). УФ-спектры записывали на приборе Hitachi-557 («Hitachi», Япония).
Таблетки сульфаниламидных препаратов измельчали в ступке, добавляли 20 мл ацетона, после встряхивания оставляли на 14 ч, затем фильтровали, растворы упаривали и сухие остатки взвешивали. Для контроля индивидуальности полученных веществ по 2 мкл растворов в метаноле с концентрацией 1 мг/мл наносили на пластинки силуфол-UV 254. После хроматографического разделения в подвижной фазе (хлороформ: метанол, 9:1) пластинки просматривали в УФ-свете и обрабатывали парами йода, 20 % спиртовым раствором серной кислоты и 0,3 % спиртовым раствором бромфенолового синего. Далее из навесок готовили растворы этих же веществ в 0,1 н. водном растворе HCl, записывали УФ-спектры, рассчитывали молярные экстинкции для длинноволновых максимумов поглощения и сравнивали их с приведенными в литературе (10).
Синтез белковых конъюгатов СД осуществляли реакцией азосочетания (11). Из эквимолярных количеств СД, нитрита натрия и соляной кислоты получали соль диазония, в 50-кратных мольных избытках добавляли ее к растворам БСА, КСА, ЯА и Жел с концентрациями 10 мг/мл в 0,05 М карбонат-бикарбонатном буфере (рН 9,0-9,5). Окрашенные коричнево-оранжевые реакционные смеси выдерживали 2 ч при 0 °С, после чего диализовали 2 сут против трех смен 1000-кратного объема 0,5 % раствора хлористого натрия. К диализатам добавляли равный объем глицерина и хранили при -10...-15 °С. Процедуры иммунизации кроликов, тестирования антисывороток и выполнения ИФА не отличались от описанных нами ранее (12).
При индикации остатков СД с использованием разработанной методики объектами анализа были 20 проб цельного коровьего молока, 7 проб сухого молока, образцы куриного мяса и яиц из торговой сети г. Москвы.
Результаты. Метод тонкослойной хроматографии не выявил примесей в сульфадимидине, полученном из фармацевтического препарата. По хроматографической подвижности и характеру обнаружения на пластинках при обработке 1 % раствором перманганата калия в 0,25 М растворе серной кислоты это вещество не отличалось от сульфаметазина фирмы «Sigma» (США). Высокую степень его чистоты подтверждала также хорошая сходимость результатов спектрофотометрического определения концентрации для двух видов водных растворов, приготовленных весовым методом (табл. 1).
1. Сравнительный спектрофотометрический анализ растворов сульфадимиди-на (СД), выделенного из фармацевтического препарата отечественного производства
Показатель Растворитель
0,1 н. НС1 | 0,1 н. №ОН
Данные УФ-спектра СД (10):
хмакс., нм 243 242; 258
удельное поглощение 541 760; 783
Концентрация СД, мкг/мл:
по массе 11,0 11,0; 11,0
по УФ-поглощению 10,7 (є = 15056) 10,4 (є = 21151); 10,5 (є = 21791)
П р и м е ч а н и е. є — молярная экстинкция.
У остальных сульфаниламидов, выделенных из фармацевтических препаратов, также практически полностью совпадали значения концентраций растворов в 0,1 н. НС1, определенных весовым и спектральным методами. В дальнейшем исходные растворы этих веществ для анализа разбавляли ацетонитрилом. В УФ-спектре раствора СД в ацетонитриле пик длинноволнового максимума поглощения был смещен в сторону больших значений — к X = 268 нм, но величина є практически не отличалась и составила 21685+845 (п = 5). Определение этих параметров требовалось для уточнения концентраций калибровочных растворов СД в анализе.
СД из таблеток фармацевтического препарата был использован в качестве гаптена для конъюгирования с белками. При выполнении азосочетания быстрое появление коричнево-оранжевого окрашивания реакционных смесей указывало на присоединение вещества. При спектрофотометрическом анализе продуктов его реакции с альбуминами и Жел наблюдалось единообразное резкое возрастание интенсивности пика поглощения в области от 250 до 300 нм. Так как длинноволновый максимум СД находится вблизи пика поглощения белковых носителей (X = 280 нм), это также служит подтверждением факта связывания используемого гаптена с макромолекулами.
Рис. 1. Степень связывания антител к БСА-СД(50), полученных при 1-3-м отборах крови (1-3), с твердофазным антигеном БСА-СД(50) в концентрации 0,05 мкг/мл в присутствии СД в буфере ФСБ-т: БСА, сД, ФСБ-т — соответственно бычий сывороточный альбумин, сульфадимидин, фосфатно-солевой буферный раствор, содержащий Твин 20 (ИФА).
Выбранный для иммунизации конъюгат БСА-СД(50) уже после 2-го введения (при 1-м отборе крови) обеспечил получение антител с рабочим титром 1:5000 и возможность определения СД в растворах до концентрации 10 нг/мл. Продолжение процедуры иммунизации сопровождалось сначала возрастанием рабочего титра антител до 1:10 000, затем постепенным снижением до 1:5000 и 1:2500. После 3-го введения иммуногена (2-я сыворотка) чувствительность анализа возросла на один порядок, а после 4-го введения (3-я сыворотка) характер зависимости аналитического сигнала от концентрации стал приобретать черты стабилизации (рис. 1). После 5-го введения
(4-я сыворотка) произошло не только снижение рабочих титров до 1:2500,
но и ухудшение качества конкурентного взаимодеиствия.
Из трех иммобилизованных конъюгатов, отличающихся от иммуногена типом белкового носителя, только для КСА-СД(50) и ЯА-СД(50) наблюдалась линеИность аналитического сигнала в интервале концентрации СД от 0,1 до 100 нг/мл. ТретиИ конъюгат — Жел-СД(50), обладая иммунореактивностью, все же не обеспечивал нормальных условиИ для конкурентного взаимодеИствия (табл. 2), тогда как в анализе с иммобилизованным ЯА-СД(50) при возрастании концентрации СД от 0,1 до 100 нг/мл реакция тормозилась слабее (снижение степени связывания с 93 до 12 %).
2. Степень связывания (%) антител к БСА-СД(50) в сыворотке от 3-го отбора крови с различными иммобилизованными антигенами в присутствии СД
(ИФА)
ИммобилизованныИ антиген СД, нг/мл
(С = 0,05 мкг/мл) 100 1 10 | 1 0,1
БСА-СД(50) 13 44 74 90
КСА-СД(50) 16 43 72 89
ЯА-СД(50) 12 38 66 93
Жел-СД(50) 25 61 80 94
П р и м е ч а н и е. СД, БСА, КСА, ЯА, Жел — соответственно альбумин, кроличий сывороточный альбумин, яичный альбумин, сульфадимидин, бычиИ сывороточныИ желатин.
Оценка перекрестного взаимодействия антител с использованием сульфасалазина, фталазола, сульгина, сульфалена, сульфадиметоксина, суль-фацила, этазола, норсульфазола и стрептоцида показала, что у ближайшего структурного аналога СД из этого ряда — сульфадиметоксина в концентрациях 100 и 1000 нг/мл степень связывания составила соответственно 87 и 67 %, а у остальных веществ превышала 90 %. Именно такую высокую специфичность полученных антител, свидетельствующую о возможности избирательной индикации СД в присутствии других сульфаниламидов, можно было прогнозировать, исходя из ориентации гаптена в иммуногене.
Предел определения СД в буферном растворе с учетом утроенного среднего квадратичного отклонения оказался равным 0,2 нг/мл (рис. 2). Сравнение градуировочных графиков, полученных в условиях промежуточной прецизионности ежедневно или с интервалом 1-2 сут, показало, что значения доли (%) связывания антител (п = 10) имеют относительное стандартное отклонение не более 5 %, то есть в лабораторных условиях при обычных колебаниях внешних факторов тест-система сохраняет функциональную устойчивость.
Описанные нами ранее приемы выполнения непрямого ИФА антибиотиков в молоке с его предварительным разбавлением и в водно-ацетонитрильных экстрактах кормов, мяса, яиц (12) оказались приемлемыми и для СД. При разбавлении молока в 3 раза тест-система позволяла проводить
Рис. 2. Калибровочные графики ИФА СД с антисывороткой к БСА-СД(50) от 3-го отбора крови и твердофазным антигеном ЯА-СД(50) в молоке при 3-кратном разбавлении ФСБ-т (1), в смеси ацетонитрила с водой при 10-кратном разбавлении ФСБ-т (2), в водно-ацетонитрильном экстракте куриного мяса (3) и яиц (4) при 10-кратном разбавлении ФСБ-т: БСА, ЯА, СД, ФСБ-т — соответственно бычиИ сывороточ-ныИ альбумин, яичныИ альбумин, сульфади-мидин, фосфатно-солевоИ буферныИ раствор, содержащиИ Твин 20.
измерение СД с чувствительностью 0,4 нг/мл (при торможении связывания антител 72 %) (см. рис. 2) и, следовательно, обеспечивала определение остатков СД в продукции до 1,2 мкг/кг.
При анализе сырого, пастеризованного и стерилизованного молока, отобранного в разное время, для 16 из 20 проб степень связывания антител составляла 90 % и более, однако для четырех исследованных образцов величина показателя была ниже 70 % и соответствовала содержанию СД 10; 19; 84 и 119 мкг/кг. В двух из этих положительных образцов содержание СД значительно превышало ПДК (25 мкг/кг) (13). В двух из 7 протестированных проб сухого молока также обнаружили СД в сверх-пороговых количествах — 72 и 78 мкг/кг. Полученные результаты указывают на необходимость систематического контроля молока на соответствие этому показателю санитарного качества.
Калибровочный график для СД в варианте с добавлением 10 % водного ацетонитрила в буферный раствор (см. рис. 2) демонстрирует возможность анализа кормов при экстракции водным ацетонитрилом с пределом измерения 10 мкг/кг.
Подготовка проб с помощью высушивания (12) может дать практическим специалистам простой и удобный способ контроля безопасности мясной продукции и яиц. Судя по нашим данным (см. рис. 2), экстрактивные вещества не ухудшают функционирования тест-системы. Минимальное измеряемое содержание СД в этих условиях составило 2 мкг/кг, тогда как по действующим правилам в мясе и субпродуктах (печень, почки) крупного рогатого скота, овец, свиней и птицы допускаются остатки указанного сульфаниламида 100 мкг/кг (13).
Таким образом, разработанный высокочувствительный специфичный метод непрямого конкурентного иммуноферментного анализа может быть использован для контроля за количеством остатков сульфадимидина во всех видах животноводческой продукции, а также за соблюдением регламентированных доз препаратов, содержащих этот сульфаниламид, в рационах сельскохозяйственных животных и птицы.
Л И Т Е Р А Т У Р А
1. К л е н о в а И.Ф., Я р е м е н к о Н.А. Ветеринарные препараты в России. Справочник. М., 2001.
2. Справочник ветеринарных препаратов /Под ред. Е.А. Панковца. Минск, 1996.
3. A l l r e d M.C., D u n m i r e D.L. High performance liquid chromatography determination of sulfamethazine at low levels in nonmedicated swine feeds. J. Chromatogr. Sci., 1978, 16(11): 533-537.
4. M u n n s R.K., R o y b a l J.E. Rapid gas-liquid chromatographic method for determination of sulfamethazine in swine feed. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1982, 65(5): 1048-1053.
5. H o u g l u m J.E., L a r s o n R.D., N e a l R.M. Liquid chromatographic determination
of sulfamethazine in feeds. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1988, 71(5): 1054-1056.
6. M c C a u g h e y W.J., E l l i o t t C.T., C r o o k s S.R. Determination of sulphadi-
midine in animal feedstuff's by an enzyme-linked immunoassay. Food Addit. Contam., 1990, 7(2): 259-264.
7. D i x o n - H o l l a n d D.E., K a t z S.E. Competitive direct enzyme-linked immunosorbent assay for detection of sulfamethazine residues in swine urine and muscle tissue. J. Assoc.
Off. Anal. Chem., 1988, 71(6): 1137-1140.
8. D i x o n - H o l l a n d D.E., K a t z S.E. Direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay for sulfamethazine residues in milk. J. Assoc. Off. Anal. Chem., 1989, 72(3): 447-450.
9. N a k a n e P.K., K a w a o i A. Peroxidase-labeled antibody. A new method of conjugation.
J. Histochem. Cytochem., 1974, 22(2): 1084-1091.
10. M o f f a t A.C., J a c k s o n J.V., M o s s M.S., W i d d o p B. Clarke’s isolation and identification of drugs. London, 1986.
11. H e r m a n s o n G.T. Bioconjugate techniques. San Diego-N.Y.-Boston-London-Sydney-
Tokyo-Toronto, 1996: 446-449.
12. Б у р к и н А.А., К о н о н е н к о Г.П., Б у р к и н М.А. Методы санитарного контроля продукции животноводства. ^общение I. Иммуноферментный анализ тетрацик-линов. С.-х. биол., 2010, 4: 110-117.
13. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. Санитарно-эпидемиологические правила и нормативы. СанПиН 2.3.2.1078-01. М., 2002.
1НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Поступила в редакцию
105064 г. Москва, Малый Казенный пер., 5а, 26 мая 2011 года
e-mail: [email protected];
2ГНУ Всероссийский НИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Росселъхозакадемии,
123022 г. Москва, Звенигородское ш., 5, e-mail: [email protected]
METHODS OF SANITARY SURVEILLANCE OF LIVESTOCK PRODUCTION. V. IMMUNE-ENZYME ANALYSIS OF SULFADIMIDINE
M.A. Burkin1, G.P. Kononenko2, A.A. Burkin2
S u m m a r y
Conjugates of sulfadimidine with albumin and gelatin, synthesized by azocoupling reaction were used for induction of rabbit antibodies and optimization of immune-enzyme analysis. The antibodies to conjugate with bovine serum albumin have a high specificity and do not interact with other sulfanilamides. The indirect solid phase competitive immune-enzyme analysis on the basis of obtained antibodies and immobilized conjugate with egg albumin permits to have the sensitivity of determination of sulfadimidine of 0.2 ng/ml. The possibility of application of this assay for control of residual content of sulfadimidine in milk, meat, eggs and the norms of its addition to food is discussed.
Научные собрания
МЕЖДУНАРОДНАЯ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ «СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ ПРИРОДОПОЛЬЗОВАНИЯ, ОХОТОВЕДЕНИЯ И ЗВЕРОВОДСТВА»
(22-25 мая 2012 года, г. Киров, ВНИИОЗ им. профессора Б.М. Житкова)
Конференция посвящена 90-летию института Всероссийский НИИ охотничьего хозяйства и
звероводства Россельхозакадемии (ВНИИОЗ им. профессора Б.М. Житкова).
Основные тематические направления:
+ Экологические аспекты комплексного природопользования и сохранения биоразнообразия.
+ Вопросы биологии охотничьих животных и рационального использования их популяций.
+ Состояние ресурсов охотничьих животных и среды их обитания.
+ Современные методики учета и прогнозирования численности. Мониторинг и кадастр охотничьих видов.
+ Способы интенсификации охотничьего хозяйства. Технологии охотхозяйственного менеджмента.
+ Экологические и экономические аспекты устойчивого использования дикорастущих лекарственных и пищевых растений, съедобных грибов.
+ Правовое обеспечение деятельности охотничьего хозяйства. Государственное управление в охотхозяйственной сфере.
+ Организационно-экономические особенности ведения охотничьего хозяйства, рынок охотхозяйственной продукции и услуг. Оценка экономического значения охоты.
+ Организация заготовок и переработки продукции охоты. Товароведение пушной и мясо-дич-ной продукции, дериватов, пищевого и лекарственно-технического растительного сырья.
+ Охотничья таксидермия и трофейное дело.
+ Вопросы звероводства, дичеразведения, охотничьего собаководства, содержания и разведения ловчих и манных животных.
+ Профилактика и меры борьбы с болезнями диких и разводимых в неволе животных. Зооантро-понозные болезни и их профилактика.
+ Антропогенное воздействие на состояние ресурсов и качество продукции охотничьего хозяйства.
+ Проблемы развития и современные методы исследований в охотоведении и звероводстве.
+ Внедрение инноваций в практику охотничьего хозяйства.
Контакты и информация: www.vniioz.kirov.ru
