CC BY
45
14 Научный журнал Вестник Курганской ГСХА
УДК 577.2;619;636.018.033.035
Н. А. Гвоздецкий
МЕТОДЫ ПОДГОТОВКИ СПЕРМЫ ДЛЯ ОПЛОДОТВОРЕНИЯ IN VITRO: ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «СТАВРОПОЛЬСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»
N. A. Gvozdetsky
METHODS OF SPERM PREPARATION FOR INSEMINATION IN VITRO: ADVANTAGES AND SHORTCOMINGS
FEDERAL STATE BUDGETARY EDUCATIONAL INSTITUTION OF HIGHER EDUCATION «STAVROPOL STATE AGRICULTURAL UNIVERSITY»
Аннотация. Внедрение инновационных разработок в технологический процесс является основополагающим элементом повышения воспроизводства животных в хозяйствах. Одним из перспективных методов является экстракорпоральное оплодотворение. Целью этой работы явилось изыскание существующих методов снижения агглютинации спермиев при подготовке свежеполу-ченной спермы к процессу оплодотворения in vitro.
Ключевые слова: сперма; агглютинация; экстракорпоральное оплодотворение; бараны; питательные среды.
Summary. Introduction of innovative developments in technological process is a fundamental element of increase in animals' reproduction in farms. One of perspective methods is extracorporal insemination. The purpose of this work was research of the existing methods how to decrease agglutination of sperm by preparation of freshly preparing sperm for insemination in vitro process.
Keywords: sperm; agglutination; extracorporal insemination; rams; nutrient mediums.
Николай Алексеевич Гвоздецкий
Nikolay Alekseevich Gvozdetsky [email protected]
Введение. В 90-е годы XX века благодаря внедрению в биотехнологическую, медицинскую и ветеринарную практику культивирования гамет и эмбрионов, обусловленному возрастающими потребностями современного общества, интерес к репродуктивной биологии значительно вырос. Если в медицинской практике вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) - это способ лечения бесплодия, то в сельском хозяйстве это метод улучшения генетического благополучия стада и эффективный метод увеличения численности поголовья [1; 2].
Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) является одной из трудоемких, но результативных процедур, позволяющих получить не только большее количество потомства от одних родителей, но и улучшить генетические свойства поголовья хозяйства в короткие сроки. Важным требованием при проведении процедуры ЭКО является качество половых клеток полученных от обоих родителей, именно от правильной подготовки яйцеклеток и спермиев зависит успешное оплодотворение in vitro. По мнению ученых из Австралии [3], повышенная агглютинация спермиев при их внесении в синтетическую культуральную среду приводит к низкой фертильности спермиев при проведении ЭКО. Непосредственно перед оплодотворением спермии должны не менее 6 часов находиться в абдоминальной части яйце-провода, где произойдет капацитация (инкубация) спермы,
т. е. процесс «созревания», после которого, при достаточном скоплении спермиев, возможен процесс оплодотворения [4]. Обычно для подготовки спермы и индукции капа-цитации спермиев используется внесение свежеполучен-ной спермы в раствор SOF wash [5]. Однако при проведении экспериментов нами часто наблюдалась интенсивная агглютинация после попадания спермиев в эту среду, приводящая к крайне низкому выходу зигот в процессе ЭКО. В доступной нам литературе практически не имеется данных о методах предотвращения агглютинации спермиев при проведении процедуры ЭКО с использованием свеже-полученной спермы, так как большинство авторов предпочитают использовать для работы свежезамороженный материал (Morrier et al., 2002). Поэтому цель этой работы заключается в поиске существующих методик подготовки спермы для проведения процедуры ЭКО.
Материал и методы исследования. Для выполнения поставленной цели был использован метод, основанный на исчерпывающем литературном обзоре отечественной и зарубежной литературы.
Результаты и обсуждение работы. Известен способ приготовления синтетической среды для разбавления и замораживания спермы баранов, включающей лактозу, ксилит, трис-(оксиметил)-аминометан, трилон-б, глицерин, желток куриного яйца, дистиллированную воду, отличающейся тем, что среда дополнительно содержит костный клей при следующем процентном соотношении ингредиентов: лактоза 6,0, костный клей 1,8, ксилит 0,18, трис-(оксиметил)-аминометан 0,07, трилон-б 0,1, глицерин 4,3, желток куриного яйца 14,2, вода дистиллированная до 100 [6]. Для оплодотворения используется замороженная сперма, что снижает ее качество и эффективность процесса оплодотворения.
Известен также способ получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro, включающий использование одной основы для всех питательных сред - SOF, состоящей из 117,7 ммоль NaCl, 7,16 ммоль KCl, 1,19 ммоль KH2PO4, 0,49 ммоль MgCl2, 0,33 ммоль пирувата натрия,
Вестник Курганской ГСХА № 3, 2016 Сельскохозяйственные науки 15
0,75 мг/мл канамицина сульфата, причем для оплодотворения используют оттаянную сперму быка, которую выдерживают в среде SOF без глюкозы с добавлением поливи-нилалкоголя (1 мг/мл), HEPES, 20 мкмоль пеницилламина, 10 мкмоль гипотаурина, 2 мкмоль эпинефрина в течение 1 часа, после чего 3 раза центрифугируют и промывают.
Для оплодотворения ооциты по 5-6 штук помещают в капли среды объемом 46 мкл с добавлением 4 мкл суспензии спермиев (конечная концентрация 1 000 000 в мл) или 1 в каплю объемом 8 мкл с 2 мкл суспензии спермиев под парафиновым маслом. Среда оплодотворения готовится на основе SOF без глюкозы с добавлением по-ливинилалкоголя (1 мг/мл), хлорида кальция 1,71 ммоль,
1 % раствора незаменимых аминокислот, 5 Ед/мл гепарина, 20 мкмоль пеницилламина, 10 мкмоль гипотаурина,
2 мкмоль эпинефрина. Инкубируют в течение 22-24 часов при 39 °С в атмосфере 5 % СО2 и 95 % влажности [7]. Для оплодотворения используется замороженная сперма, что снижает ее качество и эффективность процесса оплодотворения. В связи с тем, что метод используется для получения эмбрионов крупного рогатого скота, в среде не используется бычий сывороточный альбумин для предотвращения переноса губчатой энцефалопатии. Он заменен на поливинилалкоголь, который не является естественным метаболитом, как и HEPES, и может снижать выживаемость бластоцист. Для капацитации спермиев применена комбинация пеницилламина, гипотаурина, эпинефрина.
Известен способ обеспечения созревания, оплодотворения ооцитов и культивирования эмбрионов крупного рогатого скота, включающий использование одной основы для всех питательных сред - SOF, состоящей из 99,7 ммоль NaCl, 7,16 ммоль KCl, 1,19 ммоль KH2PO4, 0,49 ммоль МдС126Н2О, 3,3 ммоль/л натриевой соли молочной кислоты, 25,07 ммоль/л гидрокарбоната натрия, 1,71 ммоль/л хлорида кальция, причем для оплодотворения используют оттаянную сперму быка, которую выдерживают в среде SOF без глюкозы с HEPES, лактатом натрия, 0,33 ммоль пи-рувата натрия, 3 мг/мл бычьего сывороточного альбумина в течение 1 часа, после чего 3 раза центрифугируют и промывают [8]. Недостатком способа является использование для оплодотворения замороженной спермы, что снижает ее качество и эффективность процесса оплодотворения. Для капацитации спермиев при использовании данной технологии никаких дополнительных веществ в среду для промывки спермиев не добавляется, что также может отражаться на процессе проникновения спермиев в яйцеклетку.
Известен способ получения эмбрионов свиней in vitro, включающий эякуляторную сперму хряков, разбавленную глюкозо-хелато-цитратно-сульфатным разбавителем, отмытую от семенальной плазмы, разбавленную средой mTBM и проинкубированную в течение 25 минут в условиях инкубатора при 5 % CO2 и 38,5 °С. Полученные зиготы культивируют в среде NCSU-23, не содержащей феноловый красный, обогащенной 0,1% аминокислот в течение 6-7 дней; в первые трое суток культивирования в среду NCSU-23 дополнительно вводят 0,17 ммоль Na-пирувата и 2,75 ммоль Na-лактата. Изобретение позволяет повысить выход зрелых ооцитов до 80 %, их оплодотворяемость in vitro до 77 %, при этом стадии морулы/бластоцисты достигали до 25,7 % эмбрионов [9]. Недостатком данного способа является использование материала от забитых животных и применения его только для одного вида (свиней).
Существует способ получения зародышей овец после созревания и оплодотворения ооцитов и культивирования зародышей in vitro, включающий использование све-жеполученной спермы барана, 100 мкл которой помеща-
ют в 1 мл среды SOF с добавлением 20 ммоль HEPES и 8 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, и 45 минут инкубируют в термостате при 39 °С. Далее супернатант в объеме 800 мкл отбирают в новую пробирку, дважды отмывают в 3 мл среды с центрифугированием при скорости 200 оборотов в минуту в течение 3 минут. Для оплодотворения используют объем 5 мкл с содержанием сперматозоидов 1 000 000 в мл, который добавляют в каплю среды с добавлением 20 % инактивированной сыворотки овец во время течки объемом 45 мкл, находящуюся под парафиновым маслом из расчета 10 ооцитов в одной капле [10]. Способ имеет ряд недостатков. Для капацитации спермиев используется инактивированная сыворотка крови овец во время течки, добавляемая в среду оплодотворения, что не является оптимальным методом, так как ее состав может существенно варьировать, а это не позволяет стандартизировать условия оплодотворения ооцитов.
Вывод. Таким образом, для достижения цели научной работы, а именно снижения агглютинации спермиев в куль-туральных средах при подготовки их к ЭКО существует необходимость разработки комбинированной методики подготовки спермы, которая будет удовлетворять всем физико-химическим и биологическим требованиям, способствующим получению эмбрионов овец в искусственно созданных условиях вне организма для развития как племенного животноводства, так и в научно-исследовательских целях.
Список литературы
1 Багиров В. А. Фертильность сперматозоидов и состояние хроматина //Сельскохозяйственная биология. - 2012.
- № 2. - С. 3-12.
2 Дьяконов Л. П. Животная клетка в культуре (Методы и применение в биотехнологии). / Под общ. ред. проф. Л. П. Дьяконова. - М. : Издательство «Спутник+», 2009. - 656 с.
3 Salamon, S. Storage of ram semen / S. Salamon, W.M.C. Maxwell // Animal Reproduction Science. - 2000.
- № 69. - р. 77-111.
4 Ветеринарное акушерство, гинекология и биотехника размножения / А. П. Студенцов, В. С. Шипилов, В. Я. Никитин [и др.]. - М. : Колос, 2000. - 495 с.
5 Cognie, Y. Current status of embryo technologies in sheep and goat / Y. Cognie, G. Baril, N. Poulin, P. Mermillod // Theriogenology. - 2003. - № 59. - p. 171 - 188.
6 Пат. 2198622 Российская Федерация, МПК7 A61D19/02. Синтетическая среда для разбавления и замораживания спермы баранов / В. И. Деряженцев; В. В. Никонов; Т. М. Епишина ; заявитель и патентообладатель Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела. № 2000130381/13 ; заявл. 05.12.2000 ; опубл. 20.02.2003
7 Additional effect of epidermal growth factor during in vitro maturation for individual bovine oocytes using a chemically defined medium. / T. Oyamada, H. Iwayama, Y. Fukui. // Zygote.
- 2004. - V. 12, № 02. - Р 143-150.
8 A single medium supports development of bovine embryos throughout maturation, fertilization and culture. / A.P. Gandhi, M. Lane, D.K. Gardner, R.L. Krisher. // Human Reproduction. - 2000. - Vol. 15, № 2. - P. 395-401.
9 Пат. 2340177 Российская Федерация, МПК9 A01K67/02, A61D19/04. Способ получения эмбрионов свиней in vitro / Г Н. Сингина ; заявитель и патентообладатель Всероссийский государственный научно-исследовательский институт животноводства (ВИЖ). № 2007118024/13 ; заявл. 14.05.2007 ; опубл. 10.12.2008.
10 The Effect of Macromolecule Source and Type of Media During in vitro Maturation of Sheep Oocytes on Subsequent Embryo Development. / A. Shirazi, M. A. Ardali, E. Ahmadi, H. Nazari., M. Mamuee, B. Heidari. // J. Reprod. Infertil. - 2012.
- Vol. 13, № 1. - Р. 13-19.
