CC BY
194
УДК 577.1:616-006
Д. С. Копицын (асп., инж.), А. В. Бескоровайный (асп., инж.), М. С. Котелев (асп., м.н.с.)*, А. А. Новиков (зав.лаб.), Е. В. Иванов (к.х.н., с.н.с.), Е. В. Винокуров (д.х.н., зав. каф.)
Методы оптическогобиоимиджинга в исследованиях онкологических заболеваний
Российский государственный университет нефти и газа имени И. М. Губкина, кафедра физической и коллоидной химии 119991, Москва, Ленинский пр., д. 65 корп. 1; тел. (499) 2339589, e-mail: [email protected], [email protected]
D. S. Kopitsyn, A. V. Beskorovaynyi, M. S. Kotelev, A. A. Novikov, E. V. Ivanov, E. V. Vinokurov
Optical bioimaging techniques for cancer research
Gubkin Russian State University of Oil and Gas 65, Leninskii pr, 119991, Moscow, Russia; ph. +7 (499) 2339589, e-mail: [email protected], [email protected]
В настоящей работе рассмотрены возможности современных методовоптического биоимиджин-га в приложении к диагностике опухолевых образований. Несмотря на значительный прогресс исследовательских технологий, онкологические заболевания в настоящее время продолжают оставаться проблемой мирового уровня, особенно их диагностика на ранних стадиях, когда сохраняется высокая вероятность полной реабилитации пациента. Сравнение современных технологий в области визуализации микроскопических объектов необходимо для выявления наиболее перспективных методов диагностики онкологических заболеваний.
In this paper we review modern methods of optical bioimagingand its capabilities to the cancer detection. Despite of the considerable progress of research technologies, cancer is the globally problem, especially its diagnosis in the early stages, when there is a high probability of complete rehabilitation of the patient. A comparison of modern technologies in the field of microscopic visualization is needed to identify the most promising methods for cancer diagnosis.
Key words: biomarkers; hyperspectral imaging; scanning microscopy.
Ключевые слова: гиперспектральная визуализация; сканирующая микроскопия; биомаркеры.
Исследование проводится в рамках Федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на2007—2013 гг». Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования Российской Федерации (Государственный контракт от «03» апреля 2013 г № 14.512.11.0054).
Исследование выполнено при поддержке Министерства образования и науки Российской Федерации, соглашение № 14.В37.21.1615 в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 гг.
В настоящее время проблема достоверной и своевременной диагностики рака является одной из наиболее острых во всем мире. Онкологические заболевания представляют собой не только медицинскую, но и социально-экономическую проблему мирового уровня. Злокачественные новообразования находятся в числе основных причин инвалидизации и смертности населения. Современные разработ-Дата поступления 05.10.13
ки в области систем диагностики и лечения рака ведутся параллельно по разным направлениям, и за последние 20 лет было разработано несколько подходов для визуализации злокачественных опухолей в тканях человека.
Особое внимание во всем мире уделяется развитию оптических методов визуализации раковых опухолей на уровне целого организма — whole-body imaging 1. Такой подход является перспективным в экспериментальной онколо-
гии для наблюдения опухолевого роста и регресса на фоне лечебного воздействия, изучения ангиогенеза и метастазирования, оценки оптических и фармакокинетических свойств новых фотосенсибилизаторов. При этом важным направлением развития технологий в указанной области является повышение разрешающей способности метода и снижение пределов обнаружения злокачественных новообразований. Конфокальная микроспектрометрия позволяет определять концентрации и локализацию флуоресцирующих меток в единичных клетках и тканевых срезах, спектрофотомет-рия — регистрировать флуоресценцию гомогенизированных образцов органов и тканей, локальная флуоресцентная спектроскопия — измерять флуоресцентный сигнал с поверхности изолированных органов и тканей. Однако проблема диагностирования онкологических заболеваний на ранних стадиях, когда сохраняется высокая вероятность полного выздоровления, остается серьезной и актуальной проблемой современной науки.
Методы визуализации биологических объектов. Изучение биологических структур на микроскопическом уровне дает возможность раскрыть принципы и механизмы функционирования живых организмов. До недавнего времени динамика процессов в биологических тканях не поддавалась крупномасштабным исследованиям ввиду их сложноорганизованной структуры, многокомпонентности химического состава и опасности нарушения физиологических функций тканей за счет специфического откликом организма на производимое воздействие. Однако ситуация изменилась с развитием численных методов описания процессов взаимодействия излучения с веществом и распространения излучения в сложных комплексных биологических средах, что вызвало резкий рост публикаций, посвященных построению математических моделей биообъектов 2. Диагностика наиболее серьезных заболеваний человека, профилактические обследования и научно-исследовательская медицинская практика в настоящее время немыслимы без использования методов визуализации 3'4.
Исследование биологические объекты invivo можно проводить только методами, которые не нарушают относительного динамического постоянства состава и свойств внутренней среды, и устойчивость основных физиологических функций организма, или же изучать характеристики тканей in vitro. При этом разрешение методов должно позволять наблюдать структуру ткани на клеточном уровне или
хотя бы на уровне слоев или групп клеток. Появление новых оптических технологий, таких как волоконная оптика и фемтосекундные лазеры, интенсифицировало создание новых методов диагностики. Основными требованиями, предъявляемыми к развивающимся технологиям, являются максимальная информативность и минимальное повреждающее действие в сочетании с портативностью, удобством эксплуатации и относительной дешевизной.
К наиболее распространенными методам функционального имиджинга относятся позит-ронно-эмиссионная томография (ПЭТ) 5, од-нофотонная эмиссионная томография (ОФЭКТ) 6, рентгеновская компьютерная томография (РКТ) 7, функциональная магнитно-резонансная томография (ФМРТ) 8, а также разнообразные методы оптического биоимид-жинга 9'10 (сбор информации об объекте путем наблюдения и регистрации оптических изображений).
Оптическийбиоимиджинг занимает особое место среди других методов построения изображений тканей. Оптическим биоимиджингом в настоящее время считается совокупность оптических методов визуализации структуры тканей, использующих различные эффекты взаимодействия света с рассеивающими средами. Фундаментальной исследовательской задачей оптического биоимиджинга является получение изображений структуры живых биологических объектов на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях на различных глубинах неинвазивным образом в реальном времени, а прикладной целью — создание новых методов диагностики и контроля процессов.Освоение совокупности технологий оптического био-имиджинга позволяет получать разномасштабные прижизненные изображения биологических объектов на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях, что весьма актуально как для изучения живых систем от молекулы до целого организма в науках о жизни, так и для
создание новых методов диагностики и конт-
11
роля лечения в клинической практике .
Для зондирования в методах оптической визуализации биологических объектов используется излучение длинноволновой части видимого диапазона спектра или ближнего инфракрасного диапазона, в так называемом «терапевтическом окне прозрачности» (0.7—1.3 мкм), которое может сравнительно глубоко (до нескольких сантиметров) проникать в ткань и одновременно является неинвазивным вследствие малой величины энергии оптического кванта и незначительной мощности источника
Таблица 1
Сравнение методов визуализации структуры биообъектов
№ Методы визуализации Глубина изображения Пространственное разрешение
1 Позитронно-эмиссионная томография 5 Не ограничена 1-2 мм
2 Однофотонная эмиссионная томография 6 Не ограничена 6-10 мм
3 Рентгеновская компьютерная томография 7 Не ограничена 1500-500 мкм
4 Магнитно-резонансная томография 8 Не ограничена 1000-500 мкм
5 Конфокальная микроскопия 200-300 мкм 2-1 мкм
6 Оптическая когерентная томография 10 1,5-2,0 мм 15 мкм
излучения. В данном диапазоне длин волн внутренняя микроструктура биологических объектов имеет отличающиеся на несколько порядков оптические коэффициенты рассеяния и поглощения, что является принципиальным фактором формирования контраста. Рассеяние излучения в тканях обусловлено пространственным распределением показателя преломления и зависит от особенностей строения тканей 12. На распространение оптического излучения в тканях влияет также длина волны излучения. В УФ диапазоне поглощение зависит от содержания белка, в ИК диапазоне существенное значение имеет содержание воды, как можно видеть на рисунке 13. Альтернативным способом визуализации является введение в организм различных экзогенных контрастирующих агентов (органические красители, флуоресцирующие белки, наночасти-цы и т.д.) 14.
Методы оптического биоимиджинга. Созданные за последнее время методы оптического биоимиджинга можно классифицировать по разрешающей способности на следующие группы: а) методы клеточного разрешения: конфокальная микроскопия; многофотонная флуоресцентная микроскопия (МФМ); оптическая когерентная микроскопия (ОКМ); оптическая флуоресцентная просветная микроскопия (ОФПМ); б) методы разрешения на уровне слоев/групп клеток: оптическая когерентная томография (ОКТ); методы разрешения на тканевом уровне оптическая диффузионная томография (ОДТ).
Методы оптического биоимиджинга можно разделить на использующие баллистические фотоны и диффузионные фотоны. Первые из них (конфокальная микроскопия (КМ), оптическая когерентная томография (ОКТ) многофотонная флуоресцентная микроскопия (МФМ), оптическая флуоресцентная просвет-ная микроскопия (ОФПМ)) используют различные приемы селекции при детектировании слабо рассеянных фотонов на фоне засветки от сильно рассеянного света и могут давать изображения с разрешением 1—10 мкм на неболь-
ших глубинах в диапазоне 0.1—1 мм. Указан ные технологии применяются чаще всего для наблюдения микроструктуры объектов. Вторая группа методов (оптическая диффузионная томография (ОДТ), флуоресцентная диффузионная томография ФДТ, оптоакустичес-кая томография (ОАТ)), наоборот, использует только сильно рассеянную компоненту света и позволяют с разрешением в несколько миллиметров наблюдать оптические неоднородности на глубине до десяти сантиметров, регистрировать биохимические изменения в тканях. Областями приложений являются мониторинг состояния слизистых оболочек внутренних органов, маммография, оптическая томография мозга, наблюдение тканей глаза и др. Для создания практически используемых медицинских и биологических методик зачастую требуется комбинированное исследование разными методами с целью расширения информации о
функциональном состоянии объектов исследо-
12 15 вания 12,15.
Формирование сигнала в методах оптического биоимиджинга основывается на разности оптических коэффициентов рассеяния и поглощения внутренних структур биологических объектов на микроуровне. Альтернативным способом визуализации является введение в организм различных экзогенных контрастирующих агентов (органические красители, флуоресцирующие белки, наночастицы и т.д.). 14
Методы сканирующей микроскопии. Среди методов микроскопии послойное изображение исследуемого объекта с высоким разрешением и низким уровнем шумов позволяет получить конфокальная сканирующая лазерная микроскопия. Поскольку конфокальная система фильтрации сигнала позволяет исследователю регистрировать сигнал, испускаемый только из фокальной плоскости, то, перестраивая фокус объектива, можно, не нарушая целостности исследуемого объекта, измерить распределение интенсивности полезного сигнала в любом оптическом сечении вдоль оси Z. Исследуемый препарат должен быть достаточно прозрачным, чтобы свет мог проникнуть на
заданную глубину. Но даже для прозрачных препаратов эффекты светорассеяния, поглощения возбуждающего света и поглощения испускаемой флуоресценции ограничивают возможности ЛСКМ глубиной порядка 100 мкм от поверхности сканируемого объекта. Исследования методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии проводятся на фиксированных и живых клетках 16,17, на тонких срезах тканей растительного и животного происхождения 18, и даже на небольших организмах 19.
Разновидностью конфокальной микроскопии можно считать гибридный метод оптической когерентной микроскопии (ОКМ), объединяющий преимущества конфокального микроскопа и оптического когерентного томографа, — двух известных приборов, используемых для наблюдения объектов в сильно рассеивающих излучение, в том числе, тканях 20. В ОКМ объединены факторы геометрической (конфокальной) и временной (когерентной) селекции информативного сигнала. В установке для оптической когерентной микроскопии (ОКМ) используется широкополосный источник, в первых работах фемтосекундный лазер, и также интегрирована система динамического фокуса, как у конфокального микроскопа.
Метод предназначен для построения трехмерных изображений внутренней структуры живых тканей в инфракрасном диапазоне длин волн с пространственным разрешением до единиц микрон. На данный момент разрешение метода достигает 1—3 мкм, при области перестройки 400 мкм 21.
Другим популярным и быстро развивающимся на сегодняшний день оптическим методом наблюдения трехмерных структур с субмикронным разрешением является многофотонная флуоресцентная микроскопия. Метод представляет собой один из вариантов лазерной сканирующей микроскопии, при котором возбуждение флуорохромов осуществляется лазерным излучением инфракрасного или длинноволнового видимого диапазона. Флуо-рохромы исследуемого объекта переводятся в возбужденное состояние двумя или тремя длинноволновыми фотонами, что эквивалентно возбуждению одним коротковолновым фотоном. Мультифотонная микроскопия обеспечивает более глубокое проникновение в толщу тканей и не требует наличия конфокальной микродиафрагмы, так как ее флуоресценция возникает строго в фокальной плоскости. Для того чтобы получить двухмерное пиксельное изображение, производится сканирование в фокальной плоскости образца 22.
Этот вид микроскопии основан на нелинейном оптическом эффекте, при котором с увеличением мощности света возрастает вероятность поглощения атомом флуорохрома одновременно двух и более фотонов, поэтому мультифотонное поглощение возможно только при очень больших плотностях излучения. В настоящее время для мультифотонной микроскопии используются лазеры с длительностью импульса до 10-13 с (100 фемтосекунд, обычно сапфировые лазеры). Импульсы следуют с большой частотой (100 МГц), и промежутки между импульсами значительно меньше, чем время позиционирования луча при сканировании. Средняя мощность излучения при этом может быть небольшой, такого же порядка, что и при однофотонном возбуждении.
Двухфотонный микроскоп позволяет наблюдать живые ткани на глубине более одного миллиметра и по сравнению с конфокальным микроскопом имеет большую проникающую способность и низкую степень фототоксичности вследствие значительно меньшего поглощения тканями и клетками излучения в ИК-обла-сти по сравнению с УФ.
Благодаря своим достоинствам, метод нашел очень широкое применение для изучения микроструктур в биологических объектах. В настоящее время с помощью МФМ получают изображения структуры отдельных клеток и изучают их динамику в реальном времени. Кроме того, метод обладает большими возможностями для трехмерной визуализации субклеточных структур и их изменений с высоким пространственным и временным разрешением — так называемая 4Э-микроскопия.
В последнее время двухфотонная микроскопия используется для визуализации клеток в сочетании с наночастицами с локализованным плазмонным резонансом 23,24. Комбинация двухфотонной люминесценции с конфокальной микроскопией дает уникальную возможность наблюдать плазмонный резонанс метки на поверхности и внутри клетки. Было показано 25, что обычные функционализиро-ванныенаночастицы могут быть визуализированы на поверхности или внутри раковых клеток. Более того, установлено, что интенсивность резонанса одиночных наностержня 26 и нанооболочки 27 достаточна для использования этих меток как контрастных агентов для визуализации молекулярных маркеров рака и исследования внутриклеточных процессов.
В ряде случаев для понимания структурной и функциональной организации биологических объектов, органов и тканей требуется
визуализация их клеточной структуры в масштабах, сопоставимых с размерами этих объектов и органов. Оптические методы, позволяющие производить подобную визуализацию крупных оптически прозрачных образцов на значительную глубину с клеточным разрешением, стали появляться только в последние годы. Разработка этих методов ведется по двум основным направлениям: оптическая проекционная томография (ОПТ) 28 и оптическая флуоресцентная просветная микроскопия (ОФПМ, lightsheetfluorescencemicroscopy) 29. ОФПМ в текущий момент является наиболее перспективным из этих двух направлений и активно развивается в нескольких модификациях: микроскопия с освещением в избирательной плоскости (selective plane illumination microscopy) 30, ультрамикроскопия, микроскопия с планарным освещением в фокальной плоскости (object ivecoupledplanar illumination microscopy) 31 и др.
Принципиальным отличием ОФПМот конфокальной микроскопии является то, что возбуждение флуоресценции происходит лишь в узком слое тканей за счет использования специальных систем подсветки, а регистрация флуоресценции — в направлении, перпендикулярном плоскости подсветки. Это позволяет избежать попадания прямого лазерного излучения в приемный тракт системы и паразитного фона засветки вне области исследования. Кроме того, снижается выгорание флуорофоров, а также уменьшается фототоксичное влияние излучения на образец. Даже при использовании объективов с небольшой числовой апертурой и большим рабочим расстоянием в таких методах достигается высокое разрешение на больших глубинах в оптически прозрачных образцах.
Гиперспектральные методы визуализации. Перспективным направлением развития методов оптического биоимиджинга является внедрение технологий, позволяющих получать спектроскопическую информацию об объекте с пространственным разрешением. В зависимости от круга решаемых задач для реализации спектрального детектирования сигнала используются различные аппаратурные и методические подходы.
Методы, основанные на мультизональной (мультиспектральной) съемке, обеспечивают регистрацию квазимонохроматических изображений объектов в небольшом числе относительно широких спектральных полос (типично 10—40 нм в спектральном диапазоне 400— 1000 нм). Аппаратурная реализация обычно основывается на использовании набора сменя-
емых полосовых светофильтров либо перестраиваемых фильтров (акустооптических, двулучепреломляющих, клиновых интерференционных и др.). Гиперспектральные методы позволяют получить для каждой малой области (точки) изображения объекта оптический спектр со спектральным разрешением порядка единиц, а иногда и долей нанометров — существенно более высоким, чем обычно достижимое в мультиспектральной съемке. Наиболее распространенным способом получения гиперспектрального изображения (трехмерной матрицы, содержащей зависимость интенсивности света от пространственных и спектральной координат) является последовательная регистрация с использованием дисперсионных полихроматоров спектров малых фрагментов изображения объекта, выделенных входной апертурой, чаще всего — входной щелью спектрометра. Полученный набор спектральных изображений посредством математической обработки преобразуется в гиперспектральное изображение 32.
Применение спектрального детектирования сигнала в микроскопии открыло возможность идентификации флуорохромов и анализа их состояния по характеристичным особенностям исследуемых спектров. Метод получил название микроспектрофлуориметрии. Описания конструкций первых лабораторных мик-роспектрофлуориметров появляются в начале 60-ых гг. прошлого столетия 33,34. Совершенствование микроспектрофлуориметров шло по пути уменьшения времени записи спектра за счет использования многоканальных детекторов 35 и разработки систем для одновременного измерения серии спектров вдоль выбранной линии образца. Компьютерное управление сканированием образца и записью спектров позволило перейти к измерению и анализу больших массивов спектров. Объединение разработок в области микроспектрофлуориметрии и традиционной лазерной сканирующей конфокальной мокроскопии открыло озможность создания спектральных лазерных сканирующих конфокальных микроскопов, в которых помимо традиционной системы регистрации сигнала на основе оптических фильтров и фото-электронного умножителя имеется спект-
32
ральный модуль 32.
Разложение сигнала в спектр может осуществлять при помощи дифракционной решетки либо призмы, после чего фокусируется на детекторе, в качестве которого используются многоканальные схемы на основе микрофотоэлектронных умножителей или ССЭ-матрица (спектры
от различных точек образца проецируются на различные ряды фоточувствительных элементов двумерного детектора на основе прибора с зарядовым сопряжением). Использование охлаждаемогоССЭ-детектора существенно улучшает отношение сигнал/шум, облегчая регистрацию и анализ слабых сигналов.
Другие возможные способы достижения спектрального разрешения при измерении флуоресцентных изображений под микроскопом включают в себя применение акустоопти-ческого перестраиваемого фильтра 36, жидкокристаллического перестраиваемого фильтра 37 или Фурье-интерферометра 38. Акустооптичес-кий фильтр является твердотельным настраиваемым фильтром без подвижных частей. Изменение частоты пропускания осуществляется пьезоэлектрическим преобразователем, генерирующим акустические волны в двоякопрелом-ляющем кристалле, вследствие чего происходит периодическое изменение коэффициента преломления кристалла. В каждый момент времени через фильтр проходит узкий диапазон излучения. Смена диапазона пропускания осуществляется значительно быстрее, чем в альтернативных методах, и составляет порядка 50 мс 39.
Спектральная лазерная сканирующая микроскопия применима для решения широкого круга задач биофизики, молекулярной и клеточной биологии, включая изучение механизмов клеточного транспорта, внутриклеточной локализации и механизмов действия биологических молекул. Метод позволяет идентифицировать и разделять в исследуемых образцах перекрывающиеся сигналы нескольких флуоресцирующих соединений, а также учитывать вклад эндогенной флуоресценции, что существенно повышает чувствительность, надежность и точность анализа по сравнению с традиционной конфокальной микроскопией. Анализ полных спектров флуоресценции дает возможность изучать молекулярные взаимодействия флуоресцирующих соединений в живых клетках с трехмерным субмикронным пространственным разрешением, проводить их количественное измерение 40.
Анализ молекулярных маркеров в раковых клетках посредством гиперспектрального микроскопического имиджинга обеспечивает возможность идентификации молекулярных изменений в патологических клетках, идентификации соэкспрессии применяющихся маркеров, а также возможность неинвазивной диаг-
41
ностики и терапии 41.
В качестве эффективных маркеров гиперэкспрессии рецепторов раковых клеток могут
выступать биоконъюгатынаночастиц золота с опухолеспецифичными антителами, визуализацию которых осуществляют эпифлуоресцен-тной микроскопиейв сочетании с гиперспектральным детектированием 42.
Рассматривая гиперспектральные методы оптического биоимиджинга, стоит отметить создание и перспективность применения в данной области исследований нового способа генерации оптического излучения посредством сверхкоротких импульсных лазеров — так называемые «белые лазеры». Излучение данного источника характеризуется регулируемой временной длительностью и высокой спектральной яркостью. Белый свет с такими свойствами ввиду протяженности и непрерывности его спектра часто называют излучением суперконтинуума. Спектр излучения суперконтинуума может перекрывать весь видимый диапазон и часть ближнего инфракрасного диапазона. По своей спектрально-угловой яркости и интенсивности генерируемый лазерами белый свет в миллионы раз превосходит естественный белый свет, поступающий на землю от Сонца. Генерация суперконтинуума основана на нелинейных законах оптики, в частности, на зависимости показателя преломления от интенсивности излучения при распространении высокоинтенсивных фемтосекундных лазерных импульсов в различных средах. Новые волоконные структуры и материалы с большими оптическими нелинейностями позволяют реализовать методы генерации широкополосного излучения с регулируемыми спектральными, временными и фазовыми характеристиками 43,44.
Таким образом визуализация in vivo внутренней структуры тканей, в частности, с патологическими образованиями, осуществляется интенсивно развивающимися методами оптической когерентной томографии и диффузионной флуоресцентной томографии, а также их различными модификациями, обеспечивающими исследование биологических объектов на уровне групп/слоев клетов. Визуализация in vitro проводится в основном сканирующими микроскопическими методами, позволяя наблюдать свойства объектов на клеточном и субклеточном уровнях.
Для повышения контраста в методах оптического биоимиджинга используют различные контрастирующие агенты — флюорофоры, квантовые точки, наночастицы с плазмонным резонансом. Применение квантовых точек ограничено главным образом их заметной токсичностью. Среди флюорофоров применяются как низкомолекулярные органические краси-
тели, так и различные флюоресцирующие белки. Наночастицы металлов, такие как золото и серебро, могут обеспечивать колориметрический контраст за счет поверхностного плазмон-ного резонанса. Сечение поглощения наночас-тиц золота на несколько порядков выше, чем у органических красителей. Кроме того, они не подвергаются фотодекомпозиции, не токсичны
Литература
1. Leblond F. et al. //Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology.- 2010.- V.98, №1.- P.77.
2. Cheong W. F., Prahl S. A., Welch A. J.// Quantum Electronics, IEEE Journal of.- 1990.-V.26, №12.- P. 2166.
3. Eils R., Athale C. //The Journal of cell biology.- 2003.- V.161, №3.- P.477.
4. Kherlopian A. R. et al. //BMC systems biology.- 2008.- V.2, №1.- P.74.
5. Park S. J. et al. A prototype of very highresolution small animal PET scanner using silicon pad detectors //Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment.- 2007.- V.570, №3.-P. 543.
6. Holly T. A. et al. //Journal of nuclear cardiology.- 2010.- V.17, №5.- P.941.
7. Kalender W. A. //Physics in medicine and biology.- 2006.- V.51, №13.- P.29.
8. Kriegeskorte N., Bandettini P. //Neuroimage.-2007.- V.38, №4.- P.649.
9. Pawley J. B. (ed.). Handbook of biological confocal microscopy.- Springerverlag Us, 2006.
10. Norihiko Ikeda M. D., Lam S. Optical Coherence Tomography //Interventions in Pulmonary Medicine. - Springer New York, 2013. - P.231.
11. Iftimia N., Brugge W. R., Hammer D. X. (ed.). Advances in Optical Imaging for Clinical Medicine.- Wiley, 2011.- V.6.
12. Luker G. D., Luker K. E. //Journal of Nuclear Medicine.- 2008.- V.49, №1.- P.1.
13. Torricelli A. et al. //Optics express.- 2003.-V.11, №8.- P.853.
14. Pansare V. J. et al. //Chemistry of Materials.-2012.- V.24, №5.- P. 812.
15. Balas C. //Measurement science and technology.- 2009.- V.20, №10.- P.104020.
16. Swedlund A. C. Live cell imaging: a laboratory manual.- New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2005.- P. 239.
17. Furuno T., Nakanishi M. //Biological and Pharmaceutical Bulletin.- 2005.- V.28, №9.-P. 1551.
18. Transidico P. et al. //Microscopy research and technique.- 2004.- V.64, №2.- P.89.
19. Becker B. E., Gard D. L. //Xenopus Protocols.-Humana Press, 2006.- P.69.
20. Izatt J. A. et al. //Optics letters.- 1994.-V.19, №8.- P.590.
для организма, обладают высокой стабильностью. Примение контрастирующих агентов для визуализации клеток злокачественных опухолей основывается на иммуно-химических реакциях и требует создания опухолеспецифичных конъюгатов с антителами к рецепторам раковых клеток.
References
. Leblond F. et al. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 2010. V.98, no.l. P.77.
2. Cheong W. F., Prahl S. A., Welch A. J. Quantum Electronics, IEEE Journal of. 1990. V.26, no.12. P. 2166.
3. Eils R., Athale C. The Journal of cell biology. 2003. V.161, no.3. P.477.
4. Kherlopian A. R. et al. BMC systems biology.
2008. V.2, no.1. P.74.
5. Park S. J. et al. A prototype of very highresolution small animal PET scanner using silicon pad detectors. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 2007. V.570, no.3. P. 543.
6. Holly T. A. et al. Journal of nuclear cardiology. 2010. V.17, no.5. P.941.
7. Kalender W. A. Physics in medicine and biology. 2006. V.51, no.13. P.29.
8. Kriegeskorte N., Bandettini P. Neuroimage. 2007. V.38, no.4. P.649.
9. Pawley J. B. (ed.). Handbook of biological confocal microscopy. Springerverlag Us, 2006.
10. Norihiko Ikeda M. D., Lam S. Optical Coherence Tomography. Interventions in Pulmonary Medicine. Springer New York, 2013. P.231.
11. Iftimia N., Brugge W. R., Hammer D. X. (ed.). Advances in Optical Imaging for Clinical Medicine.- Wiley, 2011.- T.6.
12. Luker G. D., Luker K. E. Journal of Nuclear Medicine. 2008. V.49, no.1. P.1.
13. Torricelli A. et al. Optics express.2003. V.11, №8.- C.853.
14. Pansare V. J. et al. Chemistry of Materials. 2012. V.24, no.5. P.812.
15. Balas C. Measurement science and technology.
2009. V.20, no.10. P.104020.
16. Swedlund A. C. Live cell imaging: a laboratory manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2005. P. 239.
17. Furuno T., Nakanishi M. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 2005. V.28, no.9. P. 1551.
18. Transidico P. et al. Microscopy research and technique. 2004. V.64, no.2. P.89.
19. Becker B. E., Gard D. L. Xenopus Protocols. Humana Press, 2006. P.69.
20. Izatt J. A. et al. Optics letters.1994. V.19, no.8. P.590.
21. Beaurepaire E. et al. //Optics letters.— 1998.— V.23, №4.- P.244.
22. Denk W., Strickler J. H., Webb W. W. // Science.- 1990.- V.248, №4951.- P.73.
23. Durr N. J. et al. //Nano letters.- 2007.- V.7, №4.- P.941.
24. Khlebtsov N. G.//Quantum Electronics.-2008.- V.38, №6.- P.504.
25. Sokolov K. et al. //Cancer Research.- 2003.-V.63, №9.- P.1999.
26. Wang Z., Ma L. //Coordination Chemistry Reviews.- 2009.- V.253, №11.- P.1607.
27. Park J. et al. //Optics Express.- 2008.- V.16, №3.- P.1590.
28. Sharpe J. //Annu. Rev. Biomed.Eng.- 2004.-V.6.- С.209.
29. Santi P. A.//Journal of Histochemistry& Cytochemistry.- 2011.- V.59, №2.- P.129.
30. Huisken J. et al. Selective Plane Illumination Microscopy //Handbook Of Biological Confocal Microscopy.- Springer US, 2006.- P.672.
31. Turaga D., Holy T. E. //Optics letters.- 2008.-V.33, №20.- P.2302.
32. Феофанов А. В. //Успехи биологической химии.- 2007.- V.47.- С.371.
33. Агроскин Л. С., Королев Н. В. //Биофизика.-1961.- Т.6, №1.- С.478.
34. Olson R. A. // Review of Scientific Instruments.- 1960.- V.31, №8.- P.844.
35. Blais J. et al.//Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology.- 1995.- V.27, №3.-P.225.
36. Hiraoka Y., Shimi T., Haraguchi T.//Cell structure and function.- 2002.- V.27, №5.-P.367.
37. Levenson R. M., Mansfield J. R. //Cytometry part A.- 2006.- V.69, №8.- P.748.
38. Rothmann C. Bar-Am I. and Malik Z. //Histol. Histopathol.- V.13.- P.921.
39. Vo-Dinh T. //Engineering in Medicine and Biology Magazine, IEEE.- 2004.- V.23, №5.-P.40.
40. Schultz R. A. et al. //Cytometry. - 2001.- V.43, №4.- P.239.
41. Uhr J. W. et al.//Translational Research.-2012.- V.159, №5.- P.366.
42. Crow M. J., Wax A. //Biomedical Optics.-Optical Society of America, 2008.
43. Ruehl A. et al. //Physical Review A.- 2011.-V.84, №1.- P.011806.
44. Selb J. et al. //Biomedical Optics.- Optical Society of America, 2012.
21. Beaurepaire E. et al. Optics letters. 1998. V.23, no.4. P.244.
22. Denk W., Strickler J. H., Webb W. W. Science. 1990. V.248, no.4951. P.73.
23. Durr N. J. et al. Nano letters. 2007. V.7, no.4. P. 941.
24. Khlebtsov N. G. Quantum Electronics. 2008. V.38, no.6. P.504.
25. Sokolov K. et al. Cancer Research. 2003. V.63, no.9. P.1999.
26. Wang Z., Ma L. Coordination Chemistry Reviews. 2009. V.253, no.11. P.1607.
27. Park J. et al. Optics Express. 2008. V.16, no.3. P.1590.
28. Sharpe J. Annu. Rev. Biomed.Eng. 2004. V.6. P.209.
29. Santi P. A. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 2011. V.59, no.2. P.129.
30. Huisken J. et al. Selective Plane Illumination Microscopy. Handbook Of Biological Confocal Microscopy.— Springer US, 2006.— P.672.
31. Turaga D., Holy T. E. Optics letters. 2008. V.33, no.20. P.2302.
32. Feofanov A. V. Uspekhi biologicheskoi khimii. 2007. V.47. P.371.
33. Agroskin L. S., Korolev N. V. Biofizika. 1961. V.6, no.1. P.478.
34. Olson R. A. Review of Scientific Instruments. 1960. V.31, no.8. P.844.
35. Blais J. et al. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 1995. V.27, no.3. P.225.
36. Hiraoka Y., Shimi T., Haraguchi T. Cell structure and function. 2002. V.27, №5. P.367.
37. Levenson R. M., Mansfield J. R. Cytometry part A. 2006. V.69, no.8. P.748.
38. Rothmann C. Bar-Am I. and Malik Z. Histol. Histopathol. 1998. V.13. P.921.
39. Vo-Dinh T. Engineering in Medicine and Biology Magazine, IEEE. 2004. V.23, no.5. P.40.
40. Schultz R. A. et al. Cytometry. 2001. V.43, no.4. P.239.
41. Uhr J. W. et al. Translational Research. 2012. V.159, no.5. P.366.
42. Crow M. J., Wax A. Biomedical Optics. Optical Society of America, 2008.
43. Ruehl A. et al. Physical Review A. 2011. V.84, no.1. P.011806.
44. Selb J. et al. Biomedical Optics.— Optical Society of America, 2012.
