CC BY
28
£Март2008г.
МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ БИФИДОБАКТЕРИЙ ПО ОТНОШЕНИЮ К МИКОБАКТЕРИЯМ И НОКАРДИОФОРМНЫМ АКТИНОМИЦЕТАМ
'Воробьева 3. Г.,2 Кульчицкая М. А,1Слинина К. //., вазовская А. Л.
Научно-исследовательский ветеринарный институт Нечерноземной зоны РФ; 2Филиал ФГУП НПО «Микроген» ИмБио, Нижний Новгород
С использованием двух новых методов выявлена высокая антагонистическая активность штаммов бифидобактерий по отношению к патогенным и условно-патогенным I микобактериям и родококкам. Ключевые слова: бифидобактерии, микобактерии, родококки, антагонизм
В последние годы во всем мире широкое применение в медицинской и ветеринарной практике находят пробиотики, являющиеся экологически безопасными препаратами для профилактики и лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта, дыхательных путей, а так же урогенитального тракта людей и животных [10, 2]. Использование пробиотиков оказывает многообразное воздействие на микрофлору полостей млекопитающих, на иммунную, гормональную и ферментативную системы [4, 9, 10].
В ветеринарии и медицине назрела необходимость изучения биологических свойств различных пробиотиков по отношению к микобактериям и нокардиоформ-ным актиномицетам в связи с тем, что молодняк скота обычно заражается туберкулезом и родококкозом алиментарным путем в первые дни жизни [11]. Нельзя исключить, что и у детей первых лет жизни алиментарный путь заражения играет не последнюю роль.
Одним из эффективных пробиотиков, применяемых в ветеринарии и медицине, являются препараты на основе бифидобактерий.
Целью настоящей работы является разработка методов изучения антагонистической активности штаммов препарата бифидобактерина по отношению к микобактериям и родококкам.
Материалы и методы
В качестве пробиотика выбран препарат «Бифидобактерии», выпускаемый фирмой «ИмБио» (Нижний Новгород). В состав препарата входит производственный штамм — В1Ас1оЬас1:епит ЫАс!ит 1. Исследование
проводили, используя лиофилизированную массу живых бифидобактерий. Согласно технологическому регламенту бифидобактерии были лиофилизированы непосредственно со средой выращивания. В качестве индикаторных штаммов использованы референс — штаммы M.tuberculosis (шт. Academia), М.avium (ГИСК), М.bovis (шт. Vallee и Ravenal), а также свежевыделенные от крупного рогатого скота штаммы М.avium (№ 1), М.bovis (№ 2, № 3), M.vaccae (N2 296) и от свиней штаммы R. equi (№ 6, № 12, № 13) [5].
Для приготовления среды для культивирования мико-бактерий (АГЖ), в химически чистую стерильную колбу емкостью 200 мл наливали 30,0 мл дистиллированной воды, прогревали на водяной бане до 75-85 °С. В воде растворяли последовательно: лимонную кислоту — 0,2 г, L-аспарагин — 0,4 г, сернокислый магний — 0,05 г, двуза-мещенный фосфорнокислый калий — 0,05 г, лимоннокислое аммиачное железо — 0,005 г, пируват натрия — 0,05 г, глицерин — 4,0 г, гумивит -10,0 мл [3] и агар — 3,0 г. Каждый компонент добавляли после полного растворения предыдущего. После внесения всех компонентов, 10%-м раствором NaOH устанавливали pH (7,1-7,2), стерильной дистиллированной водой общий объем доводили до 90,0 мл. Раствор автоклавировали в течение 30 мин при 1 атм. Свежие куриные яйца хорошо промывали в проточной воде, протирали 96° этиловым спиртом, разбивали в стерильных условиях и отделяли белок от желтка. В стерильной колбе смешивали желток и дистиллированную воду в соотношении 1:1 и 10,0 мл полученного раствора добавляли в расплавленную агаровую среду и перемешивали.
В данной работе использовали два метода изучения антагонистической активности.
ПРЕПАРАТЫ
Таблица 1
Антагонистическая активность штаммов бифидобактерина по отношению к патогенным микобактериям и родококкам. Первый метод
Количество про-биотика, % от общего объема среды
2,0 4,0 8,0 16,0 32,0
М. avium (ГИСК)
1 10 10 10 10
Индекс блокирования роста индикаторного штамма
М. bovis (Vallee) М. bovis (Ravenal)
2 1 2 10
М. tuberculosis (Academia)
1
5 10 10 10
4 10 10
10 10 10
R.equi № 6
1 2 4
4
5
Таблица 2
Антагонистическая активность штаммов бифидобак-терий по отношению к патогенным и условно патогенным микобактериям и родококкам. Второй метод
№ п/п Индикаторные штаммы ИБР
1 М.avium (ГИСК) 10
2 М.tuberculosis (Academia) 10
3 М.bovis (Vallee) 10
4 М. bovis (Ravenal) 10
5 M.avium № 4 10
6 M.vaccae № 296 10
7 M.bovis № 2 10
8 M.bovis № 3 10
9 Rhodococcus equi № 6 9
10 Rhodococcus equi № 12 6
11 Rhodococcus equi № 13 7
В первом методе ампулу с сухим пробиотиком вскрывали и регидратировали 0,9%-м раствором натрия хлорида израсчета1 мл на одну дозу препарата (1 доза 1-5x107 КОЕ в 1 мл среды). В стерильную пробирку с расплавленной и охлажденной до 70 °С среды АПЖ (3 мл) инокулировапи пробиотик в количестве 2-32% от общего объема среды. Затем среду скашивали и осуществляли посев индикаторных штаммов микобактерий и родококков в количестве 10 мкл суспензии, обеспечивающей рост 20-60 КОЕ в контроле, с последующим культивированием при температурном (37 °С) и временном (до 30 сут.) оптимуме. Контроль — скошенная среда АГЖ с добавлением среды культивирования и высушивания пробиотического штамма в количестве 2-32% от общего объема.
Проводили оценку антагонистической активности бифидобактерина по отношению к микобактериям и родококкам в зависимости от количества пробиотика. Вычисляли индекс блокирования роста (ИБР) — отношение количества колоний индикаторного штамма, выросших на контрольной среде, к количеству колоний индикаторного штамма, выросших на среде после внесения в нее пробиотика. Максимальное значение ИБР ограничивали цифрой 10.
Второй метод осуществляли следующим образом: 10 мкл суспензии, содержащей 1-5x104 КОЕ бифидо-
бактерий, вносили в 2,5 мл жидкой среды Блаурокка и культивировали 96 ч при 37 °С. Выросшие колонии тестируемого штамма отбирали и смешивали с 2,5 мл расплавленного в физиологическом растворе и остуженного до 70 °С агара (5%), после скашивания наслаивали среду АГЖ, на поверхность которой наносили 10 мкл суспензии индикаторного штамма, обеспечивающий рост 20-60 КОЕ в контроле.
Контроль — двухслойная среда (Блаурокк с агаром и средой АГЖ), засеянная индикаторным штаммом. ИБР вычисляли так же как в первом методе.
Результаты и обсуждение_
Из табл. 1 следует, что добавление 16-32% пробиотика (содержание, соответственно, 1-5x103 и 1-5x105 КОЕ в 1 мл суспензии) оказывает ингибирующее действие на микобактерии с индексом блокирования роста равном 10. Родококки оказались более устойчивыми к пробиотику.
Использование второго метода (табл. 2) показало, что не только референс-штаммы, но и свежевыделенные штаммы бычьего и птичьего видов микобактерий, а также штамм условно-патогенного вида М^ассае (N9 296) обладают высокой чувствительностью к бифидобакте-риям, так как число колоний в посевах снижается в 10 и более раз. Несколько меньшая чувствительность к би-фидобактериям выявлена у штаммов родоккоков.
Профилактика туберкулеза, микобактериозов и но-кардиоформных актиномикозов (родококкоз, нокарди-оз) включает такие мероприятия, как и забой животных, положительно реагирующих на туберкулин, и проведение дезинфекции. Вакцинация и профилактическое лечение противотуберкулезными препаратами, давшими хороший эффект в детских коллективах, у сельскохозяйственных животных себя на практике не оправдали [1]. По-видимому, следует разрабатывать и другие дополнительные способы профилактики вышеуказанных заболеваний. Известно, что повысить устойчивость к различным инфекционным заболеваниям помогает применение пробиотиков, пребиотиков или комплексных препаратов [8, 9, 10]. Однако кроме стимулирующего влияния на иммунитет необходимо также локальное антагонистическое воздействие на возбудитель на месте его внедрения.
Для изучения антагонистических свойств штаммов пробиотиков против микобактерий нами разработаны
С
^Март 2008 г.
специальные методы исследования, включая питательные среды, что позволило преодолеть трудности определения антагонистической активности, заключающиеся в особенностях биологии пробиотиков и микобактерий: медленном росте патогенных микобактерий, потребности в различных питательных веществах, различном типе дыхания и т.д. Ранее нами была показана антагонистическая активность пробиотиков на основе кишечной палочки, энтеробактерий и лактобак-терий против микобактерий туберкулеза и ряда условно-патогенных микобактерий [6, 7]. Все разработанные нами ранее методы определения антагонистической активности можно объединить в три основные группы: использование стерильных фильтров, полученных либо при выращивании одних пробиотиков, либо при совместном выращивании микобактерий и пробиотиков в жидкой среде, а также использование двухслойных сред особого состава, удовлетворяющих ростовым потребностям пробиотиков и микобактерий. Однако эти способы оказались непригодными при работе с бифи-добактериями в силу их анаэробных свойств. Поэтому нами разработаны два новых метода определения антагонистической активности штаммов бифидобактерий по отношению к микобактериям и родококкам. В обоих методах показана высокая антагонистическая активность штаммов бифидобактерина в отношении как ре-ференс, так и свежевыделенных штаммов микобактерий и несколько меньшая активность в отношении штаммов родококков.
Полученные результаты предполагают возможность дополнительной профилактики с помощью пробиотиков туберкулеза и родококкоза у молодняка сельскохозяй-
ственных животных при включении этого мероприятия в установленную законодательством систему противотуберкулезных профилактических мероприятий.
Литература
1. Аксенова В. А., Леви Д. [".//Биопрепараты. — 2007. - № 1. — С. 19-22.
2. Воробьева 3. Г., Лазовская А. Л., Слинина К. Н.// В сб.: Новые технологии в повышении сохранности животных. — Н. Новгород. — 2007. — С. 107-115.
3. Воробьева 3. Г., Лазовская А. Л., Слинина К. Н.// В сб.: Профилактика, диагностика и лечение болезней общих для людей и животных. — Ульяновск. — 2006. — С.42-46.
4. Зорина В. В., Николаева Т. Н., Бондаренко В.М.// Микробиология. — 2004. — № 6. — С. 57-60.
5. Лазовская А. Л., Слинина К. Н., Воробьева 3. Г., Ким Р. Е.//Доклады РАСХН. — 2004. — № 2. — С. 38-41.
6. Лазовская А. Л., Воробьева 3. Г., Слинина К. Н., Кульчицкая М. А.//Проблемы туберкулеза и болезни легких. — 2007. — № 7. — С. 25-27.
7. Лазовская А. Л., Воробьева 3. Г., Слинина К. Н. и др.//В сб.: Новые технологии в повышении сохранности с.-х. животных. — 2007. — С. 124-129.
8. Николаева! Н., Бондаренко В. М.//Ж. Микробиология. — 2004. — № 2. — С. 60-64.
9. Панин А. Н., Малик Н. И.//Ветеринария. — 2006. — №7.-С. 7-11.
10. Стегний Б. Г., Гужвинская С. А.//Ветеринария. — 2005.— №11. —С. 10-11.
11. Сочнев В. В., Молев А. И.//Ветеринарная патология. — 2007. — № 2. — С. 22-24.
