CC BY
14
УДК 615.2/.3.032.
Сахаров Д.А., Аверина Ю.М., Курбатов А.Ю.
МЕТОДИКИ АНАЛИЗА СОСТОЯНИЯ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР ГЭБ
Сахаров Дмитрий Андреевич - к.б.н., доцент кафедры химии высоких энергий и радиоэкологии;
Аверина Юлия Михайловна - к.т.н., доцент каф. ИМиЗК, e-mail: averinaj m@mail. ru;
Курбатов Андрей Юрьевич - к.т.н., ассистент кафедры инновационных материалов и защиты от коррозии
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева
125190, Москва, Миусская пл., 9
В данной работе были разработаны методики анализа состояния клеточных культур ГЭБ. Были использованы методы ПЦР и микроскопии для исследования характеристик клеточных культур, входящих в коллекцию. По результатам ПЦР и иммунофлуоресцентного анализа, клетки, выбранные для формирования микрофлюидной клеточной модели ГЭБ, обладают ярко выраженной экспрессией всех характерных маркеров.
Ключевые слова: клеточная модель гемато-энцефалического барьера человека, микрофизиологическая модель, гэб-на-чипе, транспорт ксенобиотиков
METHODS OF ANALYSIS OF THE STATE OF CEB CEBS
Sakharov D.A., Averina Yu.M., Kurbatov A.Yu. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia.
In this work, methods for analyzing the state of BBB cell cultures were developed. PCR and microscopy methods were used to study the characteristics of the cell cultures included in the collection. According to the results of PCR and immunofluorescence analysis, the cells selected for the formation of the microfluidic BBB cell model have a pronounced expression of all characteristic markers.
Keywords: cell model of the human blood-brain barrier, microphysiological model, heb-on-chip, xenobiotic transport
Гемато-энцефалический барьер (ГЭБ) служит в качестве физического, функционального, метаболического и иммунологического барьера между кровью и тканями головного мозга. Такой барьер регулирует пассивный и активный транспорт веществ из капилляров в мозг и обратно. Относительно недавно был разработан новый класс in vitro моделей: органы-на-чипе, которые совмещают в себе преимущества как in vivo, так и in vitro моделей. Эти так называемые чипы - это микрофлюидные устройства, в которых ткани культивируются в таких спроектированных условиях, которые наилучшим образом отражают in vivo микроокружение этих тканей. Такое физиологически релевантное микроокружение может быть получено с помощью микрофлюидного устройства, если создать в нем геометрические, механические и биохимические особенности in vivo микроокружения. С помощью ГЭБ-на-чипе можно анализировать наличие специфических маркеров (например, белков адгезии и плотных контактов) для получения информации о структуре сформированного ГЭБ, а также изучать транспорт ксенобиотиков через ГЭБ.
Модели ГЭБ-на-чипе могут быть использованы для изучения сложных биологических процессов, совмещать в себе преимущества in vitro и in vivo моделей, обладать высокой предсказательной силой, и быть ценным исследовательским инструментом в дополнение к классическим in vitro и in vivo методам.
В данной работе были разработаны методики анализа состояния клеточных культур ГЭБ. Были использованы методы ПЦР и микроскопии для исследования характеристик клеточных культур, входящих в коллекцию (таблица 1, рисунок 1). По результатам ПЦР и иммунофлуоресцентного анализа, клетки, выбранные для формирования микрофлюидной клеточной модели ГЭБ, обладают ярко выраженной экспрессией всех характерных маркеров: клетки эндотелия микрососудов головного мозга iPS-EC, дифференцированные из плюрипотентных стволовых клеток IMR90-4, обладают ярко выраженной экспрессией vFW, CD31, ZO1, GLUT1, BCRP, MDR1; иммортализованные перициты сосудов головного мозга imHBVP - ярко выраженной экспрессией aSMA, PDGFRP; иммортализованные астроциты fHA-hTERT - ярко выраженной экспрессией GFAP, S100P, A2B5, O4.
Таблица 1. Иммунофлуоресцентный анализ клеток в составе in vitro модели ГЭБ
"Эндотелиальная поверхность" мембраны с клетками эндотелия (201/плотные контакты -красный) и перицитами (о^МА - зеленый). Ядра окрашены БАР! - синий. Шкала - 20 мкм
"Паренхимная поверхность" мембраны с астроцитами (GFAP - красный; ядра - DAPI, синий). Шкала - 20 мкм
ОД 1Д Зд 7д
Рисунок 1. Анализ экспрессии генов характерных маркеров клеток микроваскулярного эндотелия головного мозга в клетках в составе клеточного барьера при их сокультивировании на мембранах с нанесенным ВКМ.
Анализ экспрессии проводили через 1, 3 и 7 дней после формирования клеточного барьера. В качестве контроля, за 1 принимали экспрессию маркеров в клетках в составе барьера через 4 часа после внесения в мембранные вставки астроцитов. Все эксперименты проводили в трех независимых повторах. Результаты представлены в виде среднего ± стандартное отклонение.
Работа выполнена в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития
научно-технологического комплекса России на 20142020 годы» по теме: «Клеточная модель гемато-энцефалического барьера человека в микрофлюидном устройстве». Государственный контракт от «18» октября 2017 г. № 14.583.21.0066
Список литературных источников:
[1] B. Engelhardt and L. Sorokin, "The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction," Semin. Immunopathol., vol. 31, no. 4, pp. 497-511, Nov. 2009.
[2] R. N. Carter, S. M. Casillo, A. R. Mazzocchi, J.-P. S. DesOrmeaux, J. A. Roussie, and T. R. Gaborski, "Ultrathin transparent membranes for cellular barrier and co-culture models," Biofabrication, vol. 9, no. 1, p. 015019, Feb. 2017.
[3] C. Jud et al., "Ultrathin Ceramic Membranes as Scaffolds for Functional Cell Coculture Models on a Biomimetic Scale.," Biores. Open Access, vol. 4, no. 1, pp. 457-68, Dec. 2015.
