CC BY
44
© Попова Н.М., 2011 УДК 612.338
НОВЫЕ МЕТОДЫ
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Р-ГИДРОКСИСИМВАСТАТИНА В ПЛАЗМЕ КРОВИ
Н.М. Попова
ГОУ ВПО «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения и социального развития РФ, г. Рязань
Статья посвящена разработке оригинальной методики количественного определения Р-гидроксисимвастатина в плазме крови кроликов методом ВЭЖХ. В работе использована ВЭЖХ система серии «Стайер» со спектрофотометрическим детектором. Разделение проводилось при помощи обращено-фазной хроматографической колонки «Beckman Coulter». Экстрагирование Р-гидроксисимвастатина из плазмы крови осуществляли методом жидкостной экстракции.
Ключевые слова: ВЭЖХ, fi-гидроксисимвастатин.
Симвастатин является одним из наиболее эффективных лекарственных средств для коррекции дислипидемии. [2] Появление множества дженериков дает возможность сделать терапию симваста-тином более доступной для пациентов. Действие препарата связано с обратимой блокадой 3-гидрокси-3-метилглютарил
коэнзим А (НМв-СоА) редуктазы - ключевого фермента синтеза холестерина. Симвастатин снижает уровень общего холестерина, липопротеинов низкой
плотности, аполипопротеина В и триглицеридов, а также умеренно повышает уровень липопротеинов высокой плотности. [1] Препарат подвергается интенсивному метаболизму при первичном прохождении через печень с образованием 5 метаболитов, из которых наиболее выраженной гиполипидемической активностью обладает р-гидроксисимвастатин. При этом концентрация самого симвастатина в общем кровотоке весьма низкая. [6] Биотрансформация симвастатина может существенно изменяться под влиянием лекарственных средств и при различных патологиях, изменяющих активность печеночных цитохромов Р-450. Для изучения фармакокинетики, а также исследова-
ния биоэквивалентности дженериков сим-вастатина определяют концентрацию препарата и его основного метаболита - Р-гидроксисимвастатина - в биологических жидкостях.
В настоящее время существует множество точных методов количественного определения лекарственных веществ. Электрохимические методы являются простыми в эксплуатации и относительно дешевыми, но при этом они обладают рядом недостатков, таких как невысокая стабильность электролита и непродолжительный службы электролитического элемента [4]. Самый избирательный и высокочувствительный метод количественного анализа - хроматомасс-спектрометрия, однако он требует дорогостоящего оборудования, поэтому мало доступен отечественным лабораториям. [3] При использовании метода газовой хроматографии имеются ограничения по термоустойчивости соединений, а пробоподготовка является весьма трудоемкой. [5] Применение высоко эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) дает возможность упростить обработку проб, существенно сократить общее время анализа, а использование современных обращенно-фазных
колонок позволяет добиться хорошего разделения компонентов. Наиболее распространенным способом детектирования веществ в ВЭЖХ является УФ-
спектрофотометрия. [3]
Материалы и методы
В работе использована ВЭЖХ система серии «Стайер» со спектрофотометрическим детектором UVV 104. Хроматограф оборудован петлевым дозатором «Reodyne 7125» с петлей ввода на 50 мкм. Ввод проб в петлю осуществлялся с помощью шприцов «Hamilton». Исследование проводилось с применением обра-щенно-фазной колонки «Beckman Coulter» 4,6*250 мм, зернением 5 мкм.
Как вспомогательное оборудование использовалась центрифуга «Elmi CM 6M», встряхиватель пробирок «Shaker S 3.01» (Elmi), встряхиватель лабораторный медицинский «Vortex» (Elmi), роторновакуумный испаритель «VV - Micro» (Heidolph).
В качестве стандарта ß-
гидроксисимвастатина использовался «Simvastatin Hydoxy Acid, Ammonium Salt» производства «United States Biological», имеющий сертификат качества. Рабочий раствор (100 мкг/мл) готовился на метаноле и хранился при 40С.
Для приготовления подвижной фазы и обработки проб применялись реактивы марки ВЭЖХ: ацетонитрил («Pancreac»), дихлорметан («Pancreac»), метанол («Sharlau»); марки ОСЧ: пропанол - 2 («Химмед»); марки ЧДА: кислота ортофосфорная («Химмед»), калий фосфорнокислый двузамещенный («Химмед»); 0,01 М фосфатный буфер pH=7,4 («Sigma»). Для растворения фосфатного буфера использовалась бидистиллированная вода.
В качестве биологического материала для подбора условий хроматографирования из ушной вены кроликов породы шиншилла отбирались образцы крови в объеме 5 мл. Для отделения плазмы пробы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут и хранили до анализа при температуре -290С.
Для сбора и обработки хроматографических данных применялся программно-аппаратный комплекс «Мультихром для Windows 9x & NT».
Результаты и их обсуждение
В результате серии экспериментов с использованием подвижной фазы различного состава и изменениями условий обработки проб для определения р-гидроксисимвастатина оптимальными стали приведенные ниже условия хроматографирования.
Анализ проводился при длине волны 238 нм и термостатировании колонки при 450С. Использовалась подвижная фаза с содержанием ацетонитрила и фосфатного буфера в соотношении 70:30, доведенная кислотой ортофосфорной концентрированной до pH=4,5. Перед использованием подвижная фаза фильтровалась через нейлоновый фильтр с диаметром пор 0.45 мкм и дегазировалась под вакуумом в течение 20 минут. Скорость потока подвижной фазы составляла 1 мл/мин.
Экстрагирование р-гидроксисимва-статина проводилось методом жидкостной экстракции. Для этого к 1 мл плазмы добавляли 500 мкл КН2РО4 и перемешивали на приборе «Vortex» 10 секунд, затем добавляли 4,5 мл дихлорметана и 0,5 мл пропанола-2 и помещали на 10 минут на встряхиватель пробирок. После центрифугирования в течение 20 минут при 3000 об/мин органический слой отбирали в колбы для упаривания, которые помещали в роторно-вакуумный испаритель. Сухой остаток растворяли в 150 мкл подвижной фазы, из них 100 мкл наносили на колонку хроматографа.
Количественное определение Р-гидроксисимвастатина проводилось методом абсолютной калибровки по высоте пиков. Для этого использовались калибровочные растворы с концентрациями препарата 100; 200; 500; 1000; 1250; 2500; 5000 нг/мл. Для приготовления калибровочных растворов к плазме крови интакт-ных кроликов добавляли стандартный раствор p-гидроксисимвастатина и пере-
мешивали на приборе «Vortex» в течение 10 секунд.
Разработанная методика обладала следующими характеристиками: время
удерживания р-гидроксисимвастатина
Калибровочный график (рис. 1) описывался линейный уравнением: у =
0,1268х - 5.197, где х - концентрация препарата, у - высота хроматографического пика. Величина коэффициента регрессии оказалась близка к 1 (0,9987). Точность и воспроизводимость метода были рассчитаны по результатам 5 параллельных измерений 7 концентраций препарата, и составили 3,9% и 89,4-113,64% соответственно.
Образцы полученных хроматограмм представлены на рисунках 2-4.
Выбор хроматографической колонки и длины волны производился на основе анализа литературных данных. В боль-
12±0,3 мин, предел его обнаружения 100 нг/мл. Коэффициент экстракции составил 82%. Калибровочная зависимость носила линейный характер в диапазоне концентраций от 100 до 5000 нг/мл.
шинстве методик, разработанных зарубежными авторами, использовались об-ращено-фазные колонки с привитой фазой С18 и длина волны 238 нм. [7 - 13] При ее изменении в ту или иную сторону чувствительность метода снижалась.
Для приготовления подвижной фазы были испробованы различные варианты с применением растворителей наиболее часто используемых в ВЭЖХ [5]:
- метанол и вода в соотношении 80:20; 90:10;
- ацетонитрил и вода в соотношении 80:20; 70:30; 60:40;
- метанол, ацетонитрил, вода в соотношении 60:20:20; 40:40:20.
Концентрация, нг/мл
Рис. 1. Калибровочный график определения бета-гидроксисимвастатина в плазме крови.
Рис. 2. Типичная хроматограмма стандартного раствора р-гидроксисимвастатина
с концентрацией 10 мкг/мл
Рис. 3. Типичная хроматограмма пробы интактной плазмы крови кролика
Рис. 4. Типичная хроматограмма пробы плазмы крови кролика при однократном введении симвастатина
Время удерживания р-
гидроксисимвастатина при использовании подвижных фаз, содержащих метанол, составляло более 25 мин. Видимо, это связано с их большой вязкостью, что затрудняет применение колонок, заполненных частицами сорбента размером 5 мкм[5], поэтому выбор элюента был оста-новилен на ацетонитриле. При использовании ацетонитрила с водой в соотношении 80:20 время удерживания р-гидроксисимвастатина совпадало со временем элюирования с колонки компонентов плазмы, а использование фазы с соотношением 60:40 привело к уменьшению чувствительности метода и увеличению времени удерживания более 20 мин даже при нарастании скорости потока. Для увеличения чувствительности pH подвижной фазы изменяли в диапазоне от 3.0 до 9.0, максимальная чувствительность отмечалась при рН=4.5. Выбор pH и температуры термостатирования колонки определялись также данными ее технического паспорта. Для стабилизации значения pH вода в составе подвижной фазы была заменена на 0,01 М фосфатный буфер.
Выбор жидкостной экстракции был обусловлен оснащением лаборатории, а также высокой стоимостью оборудования и материалов для твердо-фазной экстракции. В качестве экстрагентов были испробованы следующие растворители и их комбинации: дихлорметан; дихлорметан и пропанол-2 в соотношении 9:1; гексан; гексан и дихлорметан в соотношении 3,5:1; диэтиловый эфир; этилацетат; ди-этиловый эфир, этилацетат и дихлорметан в соотношении 1:1:1; хлороформ и пропанол-2 в соотношении 9:1; спирт этиловый; спирт метиловый. Экстракции р-гидроксисимвастатина удалось добиться только с применением диэтилового эфира и комбинации дихлорметана и пропанола-2 в соотношении 9:1. Однако воспроизводимость и точность методики была выше при использовании последней комбинации. Увеличение продолжительности встряхивания и центрифугирования проб не привело увеличению чувствительности и улучшению разделения.
Выводы
1. Разработана методика количественного определения р-гидроксисимва-статина в плазме крови методом ВЭЖХ, отличающаяся доступностью и экономичностью.
2. Методика обладает достаточной точностью, воспроизводимостью, Надежностью, простотой выполнения и быстротой анализа.
Литература
1. Аронов Д.М. Лечение и профилактика атеросклероза / Д.М. Аронов. -М.: Триада-Х, 2000. - 411 с.
2. Аронов Д.М. Симвастатин / Д.М. Аронов. - М.: Триада-Х, 2002. - 80 с.
3. Орлов В.И. Жидкостная хроматография. Теоретические основы / В. И. Орлов, А.А. Аратсков. - Дзержинск, 1997. - 41 с.
4. Соколов А.В. Клиническая фармакокинетика / А.В. Соколов. - М.: Типография «Верже», 2004. - 55 с.
5. Стыскин Е.Л. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / Е.Л. Стыскин, Л.Б. Ицик-сон, Е.В. Брауде. - М., 1986. - 205 с.
6. Bioeuivalence assesment of two simvastatin tablets in healthy Taiwanese volunteers / Chih-Neng [et al.] // Journal of food and drug analysis. - 2007. -Vol. 15. - P. 15-19.
7. Determination of simvastatin in human plasma by column-switching HPLC with UV detection / Kim Bae-Chan [et al.] // Journal of liquid chromatography & related technologies. - 2004. - Vol. 27. - P. 3089-3102.
8. Determination of Simvastatin in human plasma by liquid chromatography-mass spectrometry / Haitao Yang [et al.] // Journal of Chromatography B. - 2003.
- Vol. 785. - P. 369-375.
9. HPLC determination of ezetimibe and simvastatin in pharmaceutical formulations / Muhammad Ashfaq [et al.] // Journal of the Chilean Chemical Society. - 2007. - Vol. 52. - P. 1220-1223.
10. HPLC determination of simvastatin and nicotinic acid in tablets / M. Gandhi-
mathi [et al.] // Indian drugs. - 2003. -Vol. 40. - P. 707-711.
11. Nagaraju P. A validated reverse phase HPLC method for the simulations estimation of simvastatin and ezetimibe in pharmaceutical dosage forms / P. Nagaraju, Z. Vishnu vardhan // Journal of Global Pharma Technology - 2010. -Vol. 24. - P. 113-117.
12. Rainville P. Transfer of the USP assay for simvastatin to UPLC / P. Rainville, R. Plumb // Ultraperfomance LC. -2007. - Vol. 80. - P. 9-11.
13. Rapid voltammetric identification and determination of simvastatin at trace levels in pharmaceuticals and biological fluid / B. Nigovic [et al] // Croatia Chemmical Acta.
- 2008. - Vol. 81. - P. 453-459.
METHOD FOR THE QUANTATIVE DETERMINATION OF P-HYDROXYSIMVASTATIN IN BLOOD PLASMA
N.M. Popova
Article is devoted working out of an original HPLC method of quantitative determination of P-hydroxysimvastatin in the blood plasma. In work the HPLC system "Stayer" with the spektro-photometric detector was used. Analysis was achieved on the reversed phase column «Beckman Coulter». Separation of P-hydroxysimvastatin from the blood plasma carried out a method liquid Extraction Key words: HPLC, fi-gidroksisimvastatin.
Попова Наталья Михайловна - ассистент кафедры фармакологии с курсом фармакотерапии ФПДО.
390020, г. Рязань, ул. Хиринская, д.39.
Тел.: 8-4912 -93-04-66.
