Методические аспекты определения органического йода (йодтирозинов) в пищевых продуктах Текст научной статьи по специальности «Прочие сельскохозяйственные науки»

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА И БЕЗОПАСНОСТИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

Для корреспонденции

Куликовский Андрей Владимирович - кандидат технических наук, старший научный сотрудник ФГБНУ «Поволжский научно-исследовательский институт производства и переработки мясомолочной продукции» Адрес: 400120, г. Волгоград, ул. им. Рокоссовского, 6 Телефон: (844) 239-10-48 E-mail: [email protected]

А.В. Куликовский1, А.Б. Лисицын2, О.А. Кузнецова2, Н.Л. Вострикова2, И.Ф. Горлов1

Методические аспекты определения органического йода (йодтирозинов) в пищевых продуктах

Method of determination organic iodine (iodotyrosines) in food

A.V. Kulikovskiy1, A.B. Lisitsyn2,

0.A. Kuznetsova2, N.L. Vostrikova2,

1.F. Gorlov1

1 ФГБНУ «Поволжский научно-исследовательский институт производства и переработки мясомолочной продукции», Волгоград

2 ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова», Москва

1 Volga Region Research Institute of Manufacture and Processing of Meat and Milk Production, Volgograd

2 Gorbatov's All-Russian Meat Research Institute, Moscow

Разработка биологически активных добавок на основе органической формы йода (йодтирозинов) требует контроля веществ, образующихся в процессе синтеза. Не менее важны контроль содержания йодтирозинов в обогащенных продуктах и возможность технологического использования в рецептуре. Разработанная высокоточная и чувствительная методика определения йодтирозинов в пищевых продуктах и биологически активных добавках к пище позволит определять даже фоновые количества йодтирозинов (до 1 мкг/кг). Идентификацию йодтирозинов осуществляли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором (ВЭЖХ-МС/МС). В статье приведены параметры хроматографического разделения 3-йод-L-тирозина и 3,5-дийод-L-тирозина и масс-спектрометрической идентификации распылением в электрическом поле, приведены методические рекомендации подготовки проб и очистки твердофазной экстракцией. Дано обоснование применению масс-спектрометрии как наиболее чувствительного и селективного метода определения органического йода по сравнению с ВЭЖХ с ультрафиолетовым детектором. Для идентификации и оценки места включения йода в белки использовали мягкий ферментативный гидролиз с применением про-теазы. Очистку пробы проводили методом твердофазной экстракции на концентрирующих патронах типа С18. Перед ВЭЖХ-МС/МС идентификацией йодтирозины предварительно дериватизировали смесью бутанол-ацетил хлорид. Степень извлечения йодтирозинов из матрицы пищевого продукта составила не менее 85%, коэффициент корреляции калибровочной кривой в диапазоне измерений 1-2000 нг/мл составил 0,999, достоверное определение йода в органической форме в пищевых продуктах в диапазоне содержания от 10 до 20 000 мкг/кг.

Ключевые слова: йодтирозины, йод в органической форме, высокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектором, пищевые продукты

It is important to control the substances of the synthesis of biologically active supplements, based on organic forms of iodine (iodotyrosines). But it is no less important to control the

content of iodotyrosines in foods. The developed method is sensitive and selective and can determine iodotyrosines with a lower limit of detection (1 ppb). Iodotyrosines have been determined by HPLC-MS/MS. The article contains parameters for chromatographic separation of 3-iodo-L-tyrosine and 3.5-diiodo-L-tyrosine and parameters of the electrospray ionization (ESI) mass spectrometry, describes the methodology of sample preparation and solid phase extraction. The article substantiates the use of mass spectrometry as the most sensitive and selective method for determining the organic iodine as compared to HPLC with UV detection. The enzymatic hydrolysis with proteolytic enzymes has been used for sample preparation in iodothyronine analyses. Solid phase extraction was performed using C18 cartridge. For HPLC-MS/MS analysis iodothyronine derivatives were obtained with a mixture of butanol-acetyl chloride. Degree of iodotyrosine extraction from the matrix of the foodstuffs was not less than 85%, the correlation coefficient of the calibration curve in the concentration range of 1-2000 ng/mL was 0.999, reliable determination of iodine content in foods in the range from 10 to 20 000 mcg/kg.

Keywords: iodotyrosines, organic iodine, high performance liquid chromatography with mass spectrometric detection, food products

В настоящее время широкое распространение получили биологически активные добавки (БАД) на основе органической формы йода. В основе процесса получения органической формы йода лежит процесс ферментативного йодирования аминокислотных остатков сывороточных белков коровьего молока с последующей дополнительной очисткой от неорганического йода с помощью ультрафильтрации, а также сублимационной и распылительной сушкой [1]. Йодированные молочные белки используются для обогащения йодом пищевых продуктов, однако содержание органической формы этого микроэлемента в продукте не контролируется из-за отсутствия стандартизированных методик определения органического йода.

Существующие методики определения йода основаны на вольтамперометрическом определении неорганической формы йода [2, 3]. Метод основан на способности иодид-ионов накапливаться на поверхности ртутно-пленочного электрода в виде малорастворимого соединения с ртутью при определенном потенциале с последующим катодным восстановлением осадка при изменении потенциала [4]. Данный метод не применим для подтверждения подлинности БАД на основе йодированного молочного белка, так как необходимо определить органическую форму йода в виде йодтиро-зинов. Титрометрический метод определения йода не применим для обогащенных пищевых продуктов, так как предел количественного определения составляет около 50 мг/кг, что на 2 порядка выше содержания йода в обогащенных продуктах [5].

В 2012 г. во ВНИИМП им. В.М. Горбатова была разработана и аттестована методика контроля содержания йодтирозинов в биологически активных добавках (МИ 103.5-132-2012) [6], позволяющая определять органическую форму йода в виде йодтирозинов. Ключевым этапом является ферментативное расщепление белковой части пробы протеазой и последующая очистка ультрацентрифугированием, идентификацию осуществляют методом обращенно-фазовой

хроматографии с классическим ультрафиолетовым детектором (УФ-детектором) поглощения. Однако применить данный метод для обогащенных продуктов невозможно вследствие низкой чувствительности УФ-детектора [7, 8]. Наиболее информативны для этих целей методы тандемной жидкостной масс-спектро-метрии, времяпролетной масс-спектрометрии и мат-рично-активированной лазерной десорбции/ионизации, позволяющие с высокой точностью определять структурные фрагменты, аминокислотную последовательность, посттрансляционные модификации белков и аминокислот, молекулярную массу белков в широком их диапазоне [9, 10].

Целью работы была разработка методики определения йодтирозинов в пищевых продуктах методом тандемной жидкостной хромато-масс-спектрометрии. В результате проведенных исследований были выбраны оптимальные условия ферментативного гидролиза, изучена и установлена степень гидролиза и стабильность аналитического сигнала в сложных матрицах, подобраны параметры хромато-масс-спектрометрической идентификации.

Материал и методы

В процессе разработки методики определения органического йода был апробирован вольтамперометричес-кий метод определения йода в пищевых продуктах [11]. Для разрушения органической формы йода пробы предварительно подвергали сухой минерализации в муфельной печи ПМ-16П-1200 (ОАО «Электроприбор», Россия), в качестве стабилизатора использовали 0,5 М раствор нитрата калия, количество образующегося комплекса йодид-ионов определяли на полярографе «Вольта АВС-1.1» (НТФ «Вольта», Россия). Объектами исследований являлись обогащенные в соответствии с рекомендациями [11] добавкой «Йодказеин» хлеб, молоко и кисломолочные продукты. Искомые концентра-

ции находились в диапазоне 80-100 мкг/кг (в пересчете на йод). По результатам анализа не получены сходимые результаты, предположительно это связано с возможными потерями в ходе подготовки проб, так как йод - летучий элемент. В случае обогащения неорганической формой йода погрешность данного метода в диапазоне концентраций 80-100 мкг/кг не превышала 30%.

Для определения места включения йода и подтверждения наличия йодированных аминокислот была разработана методика хромато-масс-спектрометрической идентификации йодтирозинов. Для оценки места включения йода в белки был использован мягкий ферментативный гидролиз йодированного белка и анализ методами хроматографии и масс-спектрометрии.

В качестве стандартных образцов были использованы 3-йод-1_-тирозин (МИТ) и 3,5-дийод-1_-тирозин (ДИТ) («Sigma Aldrich», США). Для приготовления градуировоч-ных растворов проводили дериватизацию йодтирозинов (МИТ и ДИТ). Для этого стандартные образцы МИТ и ДИТ массой по 10 мг растворяли в 100 см3 метанола, с применением ультразвуковой ванны «Branson 5510» («Branson», США). Отбирали 1 см3 раствора и упаривали на роторном испарителе «Laborota 4003» («Heidolph», Швейцария). Сухой остаток растворяли в 1 см3 смеси бутанол: ацетилхлорид (4:1) и проводили термостати-рование на водяной бане при 60 °С в течение 15 мин. Смесь упаривали и перерастворяли в 10 см3 20% водного раствора ацетонитрила. Градуировочные растворы индивидуального йодтирозина (МИТ или ДИТ) доводили до концентрации 10 и 1 нг/мл последующим разведением в 20% растворе ацетонитрила в воде.

Подготовка проб включала ферментативный гидролиз пищевого продукта, извлечение и очистку целевых веществ методом твердофазной экстракции (ТФЭ), с последующей дериватизацией экстракта.

Перед проведением анализа пробу предварительно высушивали в сушильном шкафу при 65-70 °С и обезжиривали на аппарате Сокслета «Behr R 106 S» («Behr Labor-Technik», Германия). Молоко и молочные продукты не нуждаются в предварительной подготовке. Навеску образца гидролизовали в буферном растворе Трис-HCl, pH 8,0, добавляли протеазу из Streptomyces griseus («Sigma Aldrich», США) в количестве, составляющем 1/10 от массы пробы белка, и термостатировали не менее 16 ч при 37 °C. Гидролизат центрифугировали и фильтровали, после подвергали очистке методом ТФЭ. Патрон ТФЭ предварительно кондиционировали последовательно 2 см3 метанола и 2 см3 бидистиллированной воды. Отбирали 0,4 см3 гидролизата пробы, добавляли 0,1 см3

ацетонитрила, смесь наносили на патрон. Экстракцию с патрона осуществляли в две стадии последовательным элюированием 1 см3 метанола и 1,5 см3 смеси аце-тонитрил:0,1 М HCl (4:1,S). Элюент упаривали досуха при 60 "С, затем дериватизировали смесью бутанол:хлорис-тый ацетил (4:1) подобно стандартным образцам и перерастворяли в 20% водном растворе ацетонитрила.

Параметры анализа йодтирозинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором

Анализ выполняли методом ВЭЖХ-МС/МС после хро-матографического разделения в установленных условиях на системе ВЭЖХ «Agilent 1200 series» («Agilent Technologies», США) в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) на масс-спектрометре «Agilent 6410 Triple Quadrupole» («Agilent Technologies», США). Хрома-тографическое разделение гидролизата смеси после дериватизации проводили методом обращенно-фазной хроматографии на колонке с фазой dS («Agilent Eclipse XDB C1S», 4,6x50 мм, 1,S мкм) в условиях градиентного элюирования, представленных в табл. 1.

Для анализа подобраны следующие параметры масс-спектрометрического детектирования: температура источника - 100 "С; температура газа десольвации -320 "С; скорость потока газа десольвации - S л/мин; давление иглы распылителя - 30 psi.

Условия регистрации аналитических сигналов в режиме мониторинга множественных реакций (MRM) представлены в табл. 2.

Приготовленные стандарты анализировали 5-кратно, затем с помощью программного обеспечения «Masshunter Quantitative Analysis» (Version Build 4.0.225.0) по зависимости площадей MRM-переходов хроматогра-фических пиков стандартных образцов исследуемого соединения от концентрации аналита строили калибровочную кривую. Идентификацию аналитов осуществляли по абсолютному времени удерживания дочерних ионов целевых веществ, регистрируемых в режиме MRM. Нижний предел количественного определения по йодти-розинам (МИТ, ДИТ) составил 1 мкг/кг. Линейный коэффициент корреляции был равен 0,9994 в диапазоне измерений концентраций йодтирозинов от 1 до 2000 нг/мл. За счет использования колонок с мелкозернистым сорбентом (1,S мкм) время анализа не превышало 5 мин. Полученные хроматограммы стандартных образцов йодтирозинов и калибровочные кривые представлены на рис. 1-3.

Таблица 1. Параметры и условия высокоэффективной жидкостной хроматографии

Время, мин Соотношение компонентов подвижной фазы Скорость потока, см3/мин T колонки, °С

ацетонитрил,% 1% муравьиная кислота, %

0,0 20 80 0,6 30

2,0 90 10

5,0 90 10

Таблица 2. Параметры воздействия на ионы в режиме мониторинга множественных реакций и условия ионизации распылением в электрическом поле (ESI) с регистрацией положительных ионов

Аналит Ион предшественник, Дочерние ионы, Напряжение Энергия диссоциации

m/z m/z на фрагменторе (Frag), В (CE), В

3-йод^-тирозин 364,0 134,9 112 30

(МИТ) 364,0 261,9 112 13

3,5-дийод^-тирозин 489,9 387,8 116 17

(ДИТ) 489,9 260,9 116 30

Интенсивность

x102 +ESI MRM Frag = 112,0 V CID®** 10ng_standart_11.d 10,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2 2,1 2,2 2,3 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 4 4,1 4,2 4,3 4,4 4,5 4,6 4,7 4,8 4,9 5

Время, мин

Рис. 1. Хроматограмма градуировочных растворов йодтирозинов (общий ионный ток и мониторинг множественных реакций, переходы: 1 - 3-йод-1_-тирозин; 2 - 3,5-дийод-1_-тирозин)

1

о 1

it

t

It

t

it

LJJ

inr-Un. А . . . JLJ-LJ^ 1\М-ЬН ч—h-H—HI

Интенсивность

+MRM (3673.994 min, 33 scans) >2 х1061

3 2

о 1,9

1,8

1,7

1,6

1,5

1,4

1,3

1,2

1,1

0,9

0,8

0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

0

2 6 ,9

13 ,

64,0

♦

Интенсивность

MIT -5 Levels, 5 Levels Used, 10 Points, 10 Points Used, 0 QCs

£х105

£ 9

° 8,5

3 8

CC 7,5 7 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

-0,5

150 200 250 300 350

Заряд к массе

y = 41 12 7080х х + 3 ,209301

Rx2 = 0,99 95791 1

-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100

Концентрация, нг/мл

Рис. 2. Калибровочная кривая градуировочного раствора 3-йод^-тирозина в диапазоне концентраций 1,0-2000,0 нг/мл

о

Интенсивность

+ MRM (3,915-4,136 min, 32 scans)

s106

= 1,8 1,7 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

Интенсивность

5 Levels, 5 Levels Used, 10 Points, 10 Points Used, 0 QCs

2 60,9

DIT ■

x 105

; 8

5 7,5

s 7

I 6,5 6 5,5 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

-0,5

350 400 450 500

Заряд к массе

y = 3 90,77 021 x + 27 ,4912 4

Rx2= 0,999 4370 5

-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800

900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100

Концентрация, нг/мл

Рис. 3. Калибровочная кривая градуировочного раствора 3,5-дийод^-тирозина в диапазоне концентраций 1,0-2000,0 нг/мл

x 102 1,51,41,31,2. 1,1 о 1-

нсив 0,9 Ин 0,8

0,70,60,5 0,4

+ MRM (489,9^387,8) iod-kazein-1.d x 102

*3,829 мин

1,2-

1,15-

1,1-

1,05-

1-

0,95-

е

х 0,9-

от

ь, 0,85-

ст

но в 0,8-

и

нс е 0,75-

Ин 0,7-

0,65-

0,6-

0,55-

0,5-

0,45-

0,4-

0,35-

*3,970 мин

.wvMVMi^miWlA^

3 3,2 3,4 3,6 3,8 4 4,2 4,4 4,6

Время, мин

3,2 3,4 3,6 3,

4 4,2 4,4 4,6 4,8

Время, мин

250 300

Рис. 4. Хроматограммы пробы пищевого продукта, обогащенного йодтирозинами (3-йод-1_-тирозин - 3,829 мин и 3,5-дийод-1_-тирозин - 3,970 мин)

Результаты и обсуждение

Проблема создания, внедрения и промышленного выпуска йодсодержащих препаратов тесно связана с необходимостью разработки чувствительных методов анализа органических полигалогенидов на различных

этапах получения, в БАД и биообъектах. Необходимость контроля содержания йодтирозинов обусловлена как технологическими факторами при производстве пищевых продуктов, так и использованием в рецептуре все большего количества химических соединений, которые могут взаимодействовать с образованием новых веществ.

Контроль качества пищевых продуктов на содержание йода в органической форме требует использования методов хроматографии, тандемной масс-спектрометрии. Основными критериями доказательства подлинности йодированных молочных белков является подтверждение наличия йодированных аминокислот, в частности йодтирозинов, и определение степени их йодирования. Идентификация йодтирозинов в сложных пищевых матрицах, обогащенных органической формой йода (мясомолочная продукция, хлебобулочная продукция, консервированные соки и др.), требует применения техники ВЭЖХ-МС/МС. Поведенные исследования показали, что при кислотном гидролизе (при 110 °С в течение 24 ч) йодированные аминокислоты, в частности йодти-розины, неустойчивы в присутствии концентрированной соляной кислотой. При щелочном гидролизе происходит рацемизация некоторых аминокислот и разрушение аргинина, лизина, цистина и цистеина. Гидролиз белков, осуществляемый с помощью протеолитических ферментов, лишен недостатков кислотного гидролиза. При ферментативном гидролизе были получены частичные гидролизаты, содержащие в различных соотношениях как малые пептиды, так и аминокислоты, в том числе триптофан. Для гидролиза использовали ферменты: па-

Сведения об авторах

паин, панкреатин, протеазу. Максимальная степень гидролиза была достигнута при использовании протеазы из Streptomyces griseus.

Степень извлечения йодтирозинов из матрицы пищевого продукта составила не менее 85% (находилась в пределах 85-90%). Вследствие чего при вычислении массовой доли йодтирозинов, был введен эмпирический коэффициент 0,85, учитывающий потери йодтиро-зинов на стадии пробоподготовки.

Хроматограммы пробы пищевого продукта, обогащенного йодтирозинами, представлены на рис. 4

Установлено, что методы тандемной хромато-масс-спектрометрии в целях контроля качества обогащенной продукции (после внесения функциональных добавок, содержащих йодированные молочные белки) позволяют достоверно идентифицировать форму органического йода и контролировать ее количество (в виде йодтирозинов) в пищевых продуктах в диапазоне содержания от 10 до 20 000 мкг/кг. По результатам проведенных исследований разработан ГОСТ 33422 -2015 «Мясо и мясные продукты. Определение массовой доли йодтирозинов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором».

Работа выполнена в рамках гранта Российского научного фонда № 15-16-10000.

Куликовский Андрей Владимирович - кандидат технических наук, старший научный сотрудник лаборатории ФГБНУ «Поволжский научно-исследовательский институт производства и переработки мясомолочной продукции» (Волгоград) E-mail: [email protected]

Лисицын Андрей Борисович - доктор технических наук, профессор, директор ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова» (Москва) E-mail: [email protected]

Кузнецова Оксана Александровна - кандидат технических наук, заместитель директора ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова» (Москва) E-mail: [email protected]

Вострикова Наталья Леонидовна - кандидат технических наук, заведующая лабораторией ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт мясной промышленности им. В.М. Горбатова» (Москва) E-mail: [email protected]

Горлов Иван Федорович - доктор сельскохозяйственных наук, профессор, научный руководитель ФГБНУ «Поволжский научно-исследовательский институт производства и переработки мясомолочной продукции» (Волгоград) E-mail: [email protected]

Литература

Томчани О.В. Разработка технологий йодказеина и молочных продуктов, обогащенных йодированным белком : автореф. дис. ... канд. тех. наук. Обнинск, 2002. 36 с. AOAC (2005). Official method of Analysis. 18th ed. Washington, DC : Association of Officiating Analytical Chemists, method 935.14 and 992.24. AOAC (2007). Official method of Analysis (18th ed.). Washington, DC: Association of Officiating Analytical Chemists, method 992.22. Жукова Г.Ф., Савчик С.А., Хотимченко С.А. Методы количественного определения йода в пищевых продуктах и продовольственном сырье // Вопр. питания. 2004. № 5. С. 42-48. МУК 4.1.1106-02. «Определение массовой доли йода в пищевых продуктах и сырье титриметрическим методом». М., 2002. 10 с. МИ 103.5-132-2012/01.00225-2011 «Определение содержания йодтирозинов в йодированных молочных белках и БАДах на их

10.

основе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии». М., 2012. 16 с.

Judprasong K., Jongjaithet N., Chavasit V. Comparison of methods for iodine analysis in foods // Food Chem. 2016. Vol. 193. P. 12-17.

Nitschke U., Stengel D.B. A new HPLC method for the detection of iodine applied to natural samples of edible seaweeds and commercial seaweed food products // Food Chem. 2015. Vol. 172. P. 326-334.

Comprehensive Handbook of Iodine. Determination of Iodine In Vivo and In Vitro by X-Ray Fluorescence Analysis: Methodology and Applications. Elsevier, 2009. P. 29.

Чернецова Е.С., Корякова А.Г. Использование высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спект-

7.

2

3

8

9

5

6

рометрией для исследования новых лекарственных веществ// Масс-спектрометрия. 2010. Т. 7, № 2. С. 101-112. 11. МР 2.3.7.1916-04 «Применение йодказеина для предупреждения 12. йоддефицитных заболеваний в качестве средства популяци-

онной, групповой и индивидуальной профилактики йодной недостаточности». М., 2004.

МУК 4.1.1187-03. «Вольтамперометрическое определение йода в пищевых продуктах», М., 2003. 23 с.

References

Tomchani O.V. Development of technologies for iodine casein and dairy products enriched with iodized protein: Abstract of Diss. Obninsk, 2002: 36 p. (in Russian)

AOAC (2005). Official method of Analysis. 18th ed. Washington, DC: Association of Officiating Analytical Chemists, method 935.14 and 992.24.

AOAC (2007). Official method of Analysis. 18th ed. Washington, DC: Association of Officiating Analytical Chemists, method 992.22. Zhukov G.F., Savchik S.A., Khotimchenko S.A. Methods for the quantitative determination of iodine in foodstuffs and food raw materials. Voprosy pitaniia [Problems of Nutrition]. 2004; Vol. 5: 42-8. (in Russian)

MUK 4.1.1106-02. «Determination of the mass fraction of iodine in food and raw materials titrimetrically». Moscow, 2002: 10 p. (in Russian)

MI 103.5-132-2012 / 01.00225-2011 «Determination of iodotyro-sines in iodized milk proteins and Badakhshan based on them by

10.

high performance liquid chromatography». Moscow, 2012: 16 p. (in Russian)

Judprasong K., Jongjaithet N., Chavasit V. Comparison of methods for iodine analysis in foods. Food Chem. 2016; Vol. 193: 12-7. Nitschke U., Stengel D.B. A new HPLC method for the detection of iodine applied to natural samples of edible seaweeds and commercial seaweed food products. Food Chem. 2015; Vol. 172: 326-34.

Comprehensive handbook of iodine. Determination of iodine in vivo and in vitro by X-Ray fluorescence analysis: methodology and applications. Elsevier, 2009: 29.

Chernetsova E.S., Koryakova A.G. The use of high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry for the study of new drugs. Mass-spektrometriya [Mass Spectrometry]. 2010; Vol. 7 (2): 101-112. (in Russian)

MUK 4.1.1187-03. «Voltammetric determination of iodine in food». Moscow, 2003: 23 p. (in Russian)

1.

7

2

8

3.

9.

5