CC BY
158
Научные и©©лед©вания
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СПОСОБНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ -ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ ЧЕЛЮСТНО-ЛИЦЕВОЙ ОБЛАСТИ ФОРМИРОВАТЬ БИОПЛЕНКИ
Кабанова А.А., Плотников Ф.В.
Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский университет, Беларусь
Kabanova A.F., Plotnikov F.V.
Vitebsk State Order of Peoples' Friendship Medical University, Belarus
Biofilm formation determination of the maxillofacial inflammatory processes microagents
Резюме. На современном этапе развития медицины установлено, что микроорганизмы - возбудители инфекционной патологии челюстно-лицевой области существуют на поверхности гнойной раны в составе микробных сообществ - биопленок. Нами разработан и апробирован метод определения способности бактерий образовывать биопленку in vitro. Выявлено, что возбудители гнойно-воспалительных заболеваний способны формировать биопленку, что требует коррекции этиотропного лечения, используемого в хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии.
Ключевые слова: гнойно-воспалительные заболевания, челюстно-лицевая область, микроорганизм, биопленка.
Summary. At the present stage of medicine development it is established that micro-agents of infectious pathology of maxillofacial area exist on a surface of a purulent wound as a part of microbic communities - biofilms. The method for determination the ability of bacteria to form biofilm in vttro was developed and approved. It is revealed that causative agents of pyoinflammatory diseases are capable to form a biofilm that demands correction of the etiotropic treatment used in surgical stomatology and maxillofacial surgery. Keywords: pyoinflammatory processes, maxilla-facial area, microorganism, biofilm.
Среди актуальных проблем хирургической стоматологии вопрос совершенствования способов диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области занимает одно из ведущих мест. Это объясняется как частотой возникновения, так и тяжестью осложнений рассматриваемой патологии, несмотря на проведение целого комплекса профилактических мероприятий. Увеличение числа таких больных наблюдается с 60-70-х годов прошлого столетия и, несмотря на предпринимаемые меры, тенденции к снижению не наблюдается [2]. По данным отделения челюстно-лицевой хирургии Витебской областной клинической больницы, около 50% госпитализированных в стационар пациентов проходят лечение по поводу гнойно-воспалительных процессов челюстно-лицевой области.
Отечественными и зарубежными учеными внесен значительный вклад в разработку проблем профилактики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области. Возросший интерес специалистов к изучению острой одонтогенной инфекции челюстно-лице-вой области объясняется полиморфизмом микробных ассоциаций и появлением антибиотикорезистентных штаммов, вызывающих воспаление, изменением неспецифической и иммунологической реактивности, атипичностью клинической
картины заболеваний и недостаточной эффективностью стандартных методов лечения. Большую роль в изменении клинической картины гнойно-воспалительных процессов челюстно-лицевой области играют нарушение питания, злоупотребление алкоголем, наркотическая зависимость, неблагоприятная экологическая ситуация [3].
Многие аспекты этиопатогенеза гнойно-воспалительных заболеваний подвергаются пересмотру из-за постоянно меняющихся взаимоотношений между различными видами и штаммами микробных возбудителей и организмом человека. Сама вероятность развития инфекционного процесса, особенности клинического течения и прогноз во многом зависят от факторов, определяющих эти взаимоотношения. Развитие инфекционно-воспалительного процесса часто провоцируется нарушением состояния макроорганизма. В ответных реакциях на воздействие патогена в той или иной степени участвуют все физиологические системы. В современной патологии челюстно-ли-цевой области не уделяется должного внимания социальным факторам в развитии и клиническом течении гнойных заболеваний. Установлено, что именно характерные особенности атипичного и хронического течения заболеваний имеют непосредственную связь с со-
циальным статусом пациентов, их образом жизни и возрастом.
Клинические особенности инфекционного процесса во многом обусловлены биологическими свойствами микроорганизмов, а именно - наличием у них патогенного и персистентного потенциалов. В последнее десятилетие изучению механизмов выживания бактерий придается особое значение. Основной частью микробиологов признано, что большинство микроорганизмов в естественных и искусственно созданных окружающих средах существует в виде структурированных, прикрепленных к поверхности сообществ - биопленок
[7]. Биопленка - микробное сообщество клеток, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ; они демонстрируют изменение фенотипа, выражающееся в изменении параметров роста и экспрессии специфичных генов
[8]. По данным [4], до 80% инфекционных заболеваний связано с образованием этих микробных структур. В ряде работ показана роль бактериальных пленок в развитии инфекционных осложнений у пациентов стоматологического профиля [9], единичные исследования посвящены формированию бактериальных пленок при экспериментальной раневой инфекции [12].
Научные и©©лед©вания
С использованием лазерной конфокальной и сканирующей электронной микроскопии установлено, что биопленки имеют сложную трехмерную структуру. Популяция клеток в составе биопленки гетерогенна, содержит быстро- и медленнорастущие бактерии. Образование биопленок - комплексный процесс, состоящий из нескольких этапов: адгезии клеток на поверхности и перераспределения клеточной массы; активного деления клеток для создания клеточных кластеров; образования экзополимерно-го слизистого матрикса [10]; распространения клеток биопленки в окружающей среде. Изначальное прикрепление микробной клетки к поверхности субстрата осуществляется за счет действия электростатических, гидрофобных сил, сил Ван дер Вальса, неспецифической адгезии. У грамотрицательных микроорганизмов важную роль в адгезии и клеточной агрегации играют жгутики и фимбрии. Установлено, что степень адгезии с последующим формированием биопленок наиболее выражена к таким материалам, как латекс, силикон, поливинилхлорид. Адгезия к тефлону, полиуретану, нержавеющей стали и титану встречается реже. Все перечисленные материалы широко применяются в медицинской практике, что является дополнительным фактором формирования биопленок, что приводит к развитию инфекций с клинической резистентностью к антибактериальной терапии [6].
Клетки в матриксе располагаются определенным образом. Структура многоклеточных кластеров представлена в виде напоминающих столбы образований, «цементированных» в экзополиса-харидный слой, что позволяет поддерживать концентрацию питательных веществ, необходимых для роста популяции, а также служит защитой клеток. Матрикс разделен каналами, наполненными водой, а также имеет полости и пустоты. Через каналы транспортируются питательные вещества и кислород от внешних к внутренним частям биопленки, одновременно с этим выводятся метаболиты клеток. Клетки бактерий в биопленке имеют сложную полиморфную организацию с определенной цитоархитектоникой, выявляются клетки с сильно измененной морфологией, мертвые клетки [13]. Многослойная топография влияет на метаболизм и физиологическую активность клеток. Периферические слои более аэрированы по сравнению с центральными частями, где образуются благоприятные условия для анаэробов [11]. Сниженный метаболизм
микроорганизмов в биопленке ведет к появлению антибиотикорезистентности, т.к. антибактериальные препараты наиболее эффективны в отношении метаболически активных клеток [14]. В пределах биопленки могут происходить физиологические изменения, включающие реакцию общего стресса, закрытие ключевых метаболических процессов и индукцию защитных механизмов.
Наиболее важная отличительная особенность бактерий, находящихся в составе биопленки, - повышенная резистентность к антибактериальным препаратам [5], что в определенной мере объясняет недостаточную эффективность проводимого лечения хирургической инфекции.
Следовательно, в последние десятилетия изменилось представление об этиологии инфекционных заболеваний, в том числе и гнойно-воспалительных процессов челюстно-лицевой области, что ведет к поиску новых методов диагностики, прогнозирования и лечения данной патологии.
цель исследования - разработать и апробировать метод изучения особенностей этиологии гнойно-воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области с учетом способности возбудителей формировать биопленки.
Материалы и методы
В ходе исследования было проведено комплексное обследование 24 пациентов с гнойно-воспалительными процессами челюстно-лицевой области, проходивших курс стационарного лечения в отделении челюстно-лицевой хирургии УЗ «Витебская областная клиническая больница» в период с 2011 по 2012 год. Критерии включения пациентов в исследование: наличие гнойно-воспалительного процесса челюстно-лицевой области, возраст старше 18 лет, наличие добровольного информированного согласия на участие в проводимом исследовании. Критерии исключения: возраст младше 18 лет, беременность, сопутствующая патология в стадии декомпенсации, отсутствие добровольного информированного согласия. Всем наблюдаемым пациентам было выполнено клиническое обследование, включавшее субъективные методы: опрос (паспортные данные, жалобы, анамнез жизни, анамнез заболевания) и объективные методы: физикальные (внешний осмотр, осмотр полости рта, пальпация, перкуссия, аускультация), специальные методы исследования (определение температуры тела, лучевые методы диагностики) [1]. Лечебные мероприятия были комплексными и включали
хирургическое и медикаментозное лечение. Проводилась этиотропная терапия (антибактериальная), направленная на подавление возбудителей заболевания; патогенетическая, направленная на регуляцию патофизиологических процессов в очаге воспаления; и симптоматическая, способствующая восстановлению нарушенных функций организма.
В момент проведения хирургической обработки гнойного очага проводился забор раневого отделяемого для бактериологического исследования. Для выделения стрептококков использовали 5% кровяной Колумбия-агар, стафилококки выделяли на высокоселективном желточ-но-солевом агаре с азидом натрия, для кишечной группы бактерий использовали среду Эндо с генциан-фиолетовым, псевдомонады выделяли на среде ЦПХ. Идентификация микроорганизмов проводилась с помощью тест-систем на биохимическом анализаторе АТВ Expression фирмы «bioMerieux».
результаты и обсуждение
В ходе проведения исследования нами разработан метод оценки способности микроорганизмов - возбудителей гнойно-воспалительных процессов челюстно-лицевой области образовывать биопленку in vitro.
При постановке метода готовили взвесь микроорганизмов в бульоне Мюллера Хинтона с оптической плотностью на денситометре 0,5 единиц оптической плотности (ЕОП), что соответствует концентрации 1,5х108 КОЕ/мл. В лунки планшета вносили по 150 мкл полученной взвеси бактерий, на один штамм отводили 8 лунок. Отрицательным контролем служили лунки с 150 мкл бульона Мюллера Хинтона без бактерий. Планшет инкубировали в термостате при температуре 37 °С в течение 24 часов.
Из лунок планшета с помощью стерильной пипетки удаляли содержимое. Лунки четырехкратно промывали дистиллированной водой с помощью автоматической мойки МВ-350 производства «Технофорум». Биопленку фиксировали путем добавления в лунки по 160 мкл 2,5% раствора глютаральдегида и его инкубации в течение 5 минут. Планшет четырехкратно промывали и вносили по 170 мкл 0,25% раствора кристаллического фиолетового на 5 минут, после чего снова повторяли процедуру отмывки четыре раза и высушивали в течение 10 минут. В лунки добавляли по 200 мкл 33% раствора уксусной кислоты и инкубировали при комнатной температуре 10 минут до полной экстракции кристаллического
Научные м©©лед@©анмя
фиолетового в кислоту. Для измерения планшет помещали в многоканальный спектрофотометр Ф300, где при длине волны 620 нм определяли оптическую плотность в лунках. По полученным данным определяли среднее значение восьми лунок и оценивали способность образования микроорганизмом биопленки in vitro. При значении оптической плотности до 0,12 ЕОП определяли отсутствие способности образовывать биопленки; 0,120,24 - средняя; более 0,24 - сильная способность к образованию биопленки. Полученные результаты обрабатывались с помощью компьютерных программ Statistica 6.0 и «Excel».
С использованием разработанного нами метода проведена оценка способности образовывать биопленку у выделенных из гнойного очага возбудителей: 17 штаммов S.epidermidis, 5 штаммов S.aureus, 2 штаммов P.aeruginosa.
Среднее значение оптической плотности штаммов S.epidermidis, определенное по нашему методу, составило 0,19±0,02 ЕОП. Полученное значение указывает на то, что S.epidermidis имеет среднюю способность формировать биопленку. Среднее значение оптической плотности штаммов S.aureus составило 0,17±0,05 ЕОП, что свидетельствует также о средней способности S.aureus формировать биопленку. Среднее значение оптической плотности штаммов P.aeruginosa составило 0,2±0,03 ЕОП, что свидетель-
ствует также о средней способности P.aeruginosa формировать биопленку. Следовательно, согласно разработанному нами методу, выделенные возбудители имели среднюю способность формировать биопленку.
Таким образом, нами разработан и апробирован метод определения способности бактерий образовывать биопленку in vitro. С помощью данного метода выявлено, что возбудители гнойно-воспалительных заболеваний способны формировать биопленку со средней интенсивностью.
Согласно современным представлениям об особенностях возбудителей инфекционной патологии, необходимо дальнейшее совершенствование методов определения и оценки способности микроорганизмов формировать биопленки как in vitro, так и в гнойной ране пациента. Антибактериальные препараты в будущем будут назначаться с учетом способности микроорганизмов существовать в виде бактериальных сообществ -биопленок, а не отдельных планктонных форм.
ЛИТЕРАТУРА
1. Активная профилактика септических осложнений острой одонтогенной инфекции / М.А.Губин [и др.] // М-лы IX Междунар. конф. челюстно-лицевых хирургов и стоматологов. - СПб., 2004. - С.57-58.
2. Георгиади, Т.В. Новое в методах диагностики и лечения больных с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области / Т.В.Георгиади,
Г.В.Тобоев, Д.К.Льянова // Вопр. соврем. стоматологии: сб. трудов конф., посвящ. 90-летию со дня рождения А.И.Дойникова. - М., 2008. - С.173-176.
3. Коротких, Н.Г. Абсцессы и флегмоны лица: диагностика, лечение, прогноз / Н.Г.Коротких, Г.В.Тобоев. -Владикавказ, 2010. - 90с.
4. Сидоренко, С.В. Этиология тяжелых госпитальных инфекций в отделениях реанимации и анти-биотикорезистентность среди их возбудителей /
C.В.Сидоренко [и др.] // Антибиотики и химиотерапия. - 2005. - Т.50, №2-3. - С.33-41.
5. Biofilm formation and sloughing in Serratia marcescens are controlled by quorum sensing and nutrient cues /
5.A.Rice [et al.] // J. Bacteriol. - 2005. - N187. -Р.3477-3485.
6. Blango, M.G. Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics / M.G.Blango, M.A.Mulvey // Antimicrob. Agents Chemother. - 2010. -N54(5). -Р.855-1863.
7. Davey, M.E. Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics / M.E.Davey, G.A.O>Toole // Microbiol. Molecular Biol. Rev. Dec. - 2000. - Vol.64, N4. - P.847-867.
8. Donlan, R.M. Biofilms: Survival Mechanisms of Clinically Relevant Microorganisms / R.M.Donlan, J.W.Costerton // Clin. Microbiol. Rev. - 2002. - Vol.15, N2. - Р.167-193.
9. Effect of ambient humidity on the strength of the adhesion force of single yeast cell inside environmental-SEM / YShen [et al.] // Ultramicroscopy. - 2011. - Vol.111, N8. - Р.1176-1183.
10. Manos, J. Transcriptome analyses and biofilm-forming characteristics of a clonal Pseudomonas aeruginosa from the cystic fibrosis lung / J.Manos [et al.] // J. Med. Microb. - 2008. - N57. - P.1454-1465.
11. Mapping the speciation of iron in Pseudomonas aeruginosa biofilms using scanning transmission X-ray microscopy / R.C.Hunter [et al.] // Environ. Sci. Technol. -2008. - N42(23). - Р.8766-8772.
12. Microscopic and physiologic evidence for biofilm-associated wound colonization in vivo / S.C.Davis [et al.] // Wound Repair Regen. - 2008. - N16(1). -Р.23-29.
13. Moons, P. Bacterial interactions in biofilms / P.Moons [et al.] // Crit. Rev. Microbiol. -2009. - N35(3). - Р.157-168.
14. Pseudomonas aeruginosa hypoxic or anaerobic biofilm infections within cystic fibrosis airways /
D.J.Hassett [et al.] // Trends. Microbiol. - 2009. -N17(3). - Р.130-138.
Поступила 23.01.2013
ОСОБЕННОСТИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ ТЕРАПИИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ФЛЕГМОН ЧЕЛЮСТНО-ЛИЦЕВОЙ ОБЛАСТИ
Миранович С.И.1, Петровский Е.В.2
'Белорусский государственный медицинский университет, Минск 2Минская областная клиническая больница
Miranovich S.I.1, Petrovsky E.V.2 Belarusian State Medical University, Minsk 2Minsk Regional Pediatric Clinical Hospital, Belarus
Features of antibacterial therapy at treatment of phlegmons of maxillofacial area
Резюме. Изучена частота встречаемости абсцессов и флегмон челюстно-лицевой области среди пациентов, находившихся на лечении в отделении гнойной челюстно-лицевой хирургии 11-й городской клинической больницы Минска. Определен видовой состав микрофлоры, выделенной из патологических очагов при флегмонах, а также ее чувствительность к антибиотикам, даны рекомендации по лечению (выбору антибиотика). Ключевые слова: гнойные раны, абсцессы, флегмоны, микроорганизмы, антибиотики.
Summary. The statistical characteristic of pacients wtth abscesses and phlegmons of maxillofacial area who were on treatment in department of purulent maxillofacial surgery of 11th city clinical hospital of Minsk is studied. The specific structure of microorganisms abstracted from pathological healths at phlegmons and their sensitivity of antibiotics is defined. Keywords: festering wounds, abscesses, phlegmons, microorganisms, antibiotics.
