CC BY
31
© Л. А. Шапошник УДК б12. 1/. В. 57. 042. 2 Л. А. Шапошник
ПОСИЛЕННЯ ЦИТОТОКСИЧНОГО ЕФЕКТУ АЛКІЛУВАЛЬНИХ ХІМІОПРЕПАРАТІВ ПІД ВПЛИВОМ О6-БЕНЗИЛГУАНІНУ
Інститут молекулярної' біології і генетики (м. Київ)
Робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України і виконувалася в рамках такої бюджетної теми: Особливості експресії гену репаративного ензиму O6-aлкiлгyaнiн-ДНК алкілтрансферази в умовно нормальних та пухлинних клітинах» (шифр теми 2.2.4.17, № державної реєстрації 0108и00852б, 2009-2012 рр.).
Вступ. Речовини з алкілувальним механізмом дії широко використовуються у хіміотерапії. Вони спричиняють приєднання метильних і алкільних радикалів до нуклеотидів ДНК. Якщо ці групи не будуть видалені репаративними системами клітини, то під час наступної реплікації такі метильовані нуклеотиди помилково розпізнаються і спарюються - виникають мутації типу транзицій. В подальшому така клітина може перетворитися на пухлинну, але частіше вона елімінується [б, 9]. Цей цитотоксичний ефект алкілу-вальних сполук і знайшов застосування у лікуванні злоякісних пухлин.
Репаративний ензим O6-метилгуанін-ДНК ме-тилтрансфераза (MGMT) - один з основних механізмів захисту клітини від дії алкілувальних сполук. Він видаляє метильні і алкільні групи від нуклеотидів ДНК, а сам при цьому незворотньо інактивується. Рівень MGMT у пухлинних клітинах є головним прогностичним фактором лікування [1]. Пухлини, в яких не експресується MGMT, добре піддаються лікуванню навіть мінімальними дозами хіміопрепаратів. У таких випадках можна зменшити терапевтичні дози і уникнути багатьох побічних ефектів хіміотерапії. MGMT-позитивні пухлини навпаки, нечутливі до алкілувальних препаратів [В]. Підвищіти їх чутливість можна за допомогою інгібіторів активності ензиму або псевдосубстратів. У клінічну практику вже введений O6-бензилгyaнiн як найефективніший і найбезпечніший з них. Він діє на активність MGMT і незворотньо виснажує його запаси [3]. В експериментах in vitro на пухлинних лініях O6-бензiлгyaнiн у поєднанні з алкілувальними речовинами в декілька разів підвищував кількість дефектів ДНК і, як наслідок, посилював цитотоксичний та апоптичний вплив цих сполук [7].
Метою нашої роботи було вивчення впливу O6-бензилгуаніну на цитотоксичну дію алкілувальних речовин. Для дослідження нами були вибрані чотири речовини: фотемустин, ломустин, цисплатін і MNNG (метилнітронітрозогуанідін).
Фотемустин, ломустин і МЫЫО належать до похідних нітрозосечовини. Для цієї групи речовин характерна добра проникливість крізь гематоенцефа-лічний бар’єр, тому лише вони використовуються для хіміотерапії злоякісних пухлин мозку. Пошкодження ДНК, викликані дією цих препаратів, усуваються переважно репаративним ензимом МОМЇ. Тому від його кількості та активності у досліджуваних клітинах буде залежити чутливість клітин до цих трьох сполук. МЫЫО використовується лише у куль-туральних дослідах як класична алкілувальна речовина. Він спричиняє значне пригнічення гемопоезу через свою токсичність, тому не використовується у медицині. Цисплатін - платиновий хіміопрепарат, має аналогічний алкілувальним сполукам механізм дії. У склад молекули цисплатину входить хлор, тому цей препарат є хпоретилювальним. Цисплатін не проникає крізь гематоенцефалічний бар’єр. Платинові сполуки взаємодіють з нуклеотидами і утворюють внутрішньоланцюгові та міжпанцюгові зшивки ДНК, порушуючи реплікацію та транскрипцію [4]. Ці пошкодження усувають різні механізми: МОМЇ, ексцезійна репарація (МЕЯ), глутатіон (ОБН), циклінзалежна кіназа 2 (ОйК2). Ексцезійна постре-плікативна репарація усуває переважно внутрішньоланцюгові зшивки і не залежить від наявності 06-бензилгуаніна. Інші механізми відіграють провідну роль у відновленні виключно міжпанцюгових зшивок ДНК. Глутатіон інактивує платинові агенти шляхом їх необоротної взаємодії із атомом сульфу-ру ОБН. 06-бензилгуанін приблизно на 25 % інгібує синтез глутатіона. Цей показник дуже малий у порівнянні зі специфічними інгібіторами глутатіону, такими як бутіоміну сульфоксимін (ВБО), що пригнічує синтез ОБН аж на 95 % [5]. Циклінзалежні кінази є важливими регуляторами клітинного циклу. Серед речовин-інгібіторів ОйК1 та ОйК2 називають 06-циклогексілметилгуанін, що за хімічною структурою подібний до 06-бензилгуаніну [2].
Об’єкт і методи дослідження. Робота проводилася на стандартних клітинних лініях людини и373 (гліома) і Нер-2 (карцинома гортані). Усі клітини культивувалися у середовищі Ігла у модифікації Дюльбекко (йМЕМ - ОиіЬессо’в тосііїїесі Еаді’в тесііит, «Бідта», США) із додаванням 10 % ембріональної телячої сироватки («Бідта», США), 100 ОД/ мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину. Клітини культивували у зволожених умовах при температурі +37°С і 5 % СО2 у чашках Петрі («АпитЬга», Чехія).
Мікротитраційний аналіз проводився з використанням 96-луночних мікротитраційних планшетів Orange Scientific (Бельгія). У якості цитотоксичних речовин використовувалися хіміопрепарати: цисплатін (Ebewe Pharma, Австрія), фотемустин («Laboratories THISSEN», Бельгія), ломустин (Medac, Німеччина) та MNNG. Усі хімеопрепарати сертифіковані на території України і використовуються для лікування злоякісних захворювань. MNNG (метилнітронітро-зогуанідін) - це алкілувальна речовина, яка широко використовується у експериментах для індукції мутацій та апоптозу.
Середні терапевтичні дози розраховувалися на площу поверхні тіла: цисплатін - 90 мг/м2, фотемустин - 50 мг/м2, ломустин - 40 мг/м2. Дозу препарату, нанесеного до кожної лунки розраховували, виходячи з площі поверхні лунки, середньої терапевтичної дози препарату і концентрації його у стоковому розчині: цисплатін - 3,8 мкг/мл, фотемустин - 24 мкг/ мл, ломустин - 3,2 мкг/мл. Середня токсична доза MNNG підбиралася експериментальним шляхом на клітинних лініях в умовах in vitro, виходячи з об’єму поживного середовища у лунці - 100 мкл: MNNG - 5 мкг/мл. Концентрація 06-бензилгуаніну у стоковому розчині була 50 мг/мл. Розрахунок дози інгібітору також вівся, виходячи з терапевтичної дози у перерахунку на площу лунки: 06-бензилгуанін - 60 мг/м2.
Перерахунок дози речовин проводився на площу лунки планшету, що дорівнювала 44 мм2. Кожен препарат вносився у чотирьох концентраціях:
Середня терапевтична.
1. У 2 рази менша за середню терапевтичну.
2. У 2 рази більша за середню терапевтичну.
3. У 4 рази більша за середню терапевтичну.
4. Клітини висівалися у кількості 5000 клітин у 50 мкл середовища на кожну лунку. Підрахунок концентрації клітин у середовищі проводився попередньо у камері Горяєва. Коли клітини прикріплювалися до поверхні, у частину лунок до поживного середовища додавався 06-бензилгуанін у вищевказаній дозі. Через добу після внесення інгібітору активності у лунки вносилося по 50 мкл поживного середовища, що містило цитотоксичні речовини у відповідних концентраціях. Оцінка життєздатності проводилася на третю добу за допомогою МТТ-забарвлення.
МТТ - це жовтий водорозчинний тетразолієвий барвник, що під дією живих клітин перетворюється на червоний формазановий продукт, який нерозчинний у водних розчинах. У лунки нами вносилося по 15 мкл МТТ без заміни середовища. Потім планшети інкубувалися 4 год у зволожених умовах при температурі +37°С і 5 % С02. Після інкубації середовище з МТТ-барвником не видаляли, а самі лунки двічі промивалися DMSO (по100 мкл). Потім вимірювали поглинання на планшетному сканері BioRad (США) при довжині хвилі 570 нм.
Результати досліджень та їх обговорення. При культивуванні in vitro клітинні лінії виявилися чутливими до хіміопрепаратів. Чутливими клітини вважалися при різниці кількості живих клітин у контролі
і з препаратом більш ніж 12 %. Клітинна лінія Нер-2 була більш чутливою до дії усіх цитотоксичних речовин, ніж и373. Особливо сильним цитотоксичний ефект був у МІЧІЧО і цисплатіна, фотемустин і ломустин виявилися менш ефективними. Серед представлених речовин МІЧІЧО має найбільший ал-кілувальний ефект, тому не дивно, що він проявив більшу цитотоксичність, ніж фотемустин і ломустин. Пошкодження, спричинені цисплатіном, усуваються декількома системами репарації. Порушення функції будь-якої з них може призвести до неефективності репарації і загибелі клітини. Тому цисплатін теж має сильний цитотоксичний ефект.
О6-бензилгуанін посилював дію хіміопрепаратів, хоча і сам знижував життєздатність клітин. Причому, спостерігалася негативна кореляція (Р=-0,015) між наявністю інгібітора, цитотоксичність препарату та його дозою. Найбільше підвищення цитотоксичнос-ті при додаванні О6-бензилгуаніну спостерігалося у препаратів, до яких клітини були найменш чутливими - ломустину і фотемустину. Крім того, чим менша була доза будь-якого хіміопрепарату, тим більше О6-бензилгуанін посилював його ефект. Для фотемустину значення Р=0,0065, а для ломустину Р=0,00016. При наявності цитотоксичних речовин у дозах, що перевищували середню терапевтичну, різниця між кількістю живих клітин при додаванні 06-бензилгуаніну і без нього була, але вона не відповідала найвищім критеріям достовірності (Р<0,05). Крім того, при високих дозах цитостатиків кількість клітин виходила на плато. Це явище пояснюється присутністю пулу хіміорезистентних клітин і утворенням рівноваги між кількістю алкільних радикалів і молекул усуваючи їх речовин.
Типовий результат представлено на рис. По осі у відмічений відсоток живих клітин, а по осі х - дози речовин під номерами:
Контроль.
1. 0,5 середньої терапевтичної дози.
2. Середня терапевтична доза.
3. У 2 рази більша доза за середню терапевтичну.
4. У 4 рази більша доза за середню терапевтичну.
120 100 80
1 2 3 4 5
Рис. Цитотоксичний ефект цисплатіну при культивуванні клітинної лінії и373 з додаванням Об-бензилгуаніну і без нього. Пояснення у тексті.
Висновки. Інгібітор активності МОМЇ 06-бензилгуанін підвищують чутливість пухлинних клітин до дії алкілувальних хіміопрепаратів. Причому найбільший ефект виявляється на невеликих дозах препарату - в межах середньої терапевтичної дози (Р<0,05 для фотемустину і Р<0,001 для ломустину). Це пов’язано з тим, що високі дози алкілувальних сполук виснажують запаси МОМЇ, який, як відомо, не здатен реактивуватися знову. Коли весь МОМЇ у клітині вичерпано, а алкілувальної речовини багато, нові пошкодження ДНК не відновлюються і клітина гине. Аналогічними причинами пояснюється незначна (в межах статистичної похибки) ефективність інгібітору при використанні МІЧІЧО. Ця сполука є сильним алкілятором, спричиняє більші пошкодження ДНК у порівнянні з фотемустином і ломустином. Терапевтична і токсична дози МІЧІЧО мало відрізняються одна від одної. Саме тому він не використовується у практичній медицині.
Таким чином, 06-бензилгуанін доцільно поєднувати з невисокими дозами хіміопрепаратів. Це дозволяє не тільки добитися максимального ефекту від комбінації двох препаратів, але й зменшити вірогідність пригнічення гемопоезу і розвитку вторинних лейкозів. Через інактивацію МОМЇ гемопо-етичних клітин вони стають більш чутливими до дії
алкілувальних сполук. З платиновими препаратами поєднувати введення O6-бeнзилгyaнiнy недоцільно, бо метилування ДНК - лише один з декількох механізмів їх дії. Інактивація MGMT не відіграє важливої ролі у захисті клітин від дії платинових сполук. O6-бензилгуанін здатен зв’язуватися з глутатіоном, який теж усуває розриви ДНК, викликані платиновими агентами, але спорідненість до глутатіону у O6-бензилгуаніну низька. ^ому ми можемо спостерігати лише тенденцію до підвищення чутливості клітин до цисплатіну в присутності O6-бeнзилгyaнiнy.
Перспективи подальших досліджень. У подальшій роботі планується дослідити ефект O6-бензилгуаніну на первинних пухлинних лініях, які отримані від пацієнтів з такими ж типами пухлин. Taкoж планується вивчити дію комбінації препаратів in vitro на ксенотрансплататах злоякісних гліом у мишей.
Автор висловлює подяку співробітникам інституту молекулярної біології і генетики НАН України Т. О. Рубан та Л. Л. Лукаш за допомогу у плануванні експерименту, О. Степаненку за надання клітинної лінії U373 (гліома людини), співробітниці Інституту нейрохірургії ім. А. П. Ромоданова НАМН України за надання хіміопрепаратів.
Список літератури
1. Baer J. C. Depletion of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase correlates with potentiation of temozolomide and CCNU toxicity in human tumour cells / J. C. Baer, А. A. Freeman, E. S. Newlands // Br. J. Cancer. - 1993. - № 67. - P. 1299-1302.
2. De Azevedo W. F. Inhibition of cyclin-dependent kinases by purine analogues: crystal structure of human cdk2 complexed with roscovitine / W. F. De Azevedo, S. Leclerc // Eur. J. Biochem. - 1997. -№ 243. - P. 518-526.
3. Dolan M. E. O6-benzylguanine and its role in chemotherapy / M. E. Dolan, A. E. Pegg. // Clin. Cancer. Res. -1997. -№ 3. -
P. 837-847.
4. Fichtinger-Schepman А. M. Cisplatin- and carboplatin-DNA adducts: is PT-AG the cytotoxic lesion? / M. Fichtinger-Schep-man, H. C. van Dijk-Knijnenburg. // Carcinogenesis (Lond.). - 1995. -№ 16. - P. 2447-2453.
5. Fishel M. L. Role of glutathione and nucleotide excision repair in modulation of cisplatin activity with O6-benzylguanine /
M. L. Fishel, M. P. Gamcsik, S. M. Delaney // Cancer Chemother. Pharmacol. - 2005. - Vol. 55, № 4. - P. 333-342.
6. Gerson S. L. MGMT: its role in cancer aetiology and cancer therapeutics / S. L. Gerson // Nat. Rev. Cancer. - 2004. -№ 4. -
P. 296-307.
7. Keir S. T. O6-benzylguanine-mediated enhancement of nitrosourea activity in Mer-central nervous system tumor xenografts-implications for clinical trials / S. T. Keir, M. E. Dolan, A. E. Pegg // Cancer Chemother. Pharmacol. - 2000. -№ 45. - P. 437-440.
8. Pepponi R. The effect of O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase and mismatch repair activities on the sensitivity of human melanoma cells to temozolomide, 1,3-bis(2-chloroethyl)1-nitro-sourea, and cisplatin / R. Pepponi // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2003. -№ 304. - P. 661-668.
9. Sasai K. O6-methylguanine-DNA methyltransferase is downregulated in transformed astrocyte cells: implications for antiglioma therapies / K. Sasai, T. Akagi, E. Aoyanagi // Mol. Cancer. - 2007. - № 6. - P. 36.
УДК 612. 1/. 8. 57. 042. 2
ПОСИЛЕННЯ ЦИТОТОКСИЧНОГО ЕФЕКТУ АЛКІЛУ ВАЛЬНИХ ХІМІОПРЕПАРАТІВ ПІД ВПЛИВОМ Об-бензилгуаніну
Шапошник Л. А.
Резюме. Рівень репаративного ензиму 06-метилгуанін-ДНК метилтрансферази (МОМЇ) у пухлинних клітинах є одним з головних факторів їх чутливості до дії алкілувальних хіміопрепаратів. Інгібітор активності МОМЇ 06-бензилгуанін інактивує ензим і робить клітини більш чутливими до алкілувальних речовин. У даній роботі вивчалася індукція 06-бензилгуаніном цитотоксичного ефекту алкілувальних речовин.
Ключові слова: 06-метилгуанін-ДНК метилтрансфераза, 06-бензилгуанін, алкілувальні хіміопрепарати, цитотоксичний тест.
УДК 612. 1/. 8. 57. Q42. 2
ПОТЕНЦИИРОВАНИЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКОГО ЭФФЕКТА АЛКИЛИРУЮЩИХ ХИМИОПРЕПАРАТОВ ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ Об-бензилгуанина
ШапошникЛ. А.
Резюме. Уровень репаративного энзима O6-мeтилгyaнин-ДHК метилтрансферазы (MGMT) в опухолевых клетках - один из главных факторов их чувствительности к действию алкилирующих химиопрепаратов. Ингибитор активности MGMT O6-бeнзилгyaнин инактивирует энзим и делает клетки более чувствительными к алкилирующим веществам. В данной работе изучалась индукция O6-бeнзилгyaнинoм цитотоксического эффекта алкилирующих веществ.
Ключевые слова: O6-мeтилгyaнин-ДHК метилтрансфераза, O6-бeнзилгyaнин, алкилирующие химиопрепараты, цитотоксический тест.
UDC 612. 1/. 8. 57. Q42. 2.
Enhancement Of Alkylating Chemotherapeutic Drugs-induced Cytotoxicity By Об-benzyiguanine
Shaposhnyk L. Л.
Summary. The level of repair enzyme O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) in cancer cells is a one of the main factors of their sensitivity to the action of alkylating chemotherapeutic drugs. The MGMT inhibitor of activity O6-benzylguanine inactivates enzyme and makes cells more sensitive to alkylating agents. In this paper we studied the induction of cytotoxic effect of alkylating agents by O6-benzyguanine.
Key words: O6-methylguanlne-DNA methyltransferase, O6-benzylguanlne, alkylating chemotherapeutic drugs, cytotoxic analysis.
Стаття надійшла 11.09.2012 р.
Рецензент - проф. Дубінін С. І.
