МЕТИЛИРОВАНИЕ ОПУХОЛЕАССОЦИИРОВАННЫХ ГЕНОВ ПРИ ПЛОСКОКЛЕТОЧНОМ РАКЕ ГОЛОВЫ И ШЕИ Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

Original report

DOI: 10.17650/2222-1468-2022-12-4-61-70

C«D

Метилирование опухолеассоциированных генов при плоскоклеточном раке головы и шеи

С.В. Куревлев1, Л.В. Цховребова1, А.В. Агаджанян1, Т.Х. Фатхудинов1, К.Б. Гордон1, 2, М.М. Азова1

ФГАОУВО «Российский университет дружбы народов», Россия, 117198 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 6; 2Медицинскийрадиологический научный центр им. А.Ф. Цыба — филиал ФГБУ«Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Минздрава России; Россия, 249036 Обнинск, ул. Королева, 4

Контакты: Лейла Вахтанговна Цховребова [email protected]

Введение. Злокачественные новообразования органов головы и шеи представляют собой гетерогенную группу злокачественных опухолей различной этиологии, молекулярные механизмы возникновения которых остаются не до конца изученными.

Цель исследования - изучение статуса метилирования промоторной области ряда опухолеассоциированных генов (RASSF1A, RASSF2, RASSF5, CDO1, MESTи WIF1) у больных плоскоклеточным раком головы и шеи. Материалы и методы. Количественная оценка уровня метилирования генов проводилась с использованием методов бисульфитной конверсии и метил-чувствительного анализа кривых плавления с высоким разрешением. В исследование были включены 25 пациентов (21 мужчина и 4 женщины) с плоскоклеточным раком головы и шеи. Результаты. Выявлены достоверные различия в уровнях метилирования ДНК в генах CDO1 и WIF1 в опухолевых и нормальных тканях во всех группах и подгруппах пациентов (рак гортани и другие виды рака, ороговевающий и неороговевающий плоскоклеточный рак головы и шеи, первичная и рецидивная опухоли, курящие и некурящие). Также установлено, что уровень метилирования в гене CDO1 в опухолевой ткани выше в подгруппах пациентов с опухолями Т4 и Т3 по сравнению с пациентами с опухолями Т2.

Заключение. Повышение уровня метилирования генов CDO1 и WIF1 и, следовательно, изменение их экспрессии входят в число молекулярных механизмов развития плоскоклеточного рака головы и шеи и могут быть рассмотрены в качестве прогностических и диагностических маркеров данной патологии.

Ключевые слова: метилирование ДНК, опухолеассоцированные гены, плоскоклеточный рак головы и шеи

Для цитирования: Куревлев С.В., Цховребова Л.В., Агаджанян А.В. и др. Метилирование опухолеассоциированных генов при плоскоклеточном раке головы и шеи. Опухоли головы и шеи 2022;12(4):61-70. DOI: 10.17650/2222-14682022-12-4-61-70

Methylation of the tumor associated genes in head and neck squamous cell carcinoma

S. V. Kurevlev1, L. V. Tskhovrebova1, A.V. Aghajanyan1, T.Kh. Fatkhudinov1, K.B. Gordon1'2, M.M. Azova1

'Peoples'Friendship University of Russia; 6Miklukho-Maklaya St., Moscow 117198, Russia;

2A.F. Tsyb Medical Radiological Research Center — branch of the National Medical Research Center of Radiology, Ministry of Health of Russia; 4Koroleva St., Obninsk 249036, Russia

Contacts: Leila Vakhtangovna Tskhovrebova [email protected]

Introduction. Head and neck cancer is a heterogenous group of malignant tumors of different etiologies, molecular mechanisms of which are still insufficiently studied.

Aim. Investigation of DNA methylation status of some tumor associated genes (RASSF1A, RASSF2, RASSF5, CDO1, MEST and WIF1) in patients with head and neck squamous cell carcinoma.

Materials and methods. The DNA methylation level of normal and tumor tissues was analyzed using bisulfite conversion and methylation-sensitive high-resolution melting in 25 patients (21 men and 4 women) diagnosed with neck squamous cell carcinoma.

Results. There were significant differences in levels of DNA methylation between tumor and normal tissues in the CDO1 and WIF1 genes in all groups and subgroups of patients (larynx and other cancers, squamous cell carcinoma keratinizing and non-keratinizing, primary and recurrent tumor, smokers and non-smokers). The methylation level in the CDO1 gene in tumor tissue was significantly increased in the T4 and T3 stage subgroups compared to T2.

Conclusion. The increased level of methylation of the CDO1 and WIF1 genes, as well as changes in their expression are among the molecular mechanisms involved in the neck squamous cell carcinoma development. They can be considered as prognostic and diagnostic markers for this pathology.

Keywords: DNA methylation, tumor-associated genes, head and neck squamous cell carcinoma

For citation: Kurevlev S.V., Tskhovrebova L.V., Aghajanyan A.V. et al. Methylation of the tumor associated genes in head and neck squamous cell carcinoma. Opukholi golovy i shei = Head and Neck Tumors 2022;12(4):61-70. (In Russ.). DOI: 10.17650/2222-1468-2022-12-4-61-70

Введение

В настоящее время значительный интерес для диагностики, прогнозирования и профилактики онкологических заболеваний представляет изучение молеку-лярно-генетических и эпигенетических маркеров. Опухоли головы и шеи (ОГШ) — гетерогенная группа злокачественных новообразований разной этиологии, объединенных анатомическим расположением, общими факторами риска, сходными клинической картиной, принципами лечения и прогнозом. Большинство злокачественных ОГШ представлены плоскоклеточным раком. Аденокарциномы встречаются реже и могут развиваться из эпителия слюнных желез, щитовидной железы и придатков кожи. Неэпителиальные новообразования составляют около 18 % от общего числа опухолей данной локализации.

В настоящее время плоскоклеточный рак головы и шеи (ПРГШ) занимает 6-е место среди наиболее распространенных видов рака в мире. В последние годы отмечается рост заболеваемости данной патологией и связанной с ней смертности [1—3]. Плоскоклеточный рак головы и шеи имеет мультифакториальный характер. Показано, что у курильщиков риск развития заболевания в 10 раз выше, чем у некурящих, а курение совместно с частым употреблением алкоголя увеличивают его более чем в 35 раз [4]. К факторам риска также относят воздействие ультрафиолетового и ионизирующего излучений, различных токсичных соединений, ослабление иммунной системы, диету с низким содержанием витаминов А и В, возраст старше 40 лет, мужской пол, некоторые вирусные инфекции. Кроме того, наличие рака головы и шеи в анамнезе увеличивает риски повторного возникновения данной патологии в будущем [5—7].

Несмотря на многочисленные исследования, механизмы, лежащие в основе ПРГШ, до сих пор остаются не до конца выясненными. В последние годы появилось много данных, подчеркивающих важную роль эпигенетических факторов в онкогенезе, к числу которых относятся метилирование ДНК, модификация гистонов, ремоделирование хроматина и воздействие некодирующих РНК [8, 9]. Следует отметить, что метилирование ДНК является наиболее изученным эпигенетическим механизмом при ПРГШ. При этом наблюдаются изменения в паттернах метилирования как генома в целом, так и в отдельных генах, что может быть использовано для выявления новых биомаркеров

заболевания [10]. Для исследования можно применять различный биоматериал, включая жидкие биоптаты, что представляет собой неинвазивную альтернативу для раннего выявления рака.

В ряде работ показано гиперметилирование про-моторных областей различных генов в образцах слюны, сыворотки и плазмы крови пациентов с ПРГШ [11—13]. Так, C. Zhou исследовал 27 аберрантно метилированных генов с измененной экспрессией и продемонстрировал, что метилирование FAM135B является благоприятным независимым прогностическим маркером повышения общей выживаемости пациентов с ПРГШ [14]. В настоящее время гиперметилирование промоторов генов-супрессоров опухолей является наиболее охарактеризованным эпигенетическим событием в канцерогенезе. В работе R. Noorlag и соавт. описан ряд генов, изменение метилирования которых способствует развитию ПРГШ [15].

Цель исследования — изучение статуса метилирования ДНК некоторых опухолеассоциированных генов (RASSF1A, RASSF2, RASSF5, CDO1, MEST, WIF1) у пациентов с ПРГШ. Эти гены играют большую роль в регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки и апоптоза, и их нарушение может привести к развитию злокачественных новообразований (табл. 1).

Материалы и методы

В исследовании приняли участие 25 пациентов (21 мужчина и 4 женщины) с ПРГШ, проходившие обследование и лечение в Медицинском радиологическом научном центре им. А.Ф. Цыба и Московском научно-исследовательском онкологическом институте им. П.А. Герцена (Москва) — филиалах Национального медицинского исследовательского центра радиологии Минздрава России.

Период наблюдения за пациентами варьировал от 3 до 9 мес. Характеристика больных представлена в табл. 2. Средний возраст мужчин составил 58 лет (30^72 года), женщин — 68 дет (59^81 год). В 20 случаях диагностирован первичный ПРГШ, в 5 — рецидив опухоли после терапии. Плоскоклеточный рак горла был обнаружен у 14 пациентов, верхнечелюстной пазухи — у 7, языка — у 3. У 1 больного наблюдался плоскоклеточный рак ротовой полости. Неороговевающий тип опухоли выявлен в 9 случаях, ороговевающий — в 16. Девять из 25 пациентов были курящими.

Таблица 1. Характеристика исследованных генов Table 1. Characteristic of studied genes

Ген

Hin гена

Локализация (хромосома) ,ocatio omoso

Транскрипт

MTM

Функция гена

Сигнальный путь гена

¡ene pathway

Cysteine dioxygenase type 1 (CDO1, CDO-I) 5q22.3 NM_001323565.2 603943 Белок-кодиру-ющий Protein-coding Опухолевый супрессор Tumor suppressor Ингибитор сигнального пути Wnt Inhibits Wnt signaling

Mesoderm specific transcript (MEST, PEG') 7q32.2 NM_001253900.1 601029 Белок-кодиру-ющий Protein-coding Опухолеассоци- ированный Cancer associated Неизвестно Unclear

Ras association domain family member 1 (RASSF1,123F2, RDA32, NORE2A, RASSF1A, REH3P21) 3p21.31 NM_001206957.2 605082 Белок-кодиру-ющий Protein-coding Опухолевый супрессор Tumor suppressor Проапоптотиче-ский путь Pro-apoptotic signaling

Ras association domain family member 2 (RASSF2, RAPL, Maxp1, NORE1, NORE1A, NORE1B, RASSF3) 20p13 NM_182663.4 609492 Белок-кодиру-ющий Protein-coding Опухолеассоци- ированный Cancer associated Проапоптотиче-ский путь Pro-apoptotic signaling

Ras association domain family member 5 (RASSF5, RAPL, Maxp1, NORE1, NORE1A, NORE1B, RASSF3) 1q32.1 NM_182663.4 607020 Белок-кодиру-ющий Protein-coding Опухолевый супрессор Tumor suppressor Проапоптотиче-ский путь Pro-apoptotic signaling

WNT inhibitory factor 1 ( WIF1, WIF-1)

12q14.3

NM 007191.5 605186

Белок-кодирующий Protein-coding

Опухолевый супрессор Tumor suppressor

Ингибитор сигнального пути Wnt Inhibits Wnt signaling

Биоматериал. Образцы опухолевой и нормальной тканей от каждого пациента были получены во время хирургического вмешательства и хранились при температуре —20 oC.

Выделение ДНК. Выделение ДНК из биоматериала осуществляли на микроколонках (K-SORB, ООО «Син-тол», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.

Анализ метилирования ДНК. Бисульфитную конверсию ДНК проводили с использованием набора EZ DNA Methylation-Lightning kit (Zymo Research, Irvine, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Оценка метилирования промоторных областей исследуемых генов была выполнена методом метил-чувствительного анализа кривых плавления с высоким разрешением (methylation-sensitive high resolution melting, MS-HRM) на базе амплификатора CFX 96 (BioRad, США).

Праймеры для реакции были подобраны с помощью программы Primer Blast (табл. 3). Для проведения двухступенчатой полимеразной цепной реакции использовалась готовая реакционная смесь компании ООО «Синтол» (Россия). Программа амплификации: 95 °С —

5 мин; (95 °С - 15 с, 60 °С - 30 с, 72 °С - 45 с) х 30 циклов; (95 °С - 15 с, 50 °С - 30 с, 72 °С - 45 с) х 25 циклов [16]. Далее к полученным продуктам был добавлен интеркалирующий краситель EVAGreen (ООО «Синтол», Россия). Каждый образец имел две повторности. Условия для построения кривой плавления: 95 °С - 30 с; 60 °С - 10 мин, анализ плавления в диапазоне 60 -90 °С с шагом 0,2 °С. Метил-чувствительный анализ кривых плавления с высоким разрешением проводили с использованием программного обеспечения Precision Melt Analysis Software (BioRad, США). Количественный уровень метилирования оценивался по флуоресценции, выраженной в относительных единицах флуоресценции (RFU) [17].

Статистический анализ. Статистическая обработка данных выполнена с использованием программного обеспечения R-language. Различия считали достоверными прир <0,05.

Результаты

Результаты анализа уровня метилирования про-моторных областей исследуемых генов в общей группе пациентов представлены на рис. 1. В нормальных

Таблица 2. Характеристика пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи Table 2. Characteristics of patients

Пациент Пол Возраст, лет Код по МКБ-10 Локализация опухоли

■■ KD-lll code

1 M M 62 С32.0 Гортань Larynx

2 M M 50 С02.1 Язык Tongue

3 M M 72 С32.8 Гортань Larynx

4 M M 57 С32.8 Гортань Larynx

5 M M 49 С32.0 Гортань Larynx

6 M M 61 С32.9 Гортань Larynx

7 M M 64 С32.0 Гортань Larynx

8 M M 52 С02.1 Язык Tongue

9 M M 30 С03.0 Верхнечелюстная пазуха МахШагу sinus

10 M M 62 С32.0 Гортань Larynx

И M M 58 С32.8 Гортань Larynx

12 ж F 59 С02.1 Язык Tongue

13 M M 41 С31.0 Верхнечелюстная пазуха МахШагу sinus

14 ж F 81 С32.8 Гортань Larynx

Стадия по классификации TNM Иш опухоли Морфологическая форма опухоли Курение ■■И

TNM classification ■шин Histological glade

T3N0M0 Первичная Primary OporoBeBaioiunn nP SCO keratinizing Нет No

T1N0M0 Первичная Primary OporoBeBaioiunn nP SCO keratinizing Нет No

T4aN0M0 Первичная Primary OporoBeBaioiunn nP SCC keratinizing Да Yes

T3N1M0 Первичная Primary OporoBeBaioiunn nP SCO keratinizing Да Yes

T3N1M0 Первичная Primary HeoporoBeBaioinHH nP SCC non-keratinizing Да Yes

T3N0M0 Первичная Primary OporoBeBaioiunn nP SCC keratinizing Нет No

T3N0M0 Первичная Primary OporoBeBaioinHH nP SCC keratinizing Да Yes

T3N1M0 Первичная Primary HeoporoBeBaioiniin nP SCC non-keratinizing Нет No

T4aN0M0 Первичная Primary HeoporoBeBaioiunn nP SCC non-keratinizing Нет No

T3N0M0 Первичная Primary HeoporoBeBaioiunn nP SCC non-keratinizing Нет No

T4aN0M0 Первичная Primary HeoporoBeBaioinHH nP SCC non-keratinizing Нет No

T2N0M0 Первичная Primary HeoporoBeBaioiunn nP SCC non-keratinizing Нет No

T4aN0M0 Рецидив Recurrent HeoporoBeBaioinHH nP SCC non-keratinizing Нет No

T4aN2bM0 Первичная Primary HeoporoBeBaioiunn nP SCC non-keratinizing Нет No

23

Ж F

66

Histological glade

Окончание табл. 2

The end of table 2

Курение

ШШ

15 M M 69 C32.0 Гортань Larynx T2N0M0 Первичная Primary Неороговевающий ПР SCC non-keratinizing Да Yes

16 M M 67 C31.0 Верхнечелюстная пазуха Maxillary sinus T4aN0M0 Первичная Primary Неороговевающий ПР SCC non-keratinizing Нет No

17 M M 64 C32.8 Гортань Larynx T3N0M0 Первичная Primary Неороговевающий ПР SCC non-keratinizing Да Yes

18 M M 61 C31.8 Верхнечелюстная пазуха Maxillary sinus T4aN0M0 Первичная Primary Неороговевающий ПР SCC non-keratinizing Нет No

19 M M 70 C32.8 Гортань Larynx T2N0M0 Первичная Primary Неороговевающий ПР SCC non-keratinizing Нет No

20 M M 70 C32.8 Гортань Larynx T4aN2aM0 Первичная Primary Неороговевающий ПР SCC non-keratinizing Да Yes

21 ж F 66 C04.1 Ротовая полость Oral cavity T3N1M0 Первичная Primary Неороговевающий ПР SCC non-keratinizing Нет No

22 M M 64 C31.8 Верхнечелюстная пазуха Maxillary sinus T3N0M0 Рецидив Recurrent Неороговевающий ПР SCC non-keratinizing Да Yes

CO 2.1

Верхнечелюстная пазуха Maxillary sinus

T3N0M0

Рецидив Ороговевающий ПР Нет

Recurrent SCO keratinizing No

23

M M

69

C32.:

Гортань Larynx

T3N0M0

Первичная Неороговевающий ПР Да

Primary SCO non-keratinizing Yes

25

Ж F

37

C03.0

Верхнечелюстная пазуха Maxillary sinus

T4N0M0

Первичная Ороговевающий ПР Нет

Primary SCO keratinizing No

Примечание. M — мужской пол, Ж— женский пол; ПР — плоскоклеточный рак; МКБ-10 — Международная классификация болезней 10-го пересмотра; TNM — Tumor, Nodus and Metastasis.

Note. M male, T - female; SCC - squamous cell carcinoma; ICD-10 - International Classification of Diseases of the 10th revision; TNM - Tumor, Nodus and Metastasis.

Таблица 3. Праймеры, использованные для оценки метилирования генов Table 3. Primer sequences used for methylation specific polymerase chain reaction

Ген Нуклеотидные последовательности прямых праймеров (5' ^ 3') Нуклеотидные последовательности обратных праймеров (5' ^ 3') Размер продукта, п. н.

Gene

Forward primer sequence (5' ^ 3') Reverse primer sequence (5' ^ 3') Product size (bp)

CDO1 GGGAGGATGA ATTTTATAGATTTG TAAACTTCCATA ATAACCTACACCTC 396

MEST ATTAGGGGA AGGGTTGAAATA CAAATAAAACCTT ACCTACAAAACTC 416

RASSF1 GGGTTAAGGTAT TTTAAAGATAAGAA ACAACTAAT CCCTAACC 389

RASSF2 GGTGAGGGGAGTTA GTTTATTTTTT CAACCCCTTAACCT TTTTCAAC 313

RASSF5 AAAGAGGTAGGGT TGAAGGTTTAG CCTACCTTCACACT TACTAATACAAC 823

WIF1 GAGTGATGTT TTAGGGGT CCTCAACCA AAACTATTCC 464

COG1 MEST RASSF1 RASSF2 Гены I Genes

RASSF5 WIF1

»Достоверные различия между уровнями метилирования генов в опухолевой (ОТ) и нормальной (НТ) тканях (p <0,05) / *Significant differences between tumor and normal tissue (p <0.05)

Рис. 1. Средний уровень метилирования исследуемых генов в опухолевой и нормальной тканях всех пациентов

Fig. 1. Average level of DNA methylation of the studied genes in tumor and normal tissues in all patients

и опухолевых тканях обнаружены достоверные различия уровней метилирования генов CDO1 (0,40 ± 0,19 и 0,26 ± 0,10 соответственно) и WIF1 (0,30 ± 0,18 и 0,15 ± 0,07 соответственно). Для более детального анализа пациенты были разделены на подгруппы. Полученные данные представлены в табл. 4. У больных раком гортани, плоскоклеточным ороговевающим раком, рецидивирующей опухолью и у курильщиков выявлены значимые различия уровней метилирования гена CDO1 в опухолевой и нормальной тканях. Во всех исследованных подгруппах, за исключением пациентов с плоскоклеточным неороговевающим раком, уровень метилирования гена WIF1 был достоверно выше в опухолевых тканях. В общей группе больных и в подгруп-

о р

>

О,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

COG1 MEST RASSF1 RASSF2 RASSF5 WIF1

Гены I Genes

T4 T3 T2

RASSF5

WIF1

CDO1 MEST RASSF1 RASSF2 Гены / Genes

»Достоверное различие между уровнем метилирования опухолевой и нормальной ткани (p <0,05) / *Significant differences between tumor and normal tissues (p <0.05)

Рис. 2. Средний уровень метилирования ДНК в опухолевой (а) и нормальной (б) тканях пациентов с различными стадиями по классификации Tumor, Nodus and Metastasis (TNM)

Fig. 2. Average level of DNA methylation in tumor (a) and normal (б) tissues in patients with different Tumor, Nodus and Metastasis (TNM) classification

пах достоверных различий в уровнях метилирования генов MEST, RASSF1, RASSF2 и RASSF5 не наблюдалось.

б

Таблица 4. Средний уровень метилирования ДНК в опухолевой и нормальной тканях пациентов разных подгрупп, М + т (разброс) Table 4. Average level of DNA methylation in tumor and noma! tissue ofpatients of different subgroups

Ген Образцы ДНК ■Щ Рак гортани (я = 14) Рак другой локализации Ороговевающий ПР (п = 9) Неороговевающий ПР (п = 16) Первичный рак (п = 20) Рецидив рака (п = 5) Курящие (п = 9) Некурящие (п = 16)

(jene Larynx cancer (и = 14) Other cancers («=П) SCC keratinizing (« = 9) SCC non-keratinizing (и = 16) Primary cancer (и = 20) Non-smokers (м = 16)

CDOl от т 0,39 ± 0,18а (0,06-0,76) 0,46 + 0,21 (0,07-0,71) 0,44 + 0,17а (0,17-0,66) 0,42 + 0,22 (0,06-0,76) 0,40 + 0,19 (0,06-0,71) 0,53 + 0,22а (0,26-0,76) 0,51 + 0,19аЬ (0,19-0,76) 0,38 + 0,19 (0,06-0,71)

HT N 0,22 ± 0,08 (0,11-0,37) 0,30 + 0,10 (0,14-0,53) 0,26 + 0,08 (0,11-0,38) 0,26 + 0,11 (0,14-0,53) 0,25 + 0,10 (0,11-0,53) 0,28 + 0,08 (0,17-0,38) 0,25 + 0,08 (0,11-0,37) 0,26 + 0,10 (0,14-0,53)

MEST ОТ т 0,19 + 0,07 (0,09-0,31) 0,24 + 0,08 (0,12-0,34) 0,18 + 0,08 (0,10-0,31) 0,23 + 0,07 (0,09-0,34) 0,21 + 0,08 (0,09-0,34) 0,24 + 0,06 (0,15-0,30) 0,19 + 0,07 (0,10-0,30) 0,23 + 0,08 (0,09-0,34)

HT N 0,18 + 0,08 (0,07-0,28) 0,23 + 0,08 (0,02-0,31) 0,20 + 0,08 (0,07-0,30) 0,21 + 0,08 (0,02-0,31) 0,20 + 0,08 (0,02-0,31) 0,22 + 0,06 (0,13-0,29) 0,17 + 0,07 (0,07-0,27) 0,22 + 0,08 (0,02-0,31)

RASSF1 ОТ т 0,26 ± 0,20 (0-0,58) 0,30 + 0,15 (0,13-0,59) 0,27 + 0,23 (0,04-0,59) 0,29 + 0,16 (0-0,54) 0,26 + 0,18 (0-0,58) 0,37 + 0,18 (0,23-0,59) 0,25 + 0,22 (0-0,58) 0,27 + 0,16 (0,03-0,59)

HT N 0,21 ± 0,07 (0,07-0,33) 0,31 + 0,17 (0,10-0,63) 0,20 + 0,18 (0,07-0,33) 0,24 + 0,17 (0,08-0,63) 0,20 + 0,17 (0,07-0,33) 0,28 + 0,14 (0,12-0,51) 0,24 + 0,21 (0,07-0,51) 0,23 + 0,15 (0,10-0,63)

RAS Si'2 ОТ т 0,39 + 0,16 (0-0,56) 0,47 + 0,06 (0,36-0,56) 0,44 + 0,05 (0,34-0,49) 0,42 + 0,16 (0-0,56) 0,41 + 0,14 (0-0,56) 0,49 + 0,04 (0,47-0,56) 0,44 + 0,04 (0,39-0,49) 0,42 + 0,16 (0-0,56)

HT N 0,44 + 0,06 (0,34 + 0,55) 0,48 + 0,08 (0,32-0,57) 0,45 + 0,06 (0,38-0,57) 0,46 + 0,08 (0,32-0,57) 0,45 + 0,07 (0,32-0,57) 0,49 + 0,07 (0,49-0,57) 0,44 + 0,07 (0,34-0,55) 0,47 + 0,07 (0,32-0,57)

RASSF5 ОТ т 0,31 + 0,13 (0-0,46) 0,40 + 0,05 (0,29-0,45) 0,34 + 0,07 (0,22-0,45) 0,36 + 0,13 (0-0,46) 0,33 + 0,12 (0-0,45) 0,42 + 0,03 (0,39-0,46) 0,33 + 0,09 (0,16-0,43) 0,36 + 0,12 (0-0,46)

HT N 0,35 + 0,17 (0,23-0,47) 0,39 + 0,08 (0,23-0,47) 0,35 + 0,07 (0,28-0,46) 0,39 + 0,08 (0,23-0,47) 0,36 + 0,08 (0,23-0,47) 0,43 + 0,04 (0,36-0,46) 0,32 + 0,08 (0,23-0,46) 0,38 + 0,07 (0,23-0,47)

WIF1 ОТ т 0,26 + 0,18а (0,07-0,58) 0,34 + 0,17а (0,09-0,56) 0,41 + 0,19аЬ (0,08-0,58) 0,23 + 0,14 (0,07-0,56) 0,29 + 0,18а (0,07-0,58) 0,32 + 0,20а (0,09-0,56) 0,35 + 0,12а (0,08-0,58) 0,29 + 0,17а (0,07-0,58)

HT N 0,14 + 0,05 (0,04-0,22) 0,16 + 0,10 (0-0,27) 0,15 + 0,09 (0,01-0,27) 0,14 + 0,07 (0-0,26) 0,14 + 0,08 (0-0,27) 0,18 + 0,07 (0,08-0,26) 0,14 + 0,07 (0,04-0,26) 0,15 + 0,08 (0-0,27)

"Достоверные различия между опухолевой и нормальной тканями (р <0,05). Достоверные различия между подгруппами пациентов (р <0,05). Примечание. ОТ — опухолевая ткань; НТ — нормальная ткань; ПР — плоскоклеточный рак.

"Significant differences between tumor and noma! tissues (p<0.05).bSignificant differences between tumor and noma! tissues in subgroups (p <0.05). Note. T — tumor, N — noma!; SCC — squamous ce!! carcinoma.

При сравнении подгрупп в нормальной ткани различий не обнаружено, в то время как в опухолевой ткани курящих пациентов метилирование промоторной области гена CDO1 было значимо выше, чем у некурящих, а метилирование гена WIF1 оказалось выше у больных с ороговевающим плоскоклеточным раком по сравнению с пациентами с неороговевающим плоскоклеточным раком.

Средний уровень метилирования ДНК в опухолевых и нормальных тканях у пациентов, разделенных на подгруппы в зависимости от стадий заболевания по классификации Tumor, Nodus and Metastasis (TNM), представлен на рис. 2. Опухоль стадии Т4 выявлена у 9 больных, T3 — у 12, T2 — у 3. У 1 пациента было заболевание стадии T1N0M0; уровни метилирования в генах CDO1, MEST, RASSF1, RASSF2, RASSF5 и WIF1 в опухолевой ткани составили 0,36; 0,13; 0,13; 0,39; 0,41 и 0,40 соответственно, в нормальной ткани — 0,29; 0,23; 0,24; 0,51; 0,41 и 0,17 соответственно. Уровень метилирования ДНК гена CDO1 в опухолевой ткани был достоверно выше в подгруппах пациентов с опухолью Т4 и Т3 (0,48 ± 0,16 и 0,45 ± 0,22 соответственно) по сравнению с опухолью Т2 (0,21 ± 0,13). По уровням метилирования остальных генов в анализируемых подгруппах значимых различий выявлено не было.

Обсуждение

Согласно данным литературы последнего десятилетия, наряду с мутациями не меньшее значение в процессе канцерогенеза имеют эпигенетические нарушения в клетках опухолевых тканей при различных видах онкопатологии. Эпигенетические изменения могут быть определены на ранних стадиях заболевания и использованы для ранней диагностики опухолей и прогноза онкологических заболеваний. Метилирование ДНК обратимо за счет фармакологического ингибирования ДНК-метилтрансферазы и может быть молекулярной мишенью для терапии рака. Полученные нами результаты по генам CDO1, WIF-1, RASSFla, RASSF2, RASSF5 и MEST вносят вклад в изучение особенностей эпигенетического профиля опухолевых тканей при ПРГШ.

Мутации в генах, кодирующих белки в пути Wnt (Wingless / Int1), редки при раке головы и шеи, в связи с чем этот путь не считается значимым для данной патологии [18]. Однако недавние исследования показывают, что гиперактивация пути Wnt может быть результатом другого механизма, который основан на аберрантном гиперметилировании негативных регуляторов. Во многих работах продемонстрировано повышение уровня метилирования промотора и, соответственно, подавление гена CDO1 в различных опухолевых клетках [19, 20]. Метилирование промоторной области гена CDO1 достоверно коррелирует с прогрессирова-нием опухоли при первичном раке молочной железы и может быть использовано в качестве важного про-

гностического показателя [21]. Также оно ассоциировано с неблагоприятным прогнозом для пациентов с раком предстательной железы [22]. Полученные нами результаты согласуются с данными литературы, поскольку уровень метилирования промотора гена CDO1 в опухолевой ткани достоверно выше, чем в нормальной ткани, как в общей группе пациентов с ПРГШ, так и в различных подгруппах. Более того, выявлены значимые различия по данному показателю между курильщиками и некурящими.

Гиперметилирование промоторной области гена WIF-1 (ингибирующий фактор Wnt-1) часто встречается при немелкоклеточном раке легкого, хотя возраст, пол и статус курения пациентов не коррелируют со статусом метилирования [23]. Показано, что нарушение регуляции передачи сигналов Wnt может также являться одной из причин развития рака головы и шеи. Метилирование гена WIF-1, выступающего одним из антагонистов этого пути, часто связывают с развитием данной патологии [24]. Сообщалось, что промотор гена метилирован у 18 % пациентов с плоскоклеточной карциномой полости рта [25] и у 35 % — с карциномой языка [26]. Мы выявили достоверные различия между средними уровнями метилирования промотора WIF-1 в опухолевых и нормальных тканях как в общей группе пациентов, так и в подгруппах. Следует отметить, что по данному показателю наблюдались значительные различия в опухолевой ткани в подгруппах пациентов с ороговевающим и неороговевающим ПРГШ.

Семейство генов RASSF кодирует белки, содержащие домены, ассоциированные с Ras и подавляющие их активность. Недавние исследования показывают, что, помимо мутаций в генах RAS, значительную роль в развитии опухолей может играть инактивация негативных эффекторов Ras [27]. Обнаружено, что передача сигналов Ras часто активируется при плоскоклеточной карциноме полости рта, при этом наблюдается подавление RASSF2 метилированием [28]. Кроме того, было показано, что экспрессия гена подавляется и при других видах онкопатологии, включая колоректальный рак, рак желудка, легких и носоглотки [29]. RASSFla был идентифицирован как опухолевый супрессор, способный индуцировать апоптоз в опухолевых клетках. Метилирование его промоторной области является установленным эпигенетическим событием при многих типах рака, включая рак головы и шеи [30, 31].

Ген MEST относится к категории импринтирован-ных генов [32]. Была выявлена ассоциация потери им-принтинга этого гена с некоторыми типами рака. Также обнаружено, что уровни метилирования гена MEST значительно выше в большинстве опухолей первичной гепатоцеллюлярной карциномы по сравнению с неопухолевыми тканевыми аналогами [33, 34].

Несмотря на результаты ряда работ, указывающие на ассоциацию метилирования генов RASSF и MEST

с онкологическими заболеваниями, в нашем исследовании мы не обнаружили существенных различий в средних уровнях метилирования между нормальными и опухолевыми тканями для генов MEST, RASSF1, RASSF2, RASSF5. Возможно, следует повторить исследование в выборке большего объема и / или стратифицировать пациентов по иным критериям.

ЛИТЕРАТУРА /

1. Demokan S., Dalay N. Role of DNA methylation in head and neck cancer. Clin Epigenet 2011;2:123-50. DOI: 10.1007/s13148-011-0045-3

2. Злокачественные новообразования в России в 2016 году (заболеваемость и смертность). Под ред. А.Д. Каприна, В.В. Ста-ринского, Г.В. Петровой. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена — филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2018. 250 с. Malignant neoplasms in Russia in 2016 (morbidity and mortality). Ed. by A.D. Kaprin, V.V. Starinsky, G.V. Petrova. M.: P.A. Herzen Moscow State Medical Research Institute, Branch of the Federal State Budgetary Institution "NMIC of Radiology" of the Ministry of Health of Russia, 2018. 250 p. (In Russ.).

3. Siegel R.L., Miller K.D., Fuchs H.E., Jemal A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer J Clin 2022;72:7. DOI: 10.3322/caac.21708

4. Marcu L.G., Yeoh E. A review of risk factors and genetic alterations in head and neck carcinogenesis and implications for current and future approaches to treatment. J Cancer Res Clin Oncol 2009;135(10):1303—14. DOI: 10.1007/s00432-009-0648-7

5. World Health Organization. World health report 2002: reducing risks, promoting healthy life. Available at: https://www.who.int/ publications/i/item/9241562072.

6. World Health Organization. WHO global report on trends in tobacco smoking 2000—2025, 2015. Available at: https://www.who.int/ publications/i/item/who-global-report-on-trends-in-prevalence-of-tobacco-use-2000-2025-third-edition.

7. Global Cancer Observatory. International Agency for Research on Cancer. World Health Organization. Available at: https://gco.iarc.fr/ tomorrow/en/dataviz/bubbles?types=0&sexes=1_2&mode=popula tion&group_populations=0&multiple_populations=1&multiple_ca ncers=1&cancers=39&populations=903_904_905_908_909_935&a pc=cat_ca20v1.5_ca23v-1.5&group_cancers=1.

8. Gupta Sh., Kumar P., Maini J. et al. Epigenetic biomarkers in head and neck cancer. J Cancer Genetics Biomark 2018. DOI: 10.14302/ issn.2572-3030.jcgb-18-2428. Available at: https://www. researchgate.net/publication/329389358_Epigenetic_Biomarkers_ in_Head_and_Neck_Cancer.

9. Castilho R.M., Squarize C.H., Almeida L.O. Epigenetic modifications and head and neck cancer: Implications for tumor progression and resistance to therapy. Int J Mol Sci 2017;18(7):1506. DOI: 10.3390/ijms18071506

10. Ovchinnikov D.A., Cooper M.A., Pandit P. et al. Tumor-suppressor gene promoter hypermethylation in saliva of head and neck cancer patients. Transl Oncol 2012;5(5):321—6. DOI: 10.1593/tlo.12232

11. Liyanage C., Wathupola A., Muraleetharan S. et al. Promoter hypermethylation of tumorsuppressor genes p16INK4a, RASSF1A, TIMP3, and PCQAP/MED15 in salivary DNA

as a quadruple biomarker panel for early detection of oral and oropharyngeal cancers. Biomolecules 2019;9(4):148. DOI: 10.3390/ biom9040148

12. Righini C.A., de Fraipont F., Timsit J.F. et al. Tumor-specific methylation in saliva: a promising biomarker for early detection of head and neck cancer recurrence. Clin Cancer Res 2007;13(4):1179—85. DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-06-2027

Заключение

На основании полученных данных можно заключить, что повышение уровня метилирования генов CDO1 и W^F1 и, следовательно, изменение их экспрессии выступают молекулярными механизмами, способствующими развитию ПРГШ, и могут быть рассмотрены в качестве прогностических и диагностических маркеров данной патологии.

REFERENCES

13. Arantes L.M.R.B., De Carvalho A.C., Melendez M.E., Carvalho A.L. Serum, plasma and saliva biomarkers for head and neck cancer. Expert Rev Mol Diagn 2018;18(1):85-112. DOI: 10.1080/14737159.2017.1404906

14. Zhou C., Ye M., Ni S. et al. DNA methylation biomarkers for head and neck squamous cell carcinoma. Epigenetics 2018;13(4):398-409. DOI: 10.1080/15592294.2018.1465790

15. Noorlag R., van Kempen P.M.W., Moelans C.B. et al. Promoter hypermethylation using 24-gene array in early head and neck cancer better outcome in oral than in oropharyngeal cancer. Epigenetics 2014;9(9):1220-7. DOI: 10.4161/epi.29785

16. Красный А.М., Куревлев С.В., Садекова А.А. и др. Профиль метилирования генов первичной опухоли у больных люми-нальным HER2-неraтивным раком молочной железы при ме-тастазировании в регионарные лимфатические узлы. Биомедицинская химия 2021;67(1):88—94.

Krasny A.M., Kurevlev S.V., Sadekova A.A. et al. The profile of methylation of primary tumor genes in patients with luminal HER2-negative breast cancer with metastasis to regional lymph nodes. Biomedicinskaya himiya = Biomedical Chemistry 2021;67(1):88-94. (In Russ.).

17. Slomka M., Sobalska-Kwapis M., Wachulec M. et al. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping — limitations and caveats in practical case studies. Int J Mol Sci 2017;18(11):2316. DOI: 10.3390/ijms18112316

18. Yeh K.T., Chang J.G., Lin T.H. et al. Correlation between protein expression and epigenetic and mutation changes of Wnt pathway-related genes in oral cancer. Int J Oncol 2003;23(4):1001—7. DOI: 10.3892/ijo.23.4.1001

19. Brait M., Ling Sh., J. Nagpal K. et al. Cysteine dioxygenase 1 is a tumor suppressor gene silenced by promoter methylation in multiple human cancers. PLoS One 2012;7(9):e44951. DOI: 10.1371/journal.pone.0044951

20. Sjoblom T., Jones S., Wood L.D. et al. The consensus coding sequences of human breast and colorectal cancers. Science 2006;314(5797):268-74. DOI: 10.1126/science.1133427

21. Minatani N., Waraya M., Yamashita K. et al. Prognostic significance of promoter DNA hypermethylation of cysteine dioxygenase 1 (CDO1) gene in primary breast cancer. PLoS One 2016;11(1):e0144862. DOI: 10.1371/journal.pone.0144862

22. Meller S., Zipfel L., Gevensleben H. et al. CDO1 promoter methylation is associated with gene silencing and is a prognostic biomarker for biochemical recurrence-free survival in prostate cancer patients. Epigenetics 2016;11(12):871-80. DOI: 10.1080/15 592294.2016.1241931

23. Yang T.-M., Leu S.-W., Li J.-M. et al. WIF-1 promoter region hypermethylation as an adjuvant diagnostic marker for non-small cell lung cancer-related malignant pleural effusions.

J Cancer Res Clin Oncol 2009;135(7):919-24. DOI: 10.1007/ s00432-008-0527-7

24. Paluszczakm J., Sarbak J., Kostrzewska-Poczekaj M. et al. The negative regulators of Wnt pathway - DACH1, DKK1, and WIF1 are methylated in oral and oropharyngeal cancer and WIF1

methylation predicts shorter survival. Tumor Biol 2015;36(4):2855-61. DOI: 10.1007/s13277-014-2913

25. Pannone G.B.P., Santoro A., Franco R. et al. WNT pathway in oral cancer: epigenetic inactivation of WNT-inhibitors. Oncol Rep 2010;24(4):1035-41. DOI: 10.3892/or.2010.1035

26. Supic G., Kozomara R., Jovic N. et al. Hypermethylation

of RUNX3 but not WIF1 gene and its association with stage and nodal status of tongue cancers. Oral Dis 2011;17(8):794-800. DOI: 10.1111/j.1601-0825.2011.01838

27. Takashi I., Minoru T., Suzuki H. et al. Epigenetic inactivation of RASSF2 in oral squamous cell carcinoma. Cancer

Sci 2008;99(5):958-66. DOI: 10.1111/j.1349-7006.2008.00769

28. Ogi K., Toyota M., Ohe-Toyota M. et al. Aberrant methylation

of multiple genes and clinicopathological features in oral squamous cell carcinoma. Clin Cancer Res 2002;8(10):3164-71.

29. Zhang Z., Van Sun D., Do N. et al. Inactivation of RASSF2A by promoter methylation correlates with lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma. Int J Cancer 2007;120:32-8. DOI: 10.1002/ijc.22185

30. Lo K.W., Kwong J., Hui A.B. et al. High frequency of promoter hypermethylation of RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res 2001;61(10):3877-81.

DOI: 10.1080/00313020500058623

31. Strzelczyka J.K., Krakowczykb L., Owczarekc A.J. Methylation status of SFRP1, SFRP2, RASSF1A, RARß and DAPK1 genes

in patients with oral squamous cell carcinoma. Arc Oral Biol 2019;98:265-72. DOI: 10.1016/j.archoralbio.2018.12.001

32. Kerjean A., Dupont J.M., Vasseur C. et al. Establishment of the paternal methylation imprint of the human H19 and MEST/PEG1 genes during spermatogenesis. Hum Mol Genet 2000 ;9(14):2183-7. DOI: 10.1093/hmg/9.14.2183

33. Boot A., Oosting J., de Miranda N. et al. Imprinted survival genes preclude loss of heterozygosity of chromosome 7 in cancer cells.

J Pathol 2016;240(1):72-83. DOI: 10.1002/path.4756

34. Dohi O., Yasui K., Gen Y. et al. Epigenetic silencing of miR-335 and its host gene MEST in hepatocellular carcinoma. Int J Oncol 2013;42(2):411-8. DOI: 10.3892/ijo. 2012.1724

Вклад авторов

С.В. Куревлев: молекулярно-генетические исследования, разработка дизайна исследования; Л.В. Цховребова: обработка материала, написание текста статьи, анализ публикаций по теме статьи;

А.В. Агаджанян: написание текста статьи, анализ публикаций по теме статьи, статистическая обработка полученных данных;

Т.Х. Фатхудинов: научное консультирование;

К.Б. Гордон: забор биоматериала; анализ клинических данных;

М.М. Азова: научное руководство исследованием.

Authors' contribution

S.V. Kurevlev: molecular genetic research, development of research design;

L.V. Tskhovrebova: processing of the material, article writing, analysis of publications on the topic of the article;

A.V. Aghajanyan: writing the text of the article, analysis of publications on the topic of the article, statistical processing of the data obtained;

T.H. Fatkhutdinov: scientific consulting;

K.B. Gordon: biomaterial sampling; analysis of clinical data;

M.M. Azova: scientific management of research.

ORCID авторов / ORCID of authors

Л.В. Цховребова / L.V. Tskhovrebova: https://orcid.org/0000-0003-4685-5007 А.В. Агаджанян / A.V. Aghajanyan: https://orcid.org/0000-0003-0129-1156 К.Б. Гордон / K.B. Gordon: https://orcid.org/0000-0002-3146-5615 Т.Х. Фатхудинов / T.H. Fatkhutdinov: https://orcid.org/0000-0002-6498-5764 М.М. Азова / M.M. Azova: https://orcid.org/0000-0002-7290-1196

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.

Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке Минобрнауки России (соглашение от 7.10.2021 № 075-15-2021-1356; внутренний номер соглашения 15.СИН.21.0011; идентификатор RF 0951.61321X0012).

Funding. The study was carried out with the financial support of the Ministry of Education and Science of Russia (Agreement No. 075-15-2021-1356 dated 7.10.2021; internal agreement number 15.SIN.21.0011; identifier RF 0951.61321X0012).

Соблюдение прав пациентов и правил биоэтики

Протокол исследования одобрен комитетом по биомедицинской этике Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба — филиала ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Минздрава России (протокол № 634 от 17.11.2021). Все пациенты подписали информированное согласие на участие в исследовании. Compliance with patient rights and principles of bioethics

The study protocol was approved by the biomedical ethics committee of the A.F. Tsyb Medical Radiological Research Center — branch of the National Medical Research Center of Radiology, Ministry of Health of Russia (protocol No. 634 of 17.11.2021). All patients gave written informed consent to participate in the study.

Статья поступила: 07.11.2022. Принята к публикации: 10.12.2022. Article submitted: 07.11.2022. Accepted for publication: 10.12.2022.