CC BY
26
Бюлоггчний вгсникМДПУ iмет БогданаХмельницького 6 (2), стор. 34-44, 2016 Biological Bulletin of Bogdan Chmelnitskiy Melitopol State Pedagogical University, 6 (2), pp. 34-44, 2016
ARTICLE УДК [576.3:546.47]:502.55(203)(477.64-2)+612:014.1:576.32:159.944.4
МЕТАБОЛ1ЗМ МЕТАЛ1В У Г1ПОКАМП1 ТА РОЛЬ ЦИНКУ В ПАТОГЕНЕЗ1
ЕП1ЛЕПТИФОРМНИХ СУДОМ
О.М. Кучковський
3anopi3bKnu нацюнальнийутверситет. Email: [email protected]
У дослвдах на щурах було показано, що при стресуванш оргашзму тварин спостер^аються корелятивш змши вмюту цинку та секреторного матер1алу в гшокамш, клиинах Панета та В-клгтинах пвдшлунково! залози. Характер змш цих показнишв залежав вщ стресора. При цьому змши вмюту цинку в гшокамш та гшоталамуа були протилежними, що можна пояснити виходом цього металу разом 1з секретом у кров'яне русло. За результатами дослвдження змш вмюту цинку в центральних та периферичних цинкмютких органах при р1зних змодельованих функцюнальних станах можна припустити наявнють загального мехашзму координаци функцюнально! активносп гшокампу й шших цинкмютких оргашв за допомогою змши метабол1зму хелатоутворюючого цинку, регуляц1я якого здшснюеться за участю г1покампу. Ключовi слова: 8-ТСХ, 8-БСХ, гтокамп, В-клтини, клтини Панета, цинк.
МЕТАБОЛИЗМ МЕТАЛЛОВ В ГИППОКАМПЕ И РОЛЬ ЦИНКА В ПАТОГЕНЕЗЕ
ЭПИЛЕПТИФОРМНЫХ СУДОРОГ
О.Н. Кучковский
Запорожский национальный университет. Email: [email protected]
В опытах на крысах было показано, что при стрессировании организма животных наблюдались коррелятивные изменения содержания цинка и секреторного материала в гиппокампе, клетках Паннета и В-клетках поджелудочной железы. Характер изменения зависел от стрессора. При этом изменения содержания цинка в гиппокампе и гипоталамусе были разнонаправленными, что можно объяснить выходом данного металла вместе с секреторным материалом в кровяное русло. Результаты исследований изменений содержания цинка в центральных и периферических цинксодержащих органах при разных смоделированных функциональных состояниях позволяют сделать предположение о наличии общего механизма координации функциональной активности как гиппокампа, так и других цинксодержащих органов при помощи изменений метаболизма хелатообразующего цинка, регуляция которого осуществляется при помощи гиппокампа. Ключевые слова: 8-ТСХ, 8-БСХ, гиппокамп, B-клетки, клетки Паннета, цинк.
METALS IN THE METABOLISM OF HIPPOCAMPUS AND ROLE OF ZINC IN THE PATHOGENESIS OF EPILEPTIC SEIZURES
O.M. Kuchkovsky
Zaporizhzhya National University. Email: [email protected]
Physiological mechanisms of convulsions status during epilepsy or episindrom significantly different from the mechanisms, which were describe for other disorders associated with glutamatergic system, such as schizophrenia (a decrease of glutamate in neurons and increased dopaminergic load), drug addiction and alcoholism (the formation of endogenous opioids and dopamine, strengthening the role of GABA-ergic system).
Citation:
Kuchkovsky, O.M. (2016). Metals in the metabolism of hippocampus and role of zinc in the pathogenesis of epileptic seizures. Biological Bulletin of Bogdan Chmelnitskiy Melitopol State Pedagogical University, 6 (2), 34-44.
Поступило в редакцию / Submitted: 12.04.2016 Принято к публикации / Accepted: 13.05.2016
http://dx.doi.org/10.15421/201633
©Kuchkovs'kij, 2016
Users are permitted to copy, use, distribute, transmit, and display the work publicly and to make and distribute derivative works, in any digital medium for any responsible purpose, subject to proper attribution of authorship.
This work is licensed under a Creative Commons Attribution 3.0 License
With glutamatergic transmission are cconnect not only convulsive state, but also the realization of higher integrative functions. Therefore, the development of epilepsy, particularly which caused glutamate, implemented by activating Zn-ergic hippocampal neurons, associate with complex changes in human mental functions. Based on a scientific literature about of the role of chelating zinc in the mechanisms of glutamatergic transmission, we can suggest it participation in the mechanisms of formation of epilepsy convulsions.
In experience on animals, was show that in the animal organism of stressing correlative changes observe zinc content and secretory material in the hippocampus, Paneth cells and B cells of pancreas. The nature of the changes depend on the stressor. When this change of zinc content in the hippocampus and hypothalamus (as the main regulator of stress reaction) were multidirectional that this can be explained by the release of metal together with secretory material in the hypothalamus into the bloodstream. Research epileptic activity of hippocampus by administering to the animal chelate 8 BSQ allowed to establish the dependence between convulsant action and first stress condition of the animal. Evocation of stress by 8-BSQ and physical activity, immobilization and alcohol abuse found that the convulsive effect of this reagent during intravitreal research increased in the case of prior exposure by specified kinds of stressors. In this pre-convulsive effect on exertion increased by 266% and the zinc content was increased by 75%; in the case of pre-immobilization duration of seizures increased by 206% and the zinc content - 50%; in the case of pre-alcoholization duration of seizures increased by 234%, and a chelating zinc content - 75%. These results suggest a chelating zinc epileptiform participate in the mechanisms of seizures and, possibly, the development of mechanisms of temporal lobe epilepsy (hippocampal). The results of studies of zinc changes in central and peripheral organs of zinc-containing simulated at different functional states allow us to make the assumption that there is a common mechanism for coordination of functional activity as the hippocampus and other zinc-containing bodies with the help of changes in the chelating zinc metabolism, regulation is carried out by means of the hippocampus. Key words: 8-TSQ, 8-BSQ, hippocampus, B-cells, Paneth cells, zinc.
ВСТУП
Фiзioлoгiчнi мехашзми судомних сташв i особливо тако! хвороби, як епшепия, принципово вiдрiзняютьcя вщ описаних для шизофрени (зниження рiвня глутамата в нейронах i посилення дофамшерпчно! трансмюи), депресш (зниження рiвня катехоламшв i порушення сшввщношень мiж глутаматерпчною i ГАМК-ерпчною системами), наркомани та aлкoгoлiзму (утворення ендо-генних аналопв мoрфiну з серотошну i дофамшу, шдвищення активносп ГАМК-ерпчно! системи) (Дамбинова, 1980; Astasheva et al., 2009). Важлива роль в вдукци синдрому епшепси належить глутаматерпчнш система Очевидно також значення ГАМК-ерпчно! i ендозепамерпчно! систем (Bird et al., 2008).
1з глутаматерпчною трансмюею тюно пов'язана не лише можливють шдукци судомних сташв, а й ряд вищих функцш ЦНС, зокрема, пам'ять. У цьому одна з причин того, що епшепия не зводить-ся до судомного синдрому, а пов'язана з низкою складних змш психши (Дамбинова, 1980; Takeda, 2011; Kazemi, 2016).
Також вщома роль мшроелемеипв у розвитку ще! хвороби (Кудрин и др., 2006; Zalups & Koropatnick, 2010). Магншдефщитна залежшсть патогенезу найбшьш важлива для щюпатично! первинно! епшепси. Гiпoмaгнiемiя розвиваеться на фош вторинно! епшепси, яка виникла внаслщок порушення метaбoлiзму шсля шсульту, черепно-мозково! травми, при ппертензивнш енцефалопати, ускладнень пicля наркозу. Таю речовини як кофе!н, теoбрoмiн, шкотин, алкоголь, кока!н, мoрфiн, геро!н, похщш aмфетaмiну, марихуана, гiперcoльoвa дiетa сприяють виходу мaгнiю з клiтин у позакттинну рiдину, посилюючи екcкрецiю юшв K+, Mg+, Ca2+ iз сечею та сприяе гiпoкaлiемi!, гiпoмaгнiемi!, гшокальщеми та перерoзпoдiлу мiкрo- та макроелемеипв у мозку. Мiкрoелементний склад мозку дуже чутливий до св^ло- та кольоронавантаження (перерoзпoдiл Zn, К, Mg, Na) (Андрианова М.Ю. и соавт., 1995; R.K. Zalups, J. Koropatnick, 2010).
1они таких метaлiв як Na, Cu, Co, Fe, Zn та ш. можуть шдвищувати епiaктивнicть мозку. В експериментах iз гiпoмaгнегicтiею в СА1-зрiзaх гiпoкaмпу щурiв cпocтерiгaлиcя епiлептифoрмнi судоми, при вщновлеш балансу мaгнiю cпocтерiгaли зниження судомного порогу впливу (Szewczyk at al., 2010; Zalups & Koropatnick, 2010).
Деяк лшарсью препарати, що використовуються при лiкувaннi епiлепci! призводять до зниження рiвня цинку в мозку i вaрiaцiй iз вмютом мiдi та селену (Кудрин, Громова, 2006; Zalups & Koropatnick, 2010).
Скронева епшепая, за деякими даними, складае 60% ycix форм епшепси(Кудрин, Громова, 2006). Найчастше при скроневiй епiлепсiï патологiчний осередок розташовуеться в медiобазальних вiддiлах скроневоï долi (гiпокамп, мигдалеподiбний комплекс, конвекситальна кора). Тому вивчення епшептогенних властивостей структур лiмбiчноï системи мае не лише теоретичне, але i практичне значення.
Показано, що в NMDA-рецепторi е дшянка для зв'язування цинку (Авцын А.П., 1979; Coulter, 2000). Значш концентрацiï iонiв Zn2+ виявлеш в пресинаптичних везикулах i синаптичному просторi вiдразy пiсля стимyляцiï нейрошв. Було встановлено, що цинк може впливати на ряд рецепторiв i потенщалзалежних iонних каналiв, зокрема може шпбувати активнiсть NMDA-рецепторiв (Кудрин, Громова, 2006; Takeda et al., 2009; Zalups & Koropatnick, 2010).
Zn на вiдмiнy вщ Mg не просто блокатор юнних каналiв, а регулятор синаптично1' передачi, головним чином глутаматерпчних нейронiв. Цинк виходить разом з глутаматом, впливае на рецеп-тори, що локалiзованi як на пресинаптичнш, так i на постсинаптичнш мембранi. Крiм того, вiн мае здатнють виходити з синаптично1' щшини та впливати на стан шших синапсiв - це так звана «об'емна передача» (Takeda et al., 2009; Elsas et al., 2009).
Наведений аналiз лГтературних даних дозволяе зробити висновок, що роль цинку як мшроелементу який здатен утворювати комплекси з хелаторами дуже важлива як у шдтримщ фiзiологiчно стабшьного стану окремих клiтин, органiв, так i розвитку патологiчних змiн при його дефщитг Усе це вказуе на необхщшсть подальшого вивчення ролi хелатоутворюючого цинку в механiзмах розвитку стресу та судомно1' активностi ппокампу, а також спонукае до пошуку заходiв запобiгання ушкоджувально1' дiï вказаних змiн.
Вiдомо, що в патогенезi нейродегенеративних змiн гiпокампy (епiлепсiя, хвороба Альцгеймера, хорея Гентшгтона) суттеву роль вщшрае хелатоутворюючий цинк, але не з'ясований мехашзм змiн цього металу та його взаемозв'язок iз вмютом секреторного матерiалy в цих клгтинах. 1з лiтератyрних даних вiдомо, що тд час електричного iмпyльсy шдвищуеться вмiст цинку в синаптичнiй щшиш, який захищае клiтини вiд руйшвного впливу глутамату. Але не вивчеш змiни даного металу в цинкмютких клiтинах пiд час судомно1' активносп амонова рога, та вплив стресорiв на тривалiсть i iнтенсивнiсть судом. Також залишаеться не вивченим питання змш вмюту хелатоутворюючого цинку в гшокамш у тварин рiзного виду залежно вiд розвитку ппокампу (еволюцшного положення виду). Важливо також простежити вплив дiабетогенних речовин, стрес-факторiв, деяких хелаторiв на вмiст цього металу в клггинах цинкдепонуючих оргашв (гiпокамп, клiтини Панета, В-клiтини).
У сучаснш фармакологи часто використовують хелатори, яю е дуже зручними молекулами для створення нових препарапв. Хелатори, або хелатукта агенти - обширна група оргашчних сполук, що здатш утворювати з металами клiшнеподiбнi комплекси - хелати (Андрух, 2001; Кудрин, Громова, 2006). Координацшш зв'язки придають хелату шодГ настшьки високу стшюсть, що метал вдаеться видшити лише шляхом озолення речовини. Завдяки устхам координацiйноï хГми вщкриваються можливост для все бшьш широкого застосування хелаторiв у промисловостГ, сшьському господарствi, фармакологи, харчовiй промисловостг За допомогою хелатоутворюю-чих агенпв проводяться близько чверт робгт в аналгтичнш хГми (Кудрин, Громова, 2006; Zalups & Koropatnick, 2010).
Велика кшьшсть лшарських речовин та деяю радюфармацевтичш дГагностичш речовини також можуть зв'язувати хелатори. Хелаторами е антидоти, яю застосовуються для зв'язування i виведен-ня Гз оргашзму токсичних i радюактивних речовин. У результат глибоких порушень обмГну речовин сполуки з вираженими хелатуючими властивостями можуть утворюватися i в самому оргашзмГ, тому все часпше постае питання щодо можливо1' ролГ цих сполук у розвитку таких захворювань, як цукровий дГабет, хвороба Альцгеймера, хорея Гентшгтона, епшепия та шизофрешя (Кудрин, Громова, 2006; Takeda et al., 2009; Zalups & Koropatnick, 2010).
Хелатори проникають в клгтину та взаемодГють, у першу чергу, Гз тими металами, у яких константи стабшьност комплексГв характеризуються найбшьшою величиною. Найбшьш стшю хелаторш комплекси важких металГв (Zalups & Koropatnick, 2010).
Центральний атом (метала) у хелаторному комплекс (хелап) зв'язаний Гз лиандом за допомогою юнних та донорно-акцепторних зв'язюв (Кудрин, Громова, 2006; Takeda et al., 2009). За ра-
хунок поеднання електронних пар двох взаемод1ючих атом1в утворюеться другий тип зв'язку. При утворенш хелаторних комплекшв донором виступають атоми кисню, азоту та с1рки в той час, як акцептором виступають атоми метал1в.
На донорш властивост впливають сусщш атоми в молекул1 л1ганда, тому не рщко застосову-ють термш донорш групи. Спорщненють реагенту до певних метал1в обумовлюе присутшсть дея-ких донорних груп (Кудрин, Громова, 2006).
Бшьшють мшроелеменпв, яю здатш вступати в бшарш i мультил1гандш комплекси з амшокислотами, карбоновими та нукле!новими кислотами, нуклеотидами, бшками е d-металами. Фундаментальну роль у клгшш та позаклгшннш динамщ метабол1зму мшроелеменпв, антагошзм1, синерпзм1 та фармакодинам1чнш дп мшроелеменпв вщ1грае стшюсть цих комплекшв. Стабшьнють конформерно! та комплексоутворюючо! ди мшроелемент1в визначаються принципами компл1ментарносп, стереоселективност1, макроциктчност1, природою розчинника, л1ганд1в, кшьюстю утворюваних циктв, природою всередиш молекулярних стабшзуючих i дестабшзуючих взаемодш, та кшетичною енерпею комплексоутворювача (Кудрин, Громова, 2006; Takeda et al., 2009; Zalups & Koropatnick, 2010).
Одшею з найважливших проблем сучасно! медицини е розробка засоб1в, яю забезпечують детоксикащю та ел1мшащю екопатогешв. У сучаснш л1тератур1 видшяють два типи хелаторно! патологи людини: ¡з превалюванням юшв метал1в та зниженим синтезом продукпв, що зв'язують л1ганд, та з дефщитом метал1в, асоцшованих 1з гшерпродукщею л1ганда - найважливша група засоб1в, що сприяють ел1мшаци метал1в i лшвщують штоксикащю цими речовинами. Проведення хелатуючо! терат! ефективно при л1куванш гострих та хрошчних отруеннях металами, при терапп постд1ал1зно! остеоартропати, анеми, рефректорно! до еритропоетину, енцефалопатп. Лшування хе-латорами вимагае точност дозування i велико! обережносп, тому що при виведенш хелаторами токсичних мшроелемент1в, зокрема РЬ, можлива гостра свинцева штоксикащя. При застосуванш хелатор1в Fе i DFO (десферроксамш) отримаш задовшьш результати л1кування хвороби Альцгей-мера (Zalups & Koropatnick, 2010). Д-пенщилламш або купринш зв'язують надлишкову мщь при хворобах Менкенса та Вшьсона-Коновалова. Хелатори широко використовують у комплекс! з про-типухлинними засобами для зниження !хньо! токсичности Також застосовують хелатукта лшарсью препарати при отруенш р1зними металами - Cu, Cd, РЬ, А1, Мо, Vi, Те (Кудрин, Громова, 2006; Zalups & Koropatnick, 2010; Takeda et al., 2013).
Синтез високо селективних хелатор1в, як забезпечують ел1мшащю токсичних мшроелемент1в i не порушують метабол1зм ессенщальних мшроелемент1в - одна з перспективних задач фармакологи. Однак, бшьшють хелатор1в не мають специф1чних ефекпв або здатш потенщювати токсичний ефект мщ та шших нейротоксичних метал1в, викликаючи апоптоз нейрогли (Кудрин, Громова, 2006).
Важливим аспектом фармакотерапи нейродегенеративних, цереброваскулярних та шших за-хворювань ЦНС, в етюлогп яких значну роль вщграють стрес i порушення металолпандного гомео-стазу е нейропротекщя, яка розглядаеться як захист нейрошв при судиннш патологи головного моз-ку. Однак на сьогодш велика кшьюсть проведених ктшчних дослщжень страждають на вщсутшсть задовшьних доказ1в ефективносп ди хелатор1в, для цього також необхщно дослщити ф1зюлопчш мехашзми металолпандного гомеостазу (Кудрин, Громова, 2006; Zalups & Koropatnick, 2010; Takeda et al., 2013).
Стосовно нейропротекцн застосовуеться металолпандне направлення наукового пошуку, що також дае досить достов1рш результати. Як грубу деформащю картографн метал1в та !хшх комплекс1в у ЦНС можна розглядати таю захворювання, як хвороба Альцгеймера, шсульт, ДЦП, хвороби м1тохондрш, л1зосом та шш1. При хвороб1 Альцгеймера та шизофренн в нейронах у 5-9 раз збшьшуеться концентращя алюмш1ю, скацщю, та кремшю, знижуеться р1вень цинку, магшю, селену (Zalups & Koropatnick, 2010).
Синтез пептид1в 1з потенцшними металолпандними властивостями е одним ¡з найбшьш перспективних напрям1в застосування нейротрофшв. Але для цього потр1бно з'ясувати ф1з1олог1чн1 механ1зми металол1гандного гомеостазу. Одним ¡з низькомолекулярних пептид1в, яю можуть зв'язувати цинк i мщь та транспортувати його до мозку е кортизол. Також вш може попереджувати апоптоз, викликаний нейротоксичними концентращями цинку та м1д1. Цей гормон е аналогом важ-
ливих гормошв стресу (глюкокортико1дов), а це означае, що змши в металолГгандному гомеостазГ можуть впливати на гормональну регулящю (Coulter, 2000).
Хелатори дитизон i 8-ТСХ були запропоноваш для цитох1мГчного визначення цинку. Мен-ше виявляеться цинку в клгтинах, яю сильшше ушкодженг НавГть при вщсутносп грубих змш у клГтинах штенсившсть цитохГмГчно1' реакци була знижена, це вказуе на те, що надзвичайна чутливють цитсшмГчних реакцш дозволяе використовувати ix для виявлення найлегших i самих раншх змш, що передують розвитку деструктивних змш у клГтинах, тобто для виявлення преморбщних сташв (Кудрин, Громова, 2006; Szewczyk, 2010; Zalups & Koropatnick, 2010). Це мае значний штерес при вивченш ди на оргашзм людини факторГв, яю викликають стани, що передують розвитку професшних захворювань, наприклад у промислових робгтниюв. Виявлення цих сташв дуже важливе з погляду проведення лГкувально-профшактичних заходГв на промислових тдприемствах.
Мета роботи - дослщити змши вмюту хелатоутворюючого цинку в гшокамш при моделюванш стресу.
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕНЬ
У дослщах було використано 143 щура, серед яких 18 тварин були контрольними, шшГ тва-рини шддавалися гострому стресуванню шляхом введення бюлопчно активних речовин (глюко-зи, шсулшу, ГАМК, лептину, дексаметазону, 8-БСХ, етанолу), а також Гммобшзащею, фГзичним навантаженням та голодуванням у вщповщностГ Гз описаними методиками (Омельянчик та ш., 2013). Дослщження на тваринах проводили зпдно з з дотриманням загальних принцишв бюетики у вГдповщносп до Хельсiнкськоï деклараци (ВсесвГтня медична асамблея, 1964), МГжнародних принцишв Gвропейськоï конвенци про захист хребетних тварин, що використовуються для дослщних та шших наукових цшей (Страсбург, 1986), Деклараци принцишв толерантносп (28 сесГя ЮНЕСКО, 1995), Унiверсальноï деклараци з бюетики та правах людини (ООН, 1997), Закону Украши № 3447 «Про захист тварин вщ жорстокого поводження».
1нсулш уводили у дозГ 0,1 ОД/кг, ГАМК - 50 мг/кг, лептин - 10 мг/кг, дексаметазон - 0,1 мг/ кг -вводились внутршньом'язово. Вс щ речовини виготовлеш ЗАТ Фармацевтична «Дарниця». Для оцшки впливу алкоголГзаци на оргашзм тварин, ¡м через шлунковий зонд уводили 20 % розчин етанолу в дозГ 2 мл/кг. У дослщах з голодуванням тварин на 12 годин позбавляли i^i.
Хелатор (8-БСХ) тваринам уводили внутршньочеревно в дозах 200 i 400 мг/кг.
Тварин забивали через 30 хвилин шсля гострого стресування. Органи, що брали для дослщження заморожували за допомогою заморожуючого мшротому та готували заморожеш зрГзи товщиною 3060 мкм. ЗрГзи заключали в глщерин i розглядали шд люмшесцентним мшроскопом. Для збудження люмшесценцп використовували свГтлофшьтр ФС-1, а в якост захисного (окулярного) - свплофшьтр Гз скла ЖС-18.
Продукт реакци визначали за жовто-зеленою люмшесценщею на зрГзах головного мозку - у полях СА2-СА4 ппокампу i в зубчастш фасци, а також у В-клГтинах пiдшлyнковоï залози щурГв.
Для отримання цитоxiмiчноï реакци на цинк зрГзи дослщжуваних тканин обробляли 0,1% ацетоновим розчином 8-ТСХ, через 1-5 хв "х промивали дистильованою водою, заключали в глщерин i розглядали шд люмшесцентним мшроскопом, як описано вище. У нейронах гшокампа та В-кттинах пiдшлyнковоï залози спостериалася жовто-зелена люмшесценщя, рГвень якоï був прямо пропорцшним вмюту цинку.
ЦифровГ зображення препарапв отримували за допомогою люмшесцентного мшроскопу Мшмед-2, варГант 11 (виробництво ЛОМО, РосГя). Отримаш за допомогою цифровоï камери зшмки збериали на жорсткому диску ПЕОМ у формат tiff (Tagged Image File Format), який призначений для збериання цифрових зображень без втрат ïx якостГ ВимГрювання штенсивносп флуоресценци на цифрових зшмках проводили за допомогою растрового графГчного редактора GIMP, версГя 2.6.10. У вшш «Пстограма» отримували основш статистичш параметри (кшькють шкселГв у зош видшення, середне значення яскравосп шкселГв у зош видшення та стандартне вщхилення), за якими характе-ризували стушнь штенсивност люмiнесцентноï реакци 8-ТСХ на цинк.
Так як реакщя 8-ТСХ на цинк е кшьюсною, то вмют хелатоутворюючого цинку оцшювали в мкг/г.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
Для встановлення характеру змш вмюту цинку в цинкмicтких клiтинaх при ди cтреcoрiв фiзичнoгo та хiмiчнoгo походження було дocлiдженo нaявнicть цинку i секреторного мaтерiaлу, з яким вш може бути пов'язаний, у клггинах мозкових cтруктур-ефектoрiв стресу. У якост таких цинкмicтких клiтин були розглянуп клiтини гiпoкaмпу i гшоталамусу.
Результати дocлiдження вмicту цинку i секреторного мaтерiaлу в гiпoкaмпi свщчили про cпoлученicть змiн, але рiзнocпрямoвaний !х характер при дi! рiзних cтреcoрiв (табл. 1).
Таблиця 1. Вмют цинку (забарвлення 8-ТСХ) i секреторного матерiалу (забарвлення альдегiдфуксином) та Тх взаемозв'язок (r) у гшокамш щурiв при стресi та модифжацп його функцiонального стану дieю хiмiчних сполук
Група тварин Вм1ст цинку, мкг/г (X ± m) Вм1ст секрету, ум. од. (X ± m) r
Контроль (n = 18) 50,1 ± 3,8 0,3 ± 0,02 0,38*
1ммобшзац1я (n = 11) 73,2 ± 6,2*** 0,5 ± 0,02* 0,37*
Голодування (n = 12) 67,0 ± 5,5* 0,4 ± 0,03* 0,35*
Введення шсул1ну (n = 10) 70,4 ± 6,4*** 0,4 ± 0,03* 0,41*
Введення лептину (n = 28) 33,5 ± 2,7*** 0,2 ± 0,01** 0,43*
Введення дексамета-зону (n = 30) 39,3 ± 2,8* 0,2 ± 0,02** 0,44*
Введення ГАМК (n = 12) 38,1 ± 2,9* 0,2 ± 0,01*** 0,43*
Введення конвульсанту (8-БСХ) (n = 12) 25,4 ± 1,4*** 0,1 ± 0,01*** 0,42*
* - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001 у пор1внянш з контрольною групою.
Так, iммoбiлiзaцiя, голодування та введення iнcулiну пiдвищувaли вмicт цинку та секрету в се-редньому на 34-46 i 33-67% вщповщно. У той же час таю сполуки, як лептин, дексаметазон, ГАМК, що теж моделюють стрес-реакщю, а також конвульсант 8-БСХ, сприяли зниженню вмicту цинку в гiпoкaмпi та секреторного мaтерiaлу на 22-44% i 33-67% вiдпoвiднo. При цьому спостерпали по-зитивну кoреляцiю змiн вмюту цинку та секрету в нейронах амонова рога.
Враховуючи те, що в ocнoвi реагування на стресорш подразники лежить дiяльнicть гшоталамуса, для з'ясування його можливо! учacтi у змшах вмicту цинку, що спостериалися, i взaемoвiднocин iз гiпoкaмпoм визначали вмют цього елементу в нейронах гшокампу та гiпoтaлaмуca у щурiв при рiзних стресових впливах i мoдифiкaцi! стану пiдшлункoвo! залози, яка е одним iз важливих ефекг^в стресу, що забезпечуе енергiею переби cтреc-реaкцi! (табл. 2).
Голодування, iммoбiлiзaцiя та введення iнcулiну пiдвищувaли вмют цинку в кл^инах гiпoкaмпу на 28-39% та знижували на 38-48% у кл^инах гiпoтaлaмуca. Введення глюкози призводило до зни-ження вмюту цього металу в амоновому рoзi на 22% та пiдвищення цього показника в кттинах гiпoтaлaмуca на 29%. При цьому спостерпали негативну корелящю змiн вмicту цинку в кттинах гiпoкaмпу та гiпoтaлaмуca.
Таким чином, визначення вмicту цинку в гшокамш i гiпoтaлaмуci при ди таких cтреcoрiв як голодування та iммoбiлiзaцiя, показало, що в них вщбуваються cпoлученнi, але прoтилежнi за характером, змши. При цьому вмют цинку та секреторного мaтерiaлу в гшокамш був шдвищений при ди чинникiв, якi гальмують секреторну aктивнicть його нейрoнiв, а при ди фaктoрiв, якi стимулю-
Таблиця 2. Вмкт цинку (забарвлення 8-ТСХ) та його взаемозв'язок (г) у гшокамш та гшоталамуС щурiв при дп стресорiв
Група тварин Вмiст цинку, мкг/г (X ± т ) г
гiпокамп гшоталамус
Контроль (п = 18) 53,1 ± 4,2 21,2 ± 1,6 -0,47*
Тварини,як голодували (п = 14) 72,1 ± 6,5* 12,0 ± 0,7*** -0,41*
Тварини, яш отримали глюкозу (п = 14) 41,2 ± 3,3* 27,1 ± 1,5 —0 72***
Тварини, яких пiддавали iммобiлiзацil (п = 12) 73,0 ± 6,5* 11,3 ± 0,9*** -0,49*
Тварини, яш отримали iнсулiн (п = 13) 68,4 ± 5,5* 13,1 ± 1,0*** —0,47*
Примiтка: тут i далi: * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.
ють секреторну актившсть нейрошв гшокампу, 1х вмют знижувався, що в сукупносп з визначени-ми кореляцшними зв'язками свщчить про пов'язанють кшькосп цинку в клигсш 1з И секреторною актившстю.
Як було показано вище (табл. 1-2), гостре стресування ¡ммобшзащею, шсулшом та голодуван-ням оргашзму призводить до накопичення цинку в клиинах гшокампу.
Вщомий вплив гшокампу на функцюнальну актившсть шших оргашв, а саме шдшлунково1 за-лози та тонкого кишечника. Для об'ектив1заци та уточнення одержаних даних, а також подальшого дослщження на процеси, що спостерпалися, безпосередньо впливу цитотоксичного хелатору 8-БСХ, який вщомий як стресор 1 конвульсант, було виконане дослщження впливу такого стресування на
Таблиця 3. Вмкт цинку (забарвлення 8-БСХ) i секреторного матерiалу (забарвлення альдегщфуксином i флоксином) у кштинах гiпокампу, панкреатичних острiвцiв i кштинах тонкого кишечника у щурiв шсля фiзичного навантаження, 1ммоб1лпацп та алкотшзацп
Група тварин !нтенсивнють реакци, ум. од. (X ± т )
8-БСХ альдепдфуксин (клiтини В) флоксин (клггини Панета)
гшокамп клiтини В клiтини Панета
Контроль (п = 18) 2,01 ± 0,11 1,94 ± 0,15 1,10 ± 0,09 1,32 ± 0,10 0,81 ± 0,07
Фiзичне навантаження (п = 16) 2,52 ± 0,18* 2,43 ± 0,15* 1,51 ± 0,10* 1,63 ± 0,12* 1,10 ± 0,10*
1ммобшза^ (п = 15) 2,64 ± 0,25* 2,61 ± 0,21* 1,44 ± 0,12* 1,71 ± 0,14* 1,22 ± 0,11*
Алкоголiзацiя (п = 16) 2,53 ± 0,19* 2,51 ± 0,22* 1,62 ± 0,13* 1,64 ± 0,11* 1,13 ± 0,13*
Примiтка: * - р < 0,05 у порiвняннi з контролем.
функцюнальну активнiсть гiпокампу та змши вмiсту хелатоутворюючого цинку в його нейронах iз забарвленням зрiзiв тканин за допомогою цього хелатору, а також з використанням нецитотоксично-го хелатору. При цьому щурiв шддавали впливу наведених вище стресорiв iз наступним визначен-ням вмюту дослiджуваного металу в нейронах амонова рога та периферичних цинкмютких органах.
Дослщження iнтенсивностi реакци при забарвлеш зрiзiв тканин 8-БСХ, яка вщображае насиченiсть цинком клiтин, також показало його тдвищення при ди стресорiв в усiх типах дослiджених нянин: гiпокампу, панкреатичних острiвцiв i тонкого кишечнику (табл. 3).
Так, фiзичне навантаження, iммобiлiзацiя та алкоголiзацiя викликали збшьшення вмiсту цинку в гшокамш на 25%, 30% i 25%, у клнинах В - на 26%, 37% i 32%, у клнинах Панета - на 36%, 27% i 36% вiдповiдно. Також спостериали збiльшення вмiсту секреторного матерiалу на 23%, 30%, 23% у клнинах панкреатичних острiвцiв та на 38%, 50%, 38% у клггинах тонкого кишечника при ди тих же стресових факторiв.
Вище (табл. 1-3) було показано, що вмют хелатоутворюючого цинку в клiтинах цинкмютких оргашв змiнюeться пiд дieю стресових факторiв. У зв'язку з цим представляло штерес оцiнити зв'язок такого штегрального показника функцiонального стану гшокампу, як його судомна активнiсть, iз рiвнем цинку в гiпокампi для одного бюлопчного виду при ди стресорiв, що призводили до змш вмiсту цинку. Результати дослiджень впливу стресування на штенсивнють штравнально! реакци 8-БСХ у гiпокампi та тривалють судом у тварин представленi у наведених нижче таблицях.
Таблиця 4. 1нтенсившсть штравггальнот реакци 8-БСХ у гшокамш та тривалють судом при введенш 8-БСХ (200 мг/кг) щурам шсля фiзичного навантаження
Група тварин Кшьшсть тварин 1нтенсившсть реакци, ум. од. Тривал1сть судом, хв
8-БСХ (контроль) 18 0,81 ± 0,09 3,53 ± 0,46
Ф1зичне навантаження + 8-БСХ 13 1,43 ± 0,15** 12,28 ± 1,55**
1ммобшзац1я + 8-БСХ 12 1,24 ± 0,15* 10,71 ± 1,23***
Алкогол1зац1я + 8-БСХ 15 1,42 ± 0,13*** 11,74 ± 1,38***
Примпта: ** - р < 0,01; *** - р < 0,001.
Анaлiз отриманих даних свщчить, що гостре стресування тварин, яке само по coбi викликало, як було показано вище, тдвищення вмюту цинку в нейронах гшокампу, при сумюнш ди з хелато-ром 8-БСХ, супроводжувалося збiльшенням вмicту цинку в клнинах i тривaлocтi судом вiдпoвiднo на 75% i 266% у випадку попереднього стресування фiзичним навантаженням, на 50% i 206% -iммoбiлiзaцiею, 75% i 234% - aлкoгoлiзaцiею. Таким чином, збiльшення вмicту цинку в клнинах при гострому стресуванш призводило до збiльшення тривaлocтi судом у тварин.
Ц органи забезпечують тдтримку метaлoлiгaнднoгo гомеостазу в oргaнiзмi людини i тварин. При цьому шдшлункова залоза та тонка кишка належать до оргашв ентеро-шсулярно! системи i в клiтинaх В панкреатичних ос^вщв i клiтинaх Панета тонкого кишечника мютиться хелатоутворю-ючий цинк, про що свщчать oдержaнi нами та чисельш лiтерaтурнi дaнi (Кучковський та iн., 2001; Сщенко та ш., 2001; Takeda et al., 2009, Zalups & Koropatnick, 2010).
При однакових станах cпocтерiгaли сполучеш змiни вмicту цинку в гшокамш та клнинах iнших цинкмicтких оргашв у тварин рiзних бioлoгiчних вцщв (мишей та щурiв), що вказуе на 1хнш зaкoнoмiрний характер, а саме, - не тшьки на залежнють функцioнaльнoгo стану органу вщ вмicту хелатоутворюючого цинку, а й на юнування зв'язку мiж змшами вмicту цинку в уciх цинкмютких органах. Характер цих змiн, як вже було частково сказано, свщчив про те, що голодування призводило до збшьшення вмюту цинку, а введення глюкози супроводжувалося протилежними змшами -зниженням вмюту цього металу в зазначених кттинах.
У сукупносп з даними про сполучеш змши вмюту цинку iз наявнютю секреторного мaтерiaлу в клiтинaх даш iнтрaвiтaльних дocлiджень дають пiдcтaву для заключення про участь цинку в реaлiзaцil секреторно! функцil клiтин, не тшьки вщомо! для пiдшлункoвol залози, але i для iнших
дослщжених нами клгшн. Осюльки Bei цинкмiсткi клiтини тим чи шшим чином здiйснюють СВ01 функцн завдяки секреци, присутнiсть у них цинку також може бути пов'язана саме i3 цим процесом.
Добре вщомо, що надлишкове звшьнення цинку пiдчас нейронально! активностi може призво-дити до порушень збудливосп гiпокампу, у тому числi виникненню судомно! акгивностi (Elsas et al., 2009; Takeda et al., 2013; Kazemi et al., 2016).
Узагальнюючи викладеш та обговоренш вище результати дослщження змiн вмiсту цинку в центральних та периферичних цинкмiстких органах при рiзних змодельованих функцiональних станах i3 лiтературними даними можна припустити, що механiзм реакцiй, що спостерГгаються, може бути наступним: везикулярний цинк при збудженш нервових закiнчень вщщеплюеться вiд глутамата, дае змогу йому вийти у синаптичну щшину для того, щоб провзаeмодiяти з рецепторами постсинаптично! мембрани та викликати потенщал ди. При цьому, цинк теж поступае в синаптичну щшину для сенсибшзацп i, одночасно, стабшзацп постсинаптично! мембрани, захищае нейрон вщ руйнiвного впливу глутамату, тобто вщ розвитку глутаматно! ексайтотоксичностi (Takeda, 2009). Пюля виходу в синаптичну щшину, вш взаемодiе iз чутливими до нього рецепторами, що Гндукуе звшьнення внутрикттинного кальцiю, а також фосфорилювання кiнази, що регулюеться позакттинно та кальцiй-кальмодулiновоi кiнази II. 1ншими словами, цинк може регулювати функцп нейронiв у гiпокампi через взаемодГю з метаботропними рецепторами (Astasheva, 2009).
ВИСНОВКИ
Результати дослщження вмiсту цинку i секреторного матерiалу в гшокамш свщчили про сполученiсть змiн, але рiзноспрямований !х характер при ди рiзних стресорiв. Iммобiлiзацiя, голо-дування та введення iнсулiну пiдвищували вмют цинку та секрету в середньому на 34-46 i 33-67% вщповщно. У той же час таю сполуки, як лептин, дексаметазон, ГАМК, що теж моделюють стрес-реакщю, а також конвульсант 8-БСХ, сприяли зниженню вмiсту цинку в гшокамш та секреторного матерiалу на 22-44% i 33-67% вiдповiдно. При цьому спостерпали позитивну кореляцiю змш вмюту цинку та секрету в нейронах амонова рога.
Визначення вмюту цинку в гшокамш та гшоталамус при ди таких стресорiв як голодування та iммобiлiзацiя, показало, що в них вщбуваються сполученнi, але протилежш за характером змiни. При цьому вмют цинку та секреторного матерiалу в гшокамш був пщвищений при ди чинникiв, якi гальмують секреторну активнiсть його нейронiв, а при дп факторiв, якi стимулюють секреторну активнiсть нейронiв гiпокампу, !х вмiст знижувався, що в сукупносп з визначеними кореляцiйними зв'язками свщчить про пов'язанiсть кiлькостi цинку в клигсш iз !! секреторною актившстю.
Фiзичне навантаження, iммобiлiзацiя та алкоголiзацiя викликали збiльшення вмiсту цинку в гшокамш на 25%, 30% i 25%, у клгшнах В - на 26%, 37% i 32%, у клгшнах Панета - на 36%, 27% i 36% вщповщно. Також спостерiгали збiльшення вмiсту секреторного матерiалу на 23%, 30%, 23% у кттинах панкреатичних острiвцiв та на 38%, 50%, 38% у клгшнах тонкого кишечника при дп тих же стресових факторiв.
Гостре стресування тварин викликало шдвищення вмюту цинку в нейронах гшокампу, а при сумюнш ди з хелатором 8-БСХ супроводжувалося збiльшенням вмюту цинку в кттинах i тривалостi судом вщповщно на 75% i 266% у випадку попереднього гострого стресування фГзичним наванта-женням, на 50% i 206% - iммобiлiзацieю, 75% i 234% - алкоголiзацieю.
На пщставГ аналiзу отриманих результатiв дослщжень змш вмюту цинку в центральних та периферичних цинкмютких органах при рГзних змодельованих функцюнальних станах можна припустити наявнють загального мехашзму координацн функцюнально! активносп як гшокампу, так й шших цинкмютких оргашв за допомогою змши метаболГзму хелатоутворюючого цинку, регулящя якого здшснюеться за участю гшокампу.
Л1ТЕРАТУРА
Авцын А.П. Ультраструктурные основы патологии клетки. / А.П. Авцын, В.А. Шахламов. - М.: Медицина,
1979. - 318 с.
Андрианова М.Ю. Магний и его баланс. / М.Ю. Андрианова, И.И. Дементьева, А.Ю. Мальцева //Анестезиология и реаниматология. - 1995. - №6. - С. 73-76.
Андрух П.Г. Этиология, нейрохимия и клиника современных форм тревожно-депрессивных расстройств / П.Г. Андрух // Медицинские исследования. - 2001. - Т. 1, вып. 1. - С. 109-110.
Вмют цинку в панкреатичних oстрiвцях i гшокамш при ди фiзioлoгiчних i надзвичайних подразнишв / В.А. Сщенко, В.Д. Бовт, М.М. Малько, А.В. Прохватшова, О.М. Кучковський // Фiзioлoгiчний журнал. - 2001 -№ 2. - С. 66-69.
Дамбинова С.А. Нейрорецепторы глутамата /С.А. Дамбинова. - Л.: Наука, 1989. - 143 с.
Крыжановский Г.Н. Детерминантные структуры в патологии нервной системы: генераторные механизмы ней-ропатологических синдромов. / Г.Н. Крыжановский. - М.: Медицина, 1980. - 358 с.
Кудрин А.В. Микроэлементы в неврологии. / А.В. Кудрин, О.А. Громова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2006. - 304 с.
Кучковський О.М. Вплив конвульсанту на вмют цинку в шсулоцитах i нейронах гшокампу у мишей / О.М. Кучковський, В.Ю. Сщенко // Вюник ЗДУ - 2001. - № 1. - С. 176-177.
Омельянчик Л.О. Адапта^ та металолиандний гомеостаз / Л.О. Омельянчик, Ю.В. Сщенко, О.М. Кучковський [та ш.] - Зaпoрiжжя: ЗНУ, 2013. - 351 с.
Astasheva E.V Activation of glutamatergic system of the medial septal region facilitates the epileptogenesis / E.V. Astasheva, V.F. Kichigina //Zh. Vyssh. Nerv. Deiat. Im. I.P. Pavlova. - 2009 - Vol. 59, № 6. - P. 743-749.
Coulter D.A. Mossy fiber zinc and temporal lobe epilepsy: pathological association with altered "epileptic" gamma-aminobutyric acid A receptors in dentate granule cells. / D.A. Coulter // Epilepsia. - 2000. - Vol. 41, Suppl 6. - P. 96-99.
Enhanced susceptibility to spontaneous seizures of noda epileptic rats by loss of synaptic zn(2+) / [A. Takeda, M. Iida, M. Ando та ш.]. // PLoS One.. - 2013. - Vol. 8., №8. - doi: 10.1371/journal.pone.0071372.
Facilitation of zinc influx via AMPA/kainate receptor activation in the hippocampus / A. Takeda, N. Sakurada, M. Ando [et al.] //Neurochem. Int. - 2009. - Vol. 55, N. 6. - P. 376-382.
Hippocampal zinc infusion delays the development of after discharges and seizures in a kindling model of epilepsy / S.M. Elsas, S. Hazany, W.L. Gregory [et al.] // Epilepsia. - 2009. - Vol. 50, N 4 - P. 870-879.
Ionic Glutamate Modulators in Depression (Zinc, Magnesium) / B. Szewczyk, E. Poleszak, A. Pilc [et al.] // Glutamate-Based Therapies for Psychiatric Disorders (Milestones in Drug Therapy) / P. Skolnick. - Berlin: A Birkhauser Basel book, 2010. - P. 21-38.
Jansen K.L. Excitatory amino acid receptors in the human cerebral cortex: a quantitative autoradiographic study comparing the distributions of [3H]TCP, [3H]glycine, L-[3H]glutamate, [3H]AMPA and [3H]kainic acid binding sites / K.L. Jansen, R.L. Faull, M. Dragunow //Neuroscience. - 1989. - Vol. 32, № 3. - P. 587-607.
Modulation of axonal sprouting along rostro-caudal axis of dorsal hippocampus and no neuronal survival in parahippocampal cortices by long-term post-lesion melatonin administration in lithium-pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. / [M. Kazemi, S. Shokri, M. Ganjkhani et al.]. // Anat. Cell. Biol. - 2016. - Vol 49, № 1. - С. 21-33.
Zalups R.K. Cellular and molecular biology of metal / R.K. Zalups, J. Koropatnick. - N.Y.: CRC Press, 2010. - 442 p. REFERENCES
Andrianova, M. Y., Dement'eva, I. I., & Mal'ceva, A. Y. (1995). Magnij i ego balans. Anesteziologija i reanimatolo-gija, 73-76.
Andruh, P. G. (2001). Jetiologija, nejrohimija i klinika sovremennyh form trevozhno-depressivnyh rasstrojstv. Medi-cinskie issledovanija, 7(1), 109-110.
Astasheva, E. V., & Kichigina, V. F. (2009). Activation of glutamatergic system of the medial septal region facilitates the epileptogenesis. Zh. Vyssh. Nerv. Deiat. Im. I.P. Pavlova, 59(6), 743-749.
Avcyn, A. P., & Shahlamov, V. A. (1979). Ul'trastrukturnye osnovypatologii kletki. М: Medicina.
Coulter, D. A. (2000). Mossy fiber zinc and temporal lobe epilepsy: pathological association with altered "epileptic" gamma-aminobutyric acid A receptors in dentate granule cells. Epilepsia, 47(6), 69-99.
Dambinova, S. A. (1989). Nejroreceptory glutamata. Leningrad: Nauka.
Elsas, S.-M., Hazany, S., Gregory, W. L., & Mody, I. (2009). Hippocampal zinc infusion delays the development of after discharges and seizures in a kindling model of epilepsy. Epilepsia, 870-879.
Eshhenko, V. A., Bovt, V. D., Mal'ko, M. M., V., P. A., & Kuchkovs'kij, O. M. (2001). Vmist cinku v pankreatichnih ostrivcjah i gipokampi pri dii fiziologichnih i nadzvichajnih podraznikiv. Fiziologichnij zhurnal(2), 66-69.
Jansen, K. L., Faull, R. L., & Dragunow, M. (1989). Excitatory amino acid receptors in the human cerebral cortex: a quantitative autoradiographic study comparing the distributions of [3H]TCP, [3H]glycine, L-[3H]glutamate, [3H]AMPA and [3H]kainic acid binding sites. Neuroscience, 32(3), 587-607.
Kazemi, M., Shokri, S., Ganjkhani, M., Ali, R., & Iraj, J. A. (2016). Modulation of axonal sprouting along rostro-caudal axis of dorsal hippocampus and no neuronal survival in parahippocampal cortices by long-term post-lesion melatonin administration in lithium-pilocarpine model of temporal lobe epilepsy. Anat Cell Biol., 49(1), 21-33.
44
KyHKOBCbKHH O.M.
Kryzhanovskij, G. N. (1980). Determinantnye struktury vpatologii nervnoj sistemy: generatornye mehanizmy nejro-patologicheskih sindromov. Moscow: Medicina.
Kuchkovs'kij, O. M., & Eshchenko, Y. V. (2001). Vpliv konvul'santu na vmist cinku v insulocitah i nejronah gipokam-pu u mishej. Visnik ZDU(1), 176-177.
Kudrin, A. V., & Gromova, O. A. (2006). Mikrojelementy v nevrologii. Moscow: GEOTAR-Media.
Omeljanchik, L. O., Eshchenko, Yu. V., Kuchkovskij O.M. & Bovt V D. (2013). Adaptacija ta metaloligandnij gome-ostas. Zaporizhzhia: Zaporizhzhia National University.
Szewczyk, B., Poleszak, E., Pilc, A., & Nowak, G. (2010). Ionic Glutamate Modulators in Depression (Zinc, Magnesium). B P. Skolnick, Glutamate-Based Therapies for Psychiatric Disorders (Milestones in Drug Therapy) (pp. 21-38). Berlin: A Birkhauser Basel book.
Takeda, A., Iida, M., Ando, M., Nakamura, M., Tamano, H., & Oku, N. (2013). Enhanced Susceptibility to Spontaneous Seizures of Noda Epileptic Rats by Loss of Synaptic Zn2+. PLoS One, 8(8), doi: 10.1371/journal. pone.0071372.
Takeda, A., Sakurada, N., Ando, M., Kanno, S., & Oku, N. (2009). Facilitation of zinc influx via AMPA/kainate receptor activation in the hippocampus. Neurochem Int., 55(6), 376-382.
Zalups, R., & Koropatnick., J. (2010). Cellular and molecular biology of metal. N.Y.: CRC Press.
Ewnогiцниu BicHUK MffnYiMeHi Eогдана Хмеnbницbкого 6 (2), 2016
