CC BY
53
УДК 664.411:674.032.14:664.642
МЕТАБОЛИЗМ АРАБИНОГАЛАКТАНА ЛИСТВЕННИЦЫ СИБИРСКОЙ ДРОЖЖАМИ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
© Н.А. Неверова , Л.А. Беловежец, Е.Н. Медведева, В.А. Бабкин
Иркутский институт химии им. А.Е. Фаворского СО РАН, ул. Фаворского, 1, Иркутск, 664033 (Россия) e-mail: [email protected]
Проведены исследования способности дрожжей Saccharomyces cerevisiae утилизировать арабиногалактан (АГ), выделенный из древесины лиственницы сибирской, а также влияния фенольных примесей на скорость его утилизации. Показано, что арабиногалактан активно включается в метаболизм дрожжей, причем степень деструкции полимерной молекулы зависит от способа очистки образца АГ и количества содержащихся в нем фенольных примесей.
Ключевые слова: арабиногалактан из лиственницы сибирской, дрожжи Saccharomyces cerevisiae, фенольные соединения, гельпроникающая хроматография, молекулярно-массовое распределение, бумажная хроматография.
Введение
В последнее время в мире сложилась новая система взглядов на питание человека. Питание современного человека должно быть не только рациональным, но и обладать лечебно-профилактическим действием. Поэтому большое внимание уделяется производству новых функциональных продуктов, в том числе обогащенных пребиотиками.
Пребиотики представляют собой пищевые волокна углеводной природы, избирательно стимулирующие рост и активность нормальной микрофлоры кишечника, они являются пищей для бифидо- и лактобактерий (пробиотиков). Эти бактерии исключительно важны для здоровья человека, в частности для иммунной системы, а также детоксикационных и гормон-регулирующих функций организма [1].
Производства пищевых волокон на территории России практически нет. Такие пищевые ингредиенты, как пектин, инулин, галактоманнаны (гуаровая камедь и камедь рожкового дерева), каррагинаны, гуммиарабик (торговое название «Фибрегам») [2, 3], в настоящее время в нашей стране не производятся, а потребность в них удовлетворяется за счет импорта.
Превосходным источником растворимых пищевых волокон является водорастворимый полисахарид ара-биногалактан (АГ). Исследованиям арабиногалактана, получаемого из древесины лиственницы, посвящен ряд обзоров зарубежных и отечественных авторов [4-8]. Проведенные в США исследования показали, что АГ обладает свойствами пребиотика [9]. Установлено, что он способствует образованию в кишечнике человека короткоцепочечных жирных кислот, главным образом бутиратов и пропионатов, чрезвычайно важных для нормальной работы организма человека и животных. Эти свойства АГ в сочетании с низкой токсичностью, высокой биологической активностью (иммуностимулирующей, гиполипидемической, гастро- и гепа-топротекторной и др.), а также хорошими технологическими свойствами обусловливают его практическую значимость для получения биологически активных добавок к пище и функциональных продуктов питания.
В США уже разработаны диетические пищевые продукты и напитки с арабиногалактаном. В пищу рекомендуются готовые изделия, содержащие минимум 60 мг АГ на килограмм массы тела (~4,5 г/сут.) [10]. В нашей стране согласно Перечню, утвержденному главным санитарным врачом РФ, адекватный уровень потребления АГ составляет 10 г/сут., а верхний допустимый уровень - 20 г в сутки [11].
* Автор, с которым следует вести переписку.
Показано, что АГ из лиственницы сибирской улучшает качество хлеба (внешний вид, объем, пористость, цвет корочки) [12-14]. Применение АГ в хлебопечении может быть перспективно, так как он способен стимулировать рост микроорганизмов (в том числе дрожжей), а также служить им дополнительным источником углерода. Обнаруженное нами снижение содержания АГ в процессе изготовления хлеба, вероятно, обусловлено утилизацией полисахарида дрожжами [12].
Арабиногалактан, выделяемый из древесины лиственницы сибирской по разработанной лабораторией химии древесины Иркутского института химии СО РАН технологии (ФиброларС) [15], содержит до 1% флавоноидов, в основном дигидрокверцетина (ДКВ), которые, как известно, могут оказывать влияние на процессы, связанные с утилизацией АГ дрожжами [16].
Цель настоящей работы - исследование способности дрожжей метаболизировать арабиногалактан, выделенный из древесины лиственницы сибирской, изучение продуктов превращения АГ, а также оценка влияния фенольных примесей на скорость утилизации АГ дрожжами.
Экспериментальная часть
Арабиногалактан (ФиброларС) выделяли из древесины лиственницы сибирской на опытнопромышленной установке и очищали по методу [17, 18].
В работе использовали (табл. 1):
1. АГ, не содержащий примеси ДКВ: образец 1 - арабиногалактан фирмы «Sigma» (содержание основного вещества 98%) и образец 2 - опытно-промышленный АГ, дополнительно очищенный трехкратным пере-осаждением из воды в этиловый спирт (содержание основного вещества 97,6%).
2. Опытно-промышленный АГ с содержанием основного вещества 94-95% и с различным естественным содержанием дигидрокверцетина (образцы 3-6).
3. АГ, механохимически обработанный в валковой мельнице ВМ-1 [19] (образец 7).
4. Искусственные смеси, приготовленные из образца 2 с добавлением ДКВ (образцы 8-11).
5. Искусственная смесь ДКВ/АГ в соотношении 1 : 20 после механохимической обработки (образец 12).
Для исследования способности дрожжей утилизировать арабиногалактан использовалась питательная среда
следующего состава (г/л): (NH4)2SO4 - 5,0, KH2PO4 - 1,0, KCl - 0,15, MgSO4-7H2O - 0,2, CaCl2 - 0,05, дрожжевой автолизат - 50 мл; для получения накопительной культуры к готовой среде добавляли 2% глюкозы [20].
Накопительная культура дрожжей Saccharomyces cerevisiae выращивалась в течение 3 сут. при 30 °С. При посеве на питательные среды, содержащие 1% АГ (образцы 1-12), в 50 мл среды вносили 0,5 мл иноку-лята и культивировали в тех же условиях. Пробы отбирали через 12, 24, 48 ч после посева и центрифугировали при 9000 мин-1 в течение 10 мин. Полученные супернатанты использовали для исследований. Контролем служили дрожжи, посеянные на аналогичную среду, не содержащую АГ. Рост дрожжей оценивали по увеличению мутности среды и по образованию углекислого газа в поплавке.
Концентрацию полисахарида в исследуемых и контрольных (без добавки АГ) образцах определяли фо-токолориметрическим методом [12].
Содержание фенольных примесей в пересчете на ДКВ определяли по интенсивности поглощения его комплекса с хлоридом алюминия при 400 нм на спектрофотометре «Юнико S2100».
Молекулярно-массовое распределение (ммр) макро- Таблица 1. Содержание ДКВ в исследуемых
молекул АГ определяли методом гельпроникающей хроматографии (ГПХ) в стеклянной колонке (650 х 10 мм) на сефадексе в 100 с калибровкой по декстранам. В качестве элюента использовали 1 М раствор №С1. Отбирали фракции по 1 мл со скоростью элюирования 3638 мл/ч. Содержание АГ во фракциях находили фенол-сернокислотным методом [21].
Для обнаружения в реакционных смесях моно- и дисахаридов использовали метод бумажной хроматографии (БХ). Хроматограммы развивали нисходящим способом в системе н-бутанол - пиридин - вода (6 : 4 : 3), проявителем служил раствор анилинфталата в этаноле [22].
образцах
Образец Содержание ДКВ, %
1 0
2 0
3 0,18
4 0,76
5 0,97
6 1,35
7 1,01
8 0,18
9 0,76
10 0,97
11 1,35
12 6,24
Обсуждение результатов
Арабиногалактан, извлекаемый водой из древесины лиственницы, содержит небольшие количества низкомолекулярных и полимерных фенольных соединений. Эти примеси не снижают качества АГ как функциональной добавки к пищевым продуктам, но могут влиять на биохимические процессы, протекающие при приготовлении дрожжевого теста.
Биологические свойства арабиногалактана во многом определяются молекулярной массой (ММ) его макромолекул. В нашей работе мы использовали АГ со средней ММ - 13490 Да (по данным ГПХ).
Эксперименты по использованию арабиногалактана как функциональной добавки к хлебу показали, что добавление к массе муки 1% АГ приводит к значительному улучшению качественных показателей хлеба, но при этом в готовом продукте он не обнаруживается, а при расходе АГ 2-3% содержание его в хлебе составляет 50-60% от добавленного количества. При исследовании возможности утилизации АГ дрожжами установлено, что через 3 сут. культивирования дрожжей с 1% АГ в культуральных фильтратах не обнаруживается даже следовых количеств полисахарида. В то же время АГ активно утилизируется дрожжами только в случае отсутствия в питательной среде другого источника углерода. При добавлении к питательной среде альтернативного источника углерода утилизация АГ не происходит. Таким образом, показано, что для дрожжей АГ является энергетически невыгодным субстратом, который используется только после выработки более легкодоступных веществ. Однако внесение АГ в питательную среду в количестве 1% стимулирует рост дрожжей и увеличивает количество образуемого ими углекислого газа [12].
Визуальные наблюдения показали, что наиболее быстрый рост дрожжей в первые сутки культивирования происходит в присутствии образцов 3-6 (табл. 1). Образцы АГ 1-2, не содержащие фенольных примесей, и образец 12 с высоким содержанием ДКВ замедляли рост. Следовательно, на пролиферацию дрожжей негативно влияет как высокое содержание фенолов, так и их полное отсутствие. Различия в скорости роста дрожжей нивелируются к 7 сут. культивирования. В то же время в культуральных жидкостях образцов, изначально содержавших большие количества ДКВ (образцы 6, 11, 12), отмечалось выпадение осадка. Вероятно, это связано с ферментативной полимеризацией фенолов [16].
В присутствии механохимически обработанного АГ (образец 7) также наблюдается замедленный рост дрожжей. Вероятно, это связано с изменениями надмолекулярной структуры и конформаций макромолекул полисахарида при механической обработке, приводящими к снижению его биодоступности. Не исключается и роль увеличения молекулярно-массового распределения, которое в выбранных условиях происходит вследствие рекомбинации фрагментов, образующихся при механодеструкции макромолекул АГ [19].
Согласно нашим экспериментальным данным ДКВ, вносимый с АГ, активно метаболизируется: во всех образцах через 2 сут. культивирования в супернатантах фенольные примеси обнаруживаются в количествах, не превышающих 10-20%. Разница в утилизации фенольных соединений, исходно содержащихся в АГ (образцы 3-6) и искусственно введенных (образцы 8-11), находится в пределах ошибки (табл. 2).
Из рисунка 1 видно, что убыль АГ в первые 12 ч культивирования дрожжей составляет более 50% от его исходного содержания. Максимально утилизации подвергается образец 3, где остаточное количество АГ составило всего 16%, тогда как в образце 8 (искусственная смесь, аналогичная по содержанию ДКВ образцу 3) сохраняется половина исходного АГ. Вероятно,
ДКВ, выделяемый совместно с АГ (естественная смесь), комплексно связан с его макромолекулами, за счет чего происходит их стабилизация. В дальнейшем скорость утилизации АГ замедляется, однако для образцов 3, 5 и 8 к 48 ч культивирования в супернатантах наблюдаются лишь незначительные количества полисахарида. Скорость деструкции полисахарида в образце 12 была ниже, чем в остальных препаратах, что связано в первую очередь с высоким исходным содержанием в нем фенольных примесей. Известно, что высокая концентрация низкомолекулярных фенолов тормозит рост микроорганизмов [23].
Таблица 2. Содержание фенольных примесей в супернатантах
Образец
Остаточное содержание фенольных примесей, % от исходного количества
12 ч 24 ч 48 ч
контроль 0 0 0
1 0 0 0
2 0 0 0
3 83 17 0
4 58 18 18
5 52 12 9
6 47 13 13
7 50 15 8
8 48 10 7
9 58 14 11
10 55 16 15
11 43 18 11
12 65 20 17
время культивирования, час.
Рис. 1. Содержание полисахарида в культуральных средах: 3 - АГ с естественным содержанием ДКВ 0,18%; 5 - АГ с естественным содержанием ДКВ 0,97%; 8 - АГ с добавлением 0,18% ДКВ; 10 - АГ с добавлением 0,97% ДКВ; 12 -искусственная смесь ДКВ/АГ (1 : 20) после механохимической обработки
Образцы исходного АГ характеризуются довольно узким ММР, причем, как и следовало ожидать, дополнительная очистка повышает степень однородности образца по молекулярной массе за счет удаления как высокомолекулярных, так и низкомолекулярных фракций полисахарида (рис. 2, табл. 3).
АГ, оставшийся в супернатантах после воздействия дрожжей, характеризуется значительно более высокими значениями ММР, чем исходные образцы (рис. 3, 4, табл. 3). Макромолекула арабиногалактана из древесины лиственницы имеет высокоразветвленное строение; главная цепь ее состоит из звеньев галактозы, соединенных гликозидными связями р-(1—>3), а боковые цепи со связями р-(1—>6) - из звеньев галактозы и арабинозы, а также из единичных звеньев арабинозы. Наличие в исследуемых пробах фракций полисахарида с довольно высокой ММ может свидетельствовать о преимущественной утилизации дрожжами более доступных боковых цепей макромолекулы, имеющей, как известно, глобулярную структуру. Однако под действием дрожжей деструкция галактанового кора макромолекул также происходит, что отражается в увеличении доли низкомолекулярных фракций (рис. 3, 4) по сравнению с исходными образцами АГ (рис. 2). На гель-хроматограммах образцов после воздействия дрожжей в течение 24 ч (рис. 3, 4) отсутствуют пики, соответствующие простым сахарам. Моно- и дисахариды не были обнаружены также с помощью БХ. Это неудивительно, так как они характеризуются наибольшей биодоступностью.
Более полная утилизация дрожжами неочищенного опытно-промышленного АГ (рис. 3, образец 3; рис.
4, образец 5) по сравнению с очищенным АГ (рис. 3, образец 8, рис. 4, образец 10) может быть обусловлена более высоким содержанием низкомолекулярных фракций в исходном неочищенном АГ (рис. 2).
Объём удерживания, мл
опытно-промышленный АГ ^-опытно-промышленный, дополнительно очищенный АГ I
Рис. 2. Молекулярномассовое распределение в образцах исходного АГ
Таблица 3. Молекулярно-массовые характеристики образцов АГ после воздействия дрожжей
Образец Обработка дрожжами, ч Мп М^/Мп
Исходный АГ -1 * - 16796 12848 1,30
3 12 10002 4050 2,47
3 24 12087 4037 2,99
5 12 12170 3247 3,75
5 24 13765 4569 3,01
Исходный АГ-2 - 15849 12756 1,24
8 12 11548 3728 3,1
8 24 11652 4078 2,86
10 12 12170 4382 2,78
10 24 11661 4446 2,62
Примечание: * - АГ -1 - опытно-промышленный АГ; ** - АГ-2 - опытно-промышленный АГ, дополнительно очищен-
ный переосаждением из воды в спирт.
Рис. 3. Молекулярно-массовое распределение АГ после воздействия дрожжей (образцы 3, 8)
Объём удерживания, мл
образец 3 (24 ч.) —о— образец 8 (24 ч.)
Рис. 4. Молекулярно-массовое распределение АГ после воздействия дрожжей (образцы 5, 10)
Объём удерживания, мл образец 5 (24 ч.) образец 10 (24 ч.)
Выводы
Установлено, что АГ и фенольные примеси активно утилизируются дрожжами. Скорость утилизации АГ зависит от способа его очистки, а также от содержания в нем фенольных примесей. Максимальная убыль АГ и ДКВ наблюдалась у образцов неочищенного опытно-промышленного АГ с невысоким содержанием фенольных примесей.
Подтверждено, что вследствие утилизации полисахарида микроорганизмами применение АГ как функциональной добавки к дрожжевым хлебобулочным изделиям нецелесообразно, однако для улучшения качества готовой продукции можно рекомендовать добавление его к муке в количестве 1%.
Список литературы
1. Шевелева С.А. Пробиотики, пребиотики и пробиотические продукты. Современное состояние вопроса // Вопросы питания. 1999. №2. С. 32-40.
2. Fibregum. A bioactive natural soluble fibre from acacia // Bulletin S30/D, Colloids Naturels International. R&D, October 1998. 24 с.
3. Токаев Э.С. Фибрегам - пищевой ингредиент нового поколения // Пищевые ингредиенты: сырье и добавки. 2006. №1. С. 32-35.
4. Aspinall G.O. Some recent developments in the chemistry of arabinogalactans // Chimie et Biochimie de la Lignine, de la Cellulose et des Hemicelluloses. Actes du Symposium International de Grenoble. 1964. Pp. 89-97.
5. Adams M.F., Duglas C. Arabinogalactan. A review of literature // TAPPI. 1963. V. 46. Pp. 544-548.
6. Антонова Г.Ф., Тюкавкина Н.А. Водорастворимые вещества лиственницы и возможности их использования // Химия древесины. 1983. №2. С. 89-96.
7. Медведева Е.Н., Бабкин В.А., Остроухова Л.А. Арабиногалактан лиственницы - свойства и перспективы использования (обзор) // Химия растительного сырья. 2003. №1. С. 27-37.
8. Медведева С.А., Александрова Г.П. Стратегия модификации и биопотенциал природного полисахарида араби-ногалактана // Панорама современной химии России. М., 2003. C. 328-351.
9. http://www.larex.com/group.html
10. Ohr L.M. Arabinogalactan adds more than health benefits // Prepared Foods. 2001. V. 170, N1. P. 55.
11. Рациональное питание. Рекомендуемые уровни потребления пищевых и биологически активных веществ // Методические рекомендации МР 2.3.1. 19150-04. Утверждены 2 июля 2004 г.
12. Ермакова М.Ф., Чистякова А.К., Щукина Л.В., Пшеничникова Т.А., Медведева Е.Н., Неверова Н.А., Беловежец Л.А., Бабкин В.А. Влияние арабиногалактана, выделенного из древесины лиственницы сибирской на хлебопекарные достоинства муки мягкой пшеницы и качество хлеба // Химия растительного сырья. 2009. №1. С. 161-166.
13. Цыганова Т.Б., Ильина О.А., Чемакина А.Б., Тюкавкина Н.А., Руленко И.А., Колесник Ю.А., Козырева Н.А. Новая пищевая добавка для производства мучных изделий // Хлебопечение России. 1997. №3. C. 23-24.
14. Медведева Е.Н., Неретина О.В., Давыдова Е.В. Применение арабиногалактана в производстве хлебобулочных изделий // Пищевые технологии, качество и безопасность продуктов питания: материалы Всерос. науч.-практ. конф. Иркутск, 2008. С. 48-49.
15. «ФиброларС» (Сырье для изготовления биологически активных добавок к пище). ТУ 9363-021-39094141-08 (взамен ТУ 9363-015-39094141-03). Сан.-эпид. закл. №77.99.03.003.Т.001137.05.08 от 29.05.2008 г.
16. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М., 1974. 214 с.
17. Патент №2256668 РФ. Способ получения арабиногалактана / В.А. Бабкин, Л.Г. Колзунова, Е.Н. Медведева, Ю.А. Малков, Л.А. Остроухова // БИ. 2005. №20.
18. Медведева Е.Н., Бабкин В.А., Макаренко О.А., Николаев С.М., Хобракова В.Б., Шулунова А.М., Федорова Т.Е., Еськова Л.А. Получение высокочистого арабиногалактана лиственницы и исследование его иммуномодулирующих свойств // Химия растительного сырья. 2004. №4. С. 17-23.
19. Медведева Е.Н., Неверова Н.А., Федорова Т.Е., Бабкин В.А., Метелева Е.С., Душкин А.В., Толстикова Т.Г., Хвостов М.В., Долгих М.П. Структурные превращения арабиногалактана из лиственницы сибирской при механохи-мической обработке и биологические свойства продуктов // Химия растительного сырья. 2009. №3. C. 49-56.
20. Практикум по микробиологии: учебное пособие для студентов вузов / под ред. А.И. Нетрусова. М., 2005. 608 с.
21. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Analytical Chemistry. 1956. V. 28, N3. Pp. 350-356.
22. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы: учебное пособие для вузов. М., 1991. 320 с.
23. Телышева Г.М., Панкова Р.Е. Удобрения на основе лигнина. Рига, 1978. 64 с.
Поступило в редакцию 10 ноября 2010 г.
