CC BY
42
ТЕХНОЛОГИЯ И АППАРАТЫ ПИЩЕВЫХ ПРОИЗВОДСТВ
УДК 647.1
A. Ю. Крыницкая, П. П. Суханов, Т. А. Опалева,
B. С. Гамаюрова, С. Е. Соловьева, Е. В. Мищенко
МЕХАНИЗМЫ ВОЗДЕЙСТВИЯ КОМПЛЕКСООБРАЗОВАТЕЛЕЙ НА КЛЕТОЧНЫЕ ПРОЦЕССЫ В БАКТЕРИЯХ p.BACILLUS
Изучено влияние комплексообразующих соединений различной природы и концентрации на характеристики роста и продуцирования веществ консорциумом Bacillus badius. Обсуждаются механизмы воздействия комплексообра-зователей на процессы, протекающие на различных масштабах - от морфологического до клеточного уровня.
Известно, что все стороны метаболизма бактерий находятся под контролем тех или иных неорганических ионов. Повышение эффективности бактерий—продуцентов представляется возможным путем эмпирического подбора концентрации ионов внутри клетки. В этом случае ионтранспортирующие соединения (комплексоны, каликс(п)арены и т.д.) выступают как возможные регуляторы ионного гомеостаза у бактерий. Особое внимание последняя группа соединений привлекает в силу своей субстратной специфичности, которая проявляется в способности участвовать в процессах, получивших название химии взаимодействий «гость—хозяин» [1].
Эффективное распознавание субстрата рецептором может быть достигнуто при максимальной площади контакта между ними, например, когда рецептор «обхватывает» субстрат со всех сторон, связывая его через многочисленные межмолекулярные взаимодействия разнообразной природы. Макроциклические соединения, удовлетворяющие указанным выше требованиям, относятся к классу метациклофанов. Они получили название «каликс(п)арены». Каликс(п)арены — новый класс соединений, которые, способны также благодаря специфической корзиноподобной структуре молекулы, выступать в качестве ионофоров [1].
Каликсарены проявляют комплекс рецепторных свойств к различным по природе молекулам, что объясняется амфифильным характером их молекул. Согласно литературным данным, эти соединения эффективно связывают ионы щелочных, щелочноземельных металлов [2], а—аминокислот и а —гидроксикислот [ 3].
Именно эти их свойства позволяют надеяться на положительные эффекты при использовании специфичных комплексообразователей в качестве регуляторов процессов метаболизма у бактерий.
Экспериментальная часть
В настоящей работе исследовалось влияние следующих комплексообразователей:
а) неспецифических: натриевой соли ЭДТА (ТрилонаБ), оксиэтилидендифосфоновой кислоты (ОЭДФ);
б) специфического: сульфонатного каликс(4)арена — СКА.
Все исследованные соединения проявляют высокую селективность по отношению к ионам Na+, а неспецифические— также к ионам щелочных металлов.
Объектом исследования являлся консорциум Bacillus badius, выделенный из клубней здорового картофеля. На основании предварительных исследований было установлено, что данный изолят обладает фунгицидной активностью по отношению к фитопатогенным грибам р. Helmin-thosporium, р. Altemaria, р. Penicillium и р. Aspergillus, р. Xanthomonas, р. Erwinia. В качестве тест-объектов при определении антигрибной активности использовали Alternaria sp. Культуру фитопатогенного гриба поддерживали на кислом картофельном агаре (ККА) [4].
Штамм Bacillus badius культивировали на жидкой натуральной среде, содержащей отвар картофеля и неохмеленного пивного сусла (8°Б) в соотношении 1:3. В качестве буфера использовался мел. Процесс выращивания бацилл вели в присутствии в питательной среде комплексооб-разователей в общем диапазоне 10"1-10"20 г/л с шагом 10"1 г/л. Выращивание культуры проводилось трое суток при температуре 30°C на качалках, обеспечивающих непрерывное вращение колб.
О влиянии комплексообразователей на культуру бацилл судили по изменению концентрации биомассы в процессе культивирования и по способности подавлять рост Alternaria dianhi. Концентрацию биомассы определяли турбидиметрическим методом с помощью фотоэлектроколориметра ФЭК-56М при Л=490нм.
Способность штамма подавлять рост микромицетов определяли методом лунок путем высева культуральной жидкости на инокулированный спорами тест-гриба ККА. Засеянные чашки помещали на 7 дней в термостат при температуре 25° С. Биологическую активность консорциума определяли, измеряя расстояние (мм) от края лунки до начала роста гриба Alternaria dianhi. Консорциум, выделивший антибиотические вещества, образовывал вокруг лунок зоны угнетения роста, четко выделившиеся на фоне сплошного грибного роста. Для сравнения использовалась чашка Петри с бактериальным консорциумом, выращенным без добавления комплексообразователя.
Методом ЯМР-релаксометрии был проведен контроль за структурно-динамическим состоянием молекулярной системы. Измерения времен релаксации ядер водорода проводились на лабораторном ЯМР-релаксометре с рабочей частотой 19 МГц и временем нечувствительности приемо-передающего тракта 7 мкс. Поведение спадов свободной индукции (ССИ) оценивалось после прохождения 90-градусного импульса, а спадов поперечной намагниченности (СПН) - из отклика на последовательность КПМГ [5] с последующим определением релаксационных параметров с помощью ЭВМ. Для анализа методом ЯМР использовались образцы бацилл, которые готовились путем отделения бактериальных клеток от культуральной жидкости. Для этого точно отмеренный пипеткой объем тщательно перемешанной культуры выливали в центрифужные пробирки, где центрифугировали в течение 20 минут при 3000 об/мин. Надосадочная жидкость осторожно сливалась, а осадок 2 - 3 раза промывался дистиллированной водой и снова центрифугировался при том же числе оборотов. Для получения «сухих» образцов, т.е. содержащих как можно меньше свободной и связанной влаги, образец, полученной по выше описанному способу намазывали тонким слоем на стекло и помещали в сушильный шкаф при температуре 80-90°С на 20 мин, а затем охлаждали в эксикаторе в течение получаса. Массу полученного таким образом образца измеряли на аналитических весах. Процедуру сушки и охлаждения продолжали до тех пор, пока масса не становилась постоянной, после чего образец измельчали в фарфоровой ступке и помещали в капилляры для ЯМР-анализа.
Результаты и их обсуждения
Как видно из рисунков 1 и 2, природа и концентрация комплексообразователя существенно влияют на поведение Bacillus badius в ходе культивирования. В частности, наблюдается значительное количество острорезонансных пиков на кривых концентрационных зависимостей параметров, характеризующих различные проявления активности консорциума бацилл. Качественный анализ распределения экстремумов по оси ординат свидетельствует о том, что их расположение и чередование не являются случайными и могут быть обусловлены наличием корреляции (положительной или отрицательной) между определенными микробиологическими процессами, протекающими в присутствии химических добавок.
Рис. 1 - Зависимость параметров активности Bacillus badius от концентрации и природы химической добавки, используемой при их культивтровании: а - прирост биомассы, b - диаметр зон задержки роста;! - Трилон Б; 2 - ОЭДФ; 3 - СКА; к -линия контроля; — €—— линия эквимолярности числа микроорганизмов и молекул комплексообразователей; — ◊------линия площадей поверхностей микроорга-
низмов и комплексообразователей (рассчитано в предположении, что объем одной бациллы ~ 10- м , площадь ее поверхности - 10" м ; начальная концентрация микроорганизмов, равная 1г/л; плотность бацилл~103 кг/м3; стрелки оси абсцисс-положение экстремумов соответствующих кривых)
Прежде всего, необходимо отметить, что на зависимости прироста биомассы ДХ от обратного логарифма концентрации комплексообразователя (lg*C=—lgC) наблюдается (рис. 1а) общий для всех соединений максимум при lg*C=8 (явный для Трилона Б и неявный для СКА, но неявный (размытый) для ОЭДФ), после которого с ростом lg*C обнаруживается следующий экстремум (минимум - у Трилона Б и максимумы - у ОЭДФ и СКА). Характерно, что положение низкотемпературных экстремумов функций AX(lg*C) для систем с комплексонами (Трилон Б и ОЭДФ) близко соответствует области эквимолярных соотношений между концентрациями бацилл (AX) и молекул комплексообразователей в
культуральной среде (смотри lgC по линии------). Однако положение аналогичного пика у
каликс(4)арена (lg*C=12) отвечает приблизительной пропорции: 1 молекула СКА на 100 бацилл. При этом вне зон экстремумов функция AX(lg*C) представляет собой прямую, лежащую несколько ниже и почти параллельно контрольной линии, но с небольшим подъемом, пропорциональным lg*C. В то же время значения AX(lg*C) комплексонов в исследованном диапазоне концентраций не опускаются ниже контрольных.
Фунгицидная активность Bacillus badius в присутствии всех комплексообразовате-лей преимущественно подавляется (рис. 1b). Однако и в этом случае зависимости D(lg*C) носят периодический («колебательный») характер. При этом точки перегибов в средней области значений lg*C (—7^13) у СКА близки или близко совпадают с соответствующими экстремумами функций AX(lg*C) (рис. 1а). При больших lg*C (>15) система с каликс(4)аренном демонстрирует фунгицидную активность, превышающую контрольный уровень. Ряд значений D(lg*C) системы с Трилоном Б в области высоких (выше эквимолярных) концентраций ком-плексона (lg*C ^ 7) также оказался выше контроля. Характерно, что в этой области lg*C функции ДX всех комплексообразователей меняются плавно (рис. 1а). В то же время содержание белка и сахара в культуральной жидкости (рис. 2), хотя и по-разному, но коррелирует с поведением обоих параметров активности биомассы, представленных на рис. 1. Здесь в области высоких концентраций комплексонов (малых lg*C^7) наблюдается отрицательная корреляция между концентрацией сахаров (рисунок 2а) в культуральной жидкости и фунгицидной активностью биомассы (рис. 1b). Однако для системы с ОЭДФ характерна положительная корреляция между содержанием белков (рис. 2b) и антибиотиков (рис. 1b), хотя в присутствии Трилона Б фунгицидная активность биомассы в основном меняется антибат-но концентрации белка в культуральной жидкости. В среднем диапазоне значений lg*C (—7^13) все функции 1отн для сахаров в первом приближении меняются симбатно ДX. 1отн для белков ведут себя аналогично 1отн для сахаров у систем с комплексонами, в то время как в случае СКА концентрация белков не меняется и соответствует контролю.
Наиболее интересным и неожиданным является поведение микробиологической системы в области сверхвысоких концентраций Трилона Б (lg*C —7^ 13), когда резкое снижение прироста биомассы происходит на фоне аналогичного спада в содержании белков и сахаров, но при этом сопровождается существенной активизацией фунгицидной активности системы (рис 1,2). Наблюдаемая закономерность может быть обусловлена выделением антибиотических соединений небелковой природы, например, аминогликозидов [6].
Аналогичным образом можно описать специфику воздействия комплексообразова-телей на процесс культивирования Bacillus badius в рамках каждого из экспериментально определившихся характеристических диапазонов варьирования lg*C: высоко-(lg*C —2^7) и низкоконцентрационного (lg*C—14^20), а так же промежуточного (lg*C—8^13) или условно «эквимолярного» (то есть область значений lg*C, относительно близких к эквимо-лярному соотношению между бациллами и молекулами комплексообразователей).
Рис. 2-Относительное изменение состава культуральной жидкости в зависимости от концентрации и природы химических добавок при культивировании Bacillus badius: а - содержания сахара (начальная концентрация Снач = 6,3 г/л); b - содержание белков (Снач = 0,16 г/л); К-линия контроля; 1 - Трилон Б; 2 -ОЭДФ; 3 - СКА; стрелки у оси абсцисс-положение экстремумов соответствующих кривых
Отсюда область 1д*С~[0,1] можно условно считать «равновесовым» диапазоном. Следовательно, в равновесовом диапазоне 1д*С Трилон Б стимулирует выделение небелковых антибиотиков. Резкий и взаимосвязанный рост содержания белков, сахаров и фунгицидной активности в области !д*С(~2^7) на фоне стандартного прироста биомассы может свидетельствовать о том, что фактический прирост намного больше, но его уровень понижается разрушением (лизисом) части биомассы, по—видимому, не без участия Трилона Б. Поэтому не случайно при дальнейшем снижении концентрации комплексона в следующем (эквимо-лярном) диапазоне !д*С сначала наблюдается резкий скачок прироста биомассы, а затем его существенный спад ниже контрольного уровня с минимумом, практически точно соот-
ветствующим эквимолярному соотношению между количеством бацилл и молекул ком-плексообразователя. Этот переход сопровождается снижением содержания сахара и белка в культуральной жидкости аналогично тому, как это происходит в равновесовом диапазоне. Можно предположить, что в интервале lg*C (—0^11) Трилон Б преимущественно стимулирует выделение антибиотиков. Однако этот процесс реализуется по разным механизмам и, соответственно, можно предположить, что синтезируются антибиотики различной природы или строения. А в области перехода от одного (условно «эквимолярного») механизма к другому («равновесовому») происходит скачок прироста биомассы (lg*C —8). Характерно, что у второго комплексона (ОЭДФ) аналогичный процесс происходит при lg*C 9^10 и также хорошо соответствует «эквимолярному» механизму угнетения биомассы, который сопровождается (или инициирует) процессы лизиса. В то же время в области между эквимолярным и равновесовым диапазонами (который теперь более логично называть не «высококонцентрационным», а «промежуточным») плавный прирост биомассы происходит на фоне не только снижения концентрации белков и, соответственно, фунгицидной активности, но и относительного увеличения содержания сахаров в культуральной жидкости. Не исключено, что подобная закономерность обусловлена продуцированием антибиотиков аминогликозидной природы, которые, в отличие от антибиотиков полипептид-ной природы обладают не фунгицидной, а бактерицидной активностью, а также могут регистрироваться в составе культуральной жидкости как одна из разновидностей сахаров. Поскольку оба максимума (lg*C—8 и 9) почти совпадают, то можно предположить, что в случае ОЭДФ мы имеем дело не столько с конкуренцией (как в присутствии Трилона Б), а, скорее с сочетанием (сосуществованием) двух механизмов активизации биологической активности Bacillus badius под воздействием ОЭДФ. Характерно, что наблюдаемые максимумы AX в том же (эквимолярном) диапазоне концентраций СКА сопровождаются соответствующими максимумами (относительным (ниже контроля) или абсолютным (выше контроля)) всех остальных показателей культивирования, кроме содержания белков, которое полностью соответствует контрольному уровню во всем эквимолярном диапазоне изменения концентрации каликс(4)арена. При этом один из пиков зависимости AX(lg*C) на 2 порядка ниже, а второй на два порядка выше точного эквимолярного соотношения между количеством бацилл и молекул СКА. Отсюда низкоконцентрационный пик (lg*C—12) не наблюдаемый у комплексонов, может быть связан с транспортными и (или) каталитическими процессами с участием молекул каликс(4)арена. В то же время высококонцентрационный пик (lg*C—8), как уже отмечалось ранее, характерен для всех комплексообразова-телей и поэтому может быть так же, как и в случае ОЭДФ, связан с продуцированием антибиотиков аминогликозидной природы. Отсюда экстремумы, расположенные между высоко- и низкоконцентрационными пиками AX, должны свидетельствовать о переходе к продуцированию антибиотиков полипептидной природы.
Анализ структурно-динамического состоянии биомассы импульсным методом ЯМР (рис. 3) показывает, что в составе как частично обезвоженной («паста», кривые под № 1), так и высушенной после центрифугирования культуральной среды (кривые 2, 3) можно выделить до трех протоносодержащих компонент, существенно различающихся по молекулярной подвижности и (или) плотности упаковки (динамические «фазы» с индексами a,b,c). Содержащие более подвижные элементы (фазы «а» и «b» с максимальными и промежуточными значениями поперечных времен ядерной магнитной релаксации Т2а и Т2ь) соответствуют Ло-ренцевой форме линии поглощения ЯМР. Поэтому параметры Т2а, Т2Ь, P2a и Р2Ь можно использовать для характеристики состояния жидкой фазы в составе микробиологической системы, в том числе - оценивать транспортные процессы, протекающие в водной среде.
Судя по «Г ауссоподобной» форме соответствующих кривых ССИ процессы ЯМР — релаксации, наблюдаемые в рамках фазы «с», занимают положение, промежуточное между твердо— и жидкофазными системами и поэтому количественно, как правило характеризовались эффективным временем Т2а. Последнее определялось как время уменьшения амплитуды сигнала в "е" раз. Отсюда под фазой «с» следует понимать наиболее жесткие («твердо» - или кристаллоподобные) и (или) высокомолекулярные компоненты культуральной среды, в том числе -любые (поли)сахариды или полипептиды как в составе внешней оболочки, так и внутренней полости бациллярного объема. Характерно, что значения Т2с модельных соединений этих классов при нормальных условиях лежат в диапазоне 15^50 мкс (!д Т2 ~ 1,2 1,7).
Рис. 3 - Зависимость параметров ЯМР—релаксации бациллярной биомассы от содержания культуральной жидкости, природы и концентрации комплексообразова-телей использованных при культивировании: 1,2-Трилон Б, 3-СКА; 1-паста, 2,3-сухая биомасса; 1а,2а,3а, - Т2а,Р2а-длинная компонента СПН; 1Ь,2Ь,3Ь-Т2Ь,Р2Ь-
с с ^^™2 с 2 с
промежуточная компонента СПН; 2 ,3 -Т ,Р -короткая компонента СПН или ССИ; —Ь - предполагаемый ход кривых к контрольным значениям
ЯМР-параметры (рис. 3) зависят от концентрации и природы использованного при культивировании комплексообразователя, а также методики приготовления образцов и, соответственно, количества и состава культуральной жидкости и биомассы в составе препаратов, анализируемых импульсным методом ЯМР. В частности, дальнейшее высушивание пасты, содержащей Трилон Б (переход от образца 1 к образцу 2) сопровождается:
а) смещением положения минимума зависимости Т 2а от концентрации комплексона из области !д*С> 10 к значению !д*С~5;
б) противоположным смещением минимума Т2ь за правую границу интервала 5<!д*С< 10, причем в точке !д*С~5 одновременно с этим проявляется ранее не наблюдавшийся максимум Т2ь (и / или Т2с);
в) плавное изменение населенностей Р2|(!д*С) у пастообразного образца (№1) (рост Р2ь и падение Р2а) сменятся нелинейным поведением тех же функций, характеризующих относительно сухую биомассу (образец №2): здесь наблюдаются слабые экстремумы при !д*С—5 (минимум Р2а и максимум Р2Ь ( + Р2С)).
Предположим, что фаза «а» представляет собой остатки культуральной жидкости, локализованные на поверхности микроорганизмов, а фаза «Ь»— продукты лизиса и иные, относительно низкомолекулярные производные биомассы. И, как уже упоминалось выше, фаза «с», благодаря возможности сравнения с модельными соединениями, может быть достаточно достоверно идентифицирована как (поли)сахариды и (или) полипептиды в составе бациллярных клеток вообще и клеточной оболочки в частности. В этом случае она характеризует поведение твердоподобных фрагментов не только в составе целых микроорганизмов, но и разрушенных клеток. Тогда, опираясь на вышеописанную модель природы наблюдаемых параметров ЯМР - релаксации, можно сделать следующие выводы. Поскольку при высушивании биомассы меняются не только абсолютные значения ЯМР -параметров, но и форма их зависимостей от концентрации комплексона, то Трилон Б является непосредственным участником и (или) косвенным «регулятором» обменных (транспортных) процессов между низкомолекулярными и (или) жидкофазными компонентами биомассы, например, разделенных клеточной оболочкой. Наблюдаемые экстремальные зависимости параметров ЯМР- релаксации от !д*С также свидетельствуют
о том, что вводимое соединение не становится только чисто стерическим фактором в составе культуральной среды. При этом экстремумы ЯМР - параметров микробиологической системы с Трилоном Б, соответствующие области максимальной активности обменных процессов, приходятся на диапазон !д*С—[5,10], где также наблюдаются экстремумы функций АХ(!д*С) (рис. 1а). Присутствие комплексообразователя иной природы (каликс(4)арена) существенно меняет ситуацию в культуральной среде. Прежде всего, в системе с СКА (образец 3), как и в сухом контрольном образце, хорошо различаются все три динамические фазы (а,Ь,с), ЯМР - параметры которых относительно слабо меняются в зависимости от концентрации комплексообразователя. Но и в этом случае при !д*С=10^11 наблюдаются экстремумы населенностей фаз «Ь» и «с» , которые меняются антибатно (максимум у Р2ь, минимум у Р2с) и при этом совместно характеризуют поведение преимущественно внутриоболочечных структур в биомассе. Одновременно ЯМР -параметры фазы «а» (культуральной жидкости вне оболочки микроорганизмов) образца с СКА превышают соответствующие значения для систем с Трилоном Б (образцы №1 и №2), но при этом ведут себя аналогично последним. Это позволяет сделать вывод о том, что в образце № 3 воздействие комплексообразователя на транспортные процессы минимально, а основной свой вклад молекулы каликс(4)арена вносят в процессы внутриклеточного метаболизма, в том числе в их транспортную составляющую. Однако не исключаются и другие варианты воздействия СКА на биохимические процессы в бациллярных системах,
процессы в бациллярных системах, поскольку наблюдаемые перераспределения значений Р2ь и Р2с (то есть доли менее и более высокомолекулярных и (или) жестких структур) во внутриклеточном объеме связаны с изменением концентрации каликс(4)арена в культуральной среде.
Результаты анализа рисунков 1-3 могут быть представлены в более наглядной форме, если их изложить в рамках естественной для концентрационных данных системы координат, опорными точками в которой служат характерные пропорции между компонентами системы. В частности, таковыми можно считать точки эквимолярного, равновесового и эквиповерхностного соотношения между микроорганизмами и молекулами биологически активных добавок - комплексообразователей в данном случае. Чтобы определить эти точка, например, для начальной концентрации микроорганизмов, равной 1 г/л, зададимся
16 3 10 2
средним объемом 1 бациллы (~10" м ), площадью ее поверхности (~ 10" м ) и плотностью (~ 103 кг/м3). Тогда равенству числа молекул комплексообразователей и числа микроорганизмов в культуральной среде соответствует значение 1д*С=11, равенству поверхностей тех же компонентов — 1д*С=5. а их массы (или веса) — 1дС=0. С учетом приблизительного характера проводимых расчетов будем полагать, что реальные величины 1д*С лежат в интервале ±1 от теоретически рассчитанных. Отсюда весь исследованный диапазон можно разбить на следующие условные участки:
1 1 3 5 7 3 12 14 16 18 ]£*(-■
где I - равновесовой (массообменный) диапазон;
II - эквимолярный (поверхностно—активный) диапазон;
III - эквимолярный (молярно—активный) диапазон, а также промежуточные и (или) производные от них интервалы:
I' - массово—активный (массово—каталитический или диффузионный);
II' - поверхностно—каталитический;
III' - молярно—каталитический.
Это позволяет более конкретно говорить о природе возможных механизмов воздействия комплексообразователей на микробиологическую систему в том или ином диапазоне |д*с. Исходя из вышеописанной системы координат и данных рисунков 1—3, можно заключить, что:
а) активность комплексонов связана преимущественно с явлениями переноса между границами разной природы (диффузионной, мицеллярной (ассоциативной), оболочеч-ной), в то время, как каликс(4)арен участвует не только в поверхностно—каталитических, но и молекулярно—каталитических процессах, протекающих во внутри—клеточном пространстве;
б) общим для изучения комплексообразователей является воздействие на динамику процессов переноса масс через клеточную оболочку как непосредственно (по имеющимся каналам), так и косвенно, например, путем встраивания в структуру оболочки и(или) формирования в ней независимых(сквозных)каналов (последнее более вероятно для СКА, поскольку каликсарены известны как соединения, способные образовывать каналоподобные ассоциаты [1]);
в) присутствие комплексообразователей не безразлично для процессов продуцирования антибиотиков; при этом смена механизма (к примеру, «диффузионного», «поверхностно-активного» или «молярно-активного»), а с ним - строения или природы антибиотика (белковые и небелковые, аминогликозидные или полипептидные, и т.п.) сопровождается скачком прироста биомассы, обусловленным временным торможением процессов лизиса;
г) присутствие любого комплексообразователя снижает фунгицидную активность Bacillus badius в основном вследствие частичной или полной переориентации процессов продуцирования антибиотиков в сторону соединений, обладающих бактерицидной активностью; определенное значение может иметь и блокировка активных центров соединений, ответственных за тот или иной тип метаболизма и (или) питания микроорганизмов.
Литература
1. Фегтле Ф. Химия комплексов «гость—хозиян» /Ф. Фегтле, Э. Вебер. - М.: Мир, 1988. - 511 с.
2. Nobuhico Iki. //Tenrahedron Letters. 1999. V. 40. P. 120—134.
3. www.dionis.kfti.knc.ru/rub/3/4/3—2.htm
4. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практическое пособие / Под ред. Н.С. Егорова.- М.: МГУ, 1983.- 215 с.
5. Фаррар Т. Импульсная и фурье—спектроскопия ЯМР /Т. Фаррар, Э. Беккер. - М.: Мир, 1973. -188 с.
6. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. - М.: МГУ, 2004. - 528с.
© А. Ю. Крыницкая - канд. биол. наук, доц. каф. пищевой биотехнологии; П. П. Суханов - д-р хим. наук, проф. той же кафедры; Т. А. Опалева - асп. той же кафедры; В. С. Гамаюрова - д-р хим. наук, проф., зав. каф. промышленной биотехнологии; С. Е. Соловьева - канд. хим. наук, ИОФХ КНЦ РАН; Е. В. Мищенко - студ. КГТУ.
