CC BY
72
УДК 615.272.4:574.52:616.45-001.1/3:616-092.9
МЕХАНИЗМЫ КОРРЕКЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА АНТИОКСИДАНТАМИ ИЗ МОРСКИХ ГИДРОБИОНТОВ ПРИ АЛИМЕНТАРНЫХ ДИСЛИПИДЕМИЯХ
Вера Иннокентьевна ЯНЬКОВА1, Вера Васильевна КНЫШОВА1, Вадим Зиновьевич ЛАНКИН2
владивостокский филиал ДНЦ ФПД СО РАМН — НИИ МКВЛ 690105, г. Владивосток, ул. Русская, 73г
Институт клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова,
ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росздрава 121552, г. Москва, ул. 3-я Черепковская, 15а
Представлены результаты, подтверждающие эффективность применения комплексов, содержащих биологически активные субстанции из морских гидробионтов, для коррекции дисбаланса между прооксидантными и анти-оксидантными процессами при алиментарных дислипидемиях у экспериментальных животных. Обсуждаются возможные механизмы регуляции окислительного стресса антиоксидантами из морских гидробионтов.
Ключевые слова: окислительный стресс, дислипидемия, антиоксиданты.
Течение многих заболеваний и патологических процессов сопровождается нарушением окислительно-восстановительного баланса в организме. Для описания дисбаланса в системе «прооксиданты — антиоксиданты» в последние годы стал применяться термин «окислительный стресс», который позволяет описывать состояния, наблюдаемые в клетках, тканях и в целом организме [1]. Проблема изучения клеточно-молекулярных механизмов развития и коррекции окислительного стресса является необычайно актуальной, так как затрагивает большое число патологических состояний [1], в том числе и сопровождающихся нарушениями липидного статуса организма — дислипидемиями (ДЛП). Развитие алиментарной ДЛП характеризуется системными изменениями метаболизма липидов в сыворотке крови, в печени как в органе-мишени [2] и сопровождается активацией процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) [3].
В настоящей статье представлены результаты изучения механизмов антиоксидантного действия комплексов, содержащих биологически активные субстанции из морских гидробионтов, их эффективности при коррекции окислительного стресса у экспериментальных животных с моделями алиментарных дислипидемий.
Материалы и методы
Исследования проведены на 42 половозрелых крысах-самцах линии Вистар массой 200—250 г, у которых воспроизводили модели алиментарных ДЛП, вызванные холестериновой нагрузкой и разбалансированными по составу жиров и угле-
водов рационами питания. Содержание животных в виварии соответствовало «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник» от 06.04.1993. Исследования осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977). Эвтаназию животных проводили путем декапита-ции под легким эфирным наркозом.
Развитие 1-й модели алиментарной ДЛП осуществляли по модифицированной авторами методике А. КоюЫ [4]: крысы-самцы в течение 11 недель находились на основном рационе, обогащенном холестерином (2 % от массы рациона), свиным салом (10 %), сахаром (5 %) и холевой кислотой (0,5 %). 2-я модель алиментарной ДЛП воспроизводилась в течение 4-х недель путем увеличения в составе основного рациона питания животных доли холестерина (2,5 % от массы рациона) и сливочного масла (25 %) [5].
Оценка состояния системы пероксидации липидов проводилась по содержанию в ткани печени продуктов пероксидации липидов — диеновых конъюгатов (ДК) [6], малонового диальдегида (МДА) [7], Шиффовых оснований (ШО) [8]; системы антиоксидантной защиты (АОЗ) — по уровню низкомолекулярных антиоксидантов а-токоферола (витамин Е) и ретинола (витамин А) [9, 10], показателей глутатионзависимого звена антиоксидант-ной защиты — восстановленного глутатиона (ГЛ) [11], активности ферментов глутатионпероксидазы (ГП) и глутатионредуктазы (ГР) [12].
Янькова В.И. — канд.б.н., доцент, ученый секретарь, e-mail: [email protected] Кнышова В.В. — канд.м.н., старш.н.с. лаборатории восстановительного лечения Ланкин В.З. — д.б.н., проф., зав. лабораторией свободнорадикальных процессов
Для коррекции окислительного стресса у крыс с 1-й моделью алиментарной ДЛП использовали эхинохром, выделенный из морских ежей, в виде композиции с медом для улучшения органолептических свойств и повышения биодоступности при пероральном использовании (разработана в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН). Данную композицию вводили интра-гастрально в дозе 0,25 мг/кг массы животного. Курсовая доза действующего вещества (эхинохром) составила 2,5 мг/кг массы животного. Курс введения — 10 дней.
Коррекция окислительного стресса при алиментарной ДЛП (2-я модель) осуществлялась при помощи композиции белково-полисахаридного комплекса, выделенного из трепанга Лро511сИорш ]аротсш, и модифицированного цитрусового пектина (разработана ООО «Ковчег-111»). Белковая часть комплекса представлена 8-ю белками, доминирующим из которых является белок с молекулярной массой 120 кДа. Основная структурная единица полисахаридной части комплекса — ней-раминовая кислота. Введение пищевой композиции осуществляли ежедневно интрагастрально до
кормления через зонд из расчета 7 мг/кг массы тела крысы. Курс введения составил 35 дней.
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных программ «81аЙ8Йса 6.0». Результаты представлены в виде М ± т, где М — среднее арифметическое значение, т — ошибка среднего арифметического значения. Различия между группами оценивали с помощью непараметрического критерия серий Вальда — Вольфовица для независимых выборок, различающихся не только средними значениями, но и формой распределения.
Результаты и обсуждение
Алиментарные ДЛП сопровождались развитием окислительного стресса (табл. 1), проявляющегося нарушением физиологического баланса между интенсивностью свободнорадикального окисления липидов и функциональной активностью антиок-сидантной системы.
Об усилении активности процессов ПОЛ в печени свидетельствовало статистически значимое (р = 0,002) увеличение содержания продуктов окисления липидов на всех стадиях перекисного каскада: первичных и конечных продуктов (ДК, МДА, ШО)
Показатели пероксидации липидов и антиоксидантной защиты в печени животных при алиментарных дислипидемиях
Таблица 1
Показатель Алиментарная ДЛП (1-я модель) Алиментарная ДЛП (2-я модель)
Контрольная группа, п = 7 Опытная группа, п = 7 Контрольная группа, п = 7 Опытная группа, п = 7
Содержание ДК, нмоль/мг липидов 4,95 ± 0,08 9,66 ± 0,25** 3,71 ± 0,24 9,34 ± 0,23**
Содержание МДА, нмоль/мг белка 1,77 ± 0,09 4,76 ± 0,22** 2,07 ± 0,06 4,66 ± 0,15**
Содержание ШО, у.е./мг липидов 16,80 ± 0,58 25,00 ± 0,77** 11,26 ± 0,33 17,62 ± 0,34**
Активность ГЛ, мкг/мг белка 19,15 ± 0,32 13,17 ± 0,33** 8,03 ± 0,12 4,96 ± 0,11**
Активность ГР, нмоль НАДФН/(мин х мг белка) 1,79 ± 0,14 0,77 ± 0,04** 1,64 ± 0,10 1,12 ± 0,04**
Активность ГП, нмоль ГЛ/(мин х мг белка) 1,27 ± 0,03 0,93 ± 0,02** 0,91 ± 0,02 0,75 ± 0,05*
Содержание а-токоферола, нг/мг липидов 173,15 ± 4,06 67,50 ± 2,30** 233,6 ± 8,13 176,75 ± 5,18**
Содержание витамина А, нг/мг липидов 71,05 ± 2,78 54,40 ± 2,73** 87,04 ± 1,99 78,35 ± 4,87
Примечание: отличие от контрольной группы достоверно: * — при р = 0,05; ** — при р = 0,002. БЮЛЛЕТЕНЬ СО РАМН, ТОМ 30, № 1, 2010 г. 65
у животных с 1-й моделью ДЛП на 95, 169, 48 % и у животных со 2-й моделью ДЛП на 152 %, 125 %, 56 % соответственно по сравнению с животными контрольных групп. Интенсификация процессов ПОЛ в печени крыс имела особенности в зависимости от состава атерогенной диеты, используемой для развития алиментарных ДЛП. Следует отметить, что у крыс со 2-й моделью алиментарной ДЛП процессы ПОЛ протекали наиболее интенсивно на стадии образования первичных продуктов, о чем свидетельствовало значительное увеличение количества ДК, т. к. обнаружение диеновой конъюгации в биологических мембранах является чувствительным тестом на появление гидроперекисей липидов
[13]. У животных с 1-й моделью ДЛП максимальная активация процессов ПОЛ осуществлялась на стадии образования конечного продукта — МДА и ШО, являющихся продуктами последующей конденсации МДА с различными аминопроизводными субстратами. Данный факт подтверждался суммарным изменением этих показателей у особей с 1-й моделью ДЛП (217 %), превышающим на 36 % соответствующий показатель у животных со 2-й моделью ДЛП (181 %).
Отмечаемое при ДЛП (1-я модель) угнетение ферментативного глутатионзависимого звена АОЗ выражалось в снижении активности ГП на 26 % (р = 0,002) и ГР на 57 % (р = 0,002), обуславливающих понижение в ткани печени пула восстановленного ГЛ на 31 % (р = 0,002). Уменьшение содержания низкомолекулярных антиоксидантов — витаминов Е
на 61 % (р = 0,002) и А на 23 % (р = 0,002) — свидетельствовало об истощении резервов АОЗ в печени в ответ на усиление ПОЛ. При ДЛП, индуцированной 2-м рационом, в ткани печени крыс изменения активности глутатионзависимых ферментов были менее выражены по сравнению с крысами, находящимися на 1-м экспериментальном рационе: активность ГП снижалась на 17 % (р = 0,05) и ГР на 32 % (р = 0,002), что приводило к снижению резерва глу-татиона в качестве восстановительного эквивалента на 38 % (р = 0,002). При этом в печени животных уменьшалось содержание только а-токоферола (на 24 %, р = 0,002) при сохранении концентрации витамина А на уровне данного показателя у крыс контрольной группы.
При развитии окислительного стресса у животных с 1-й моделью алиментарной ДЛП наблюдался наиболее выраженный редокс-дисбаланс, сопровождающийся более высокой интенсивностью процессов ПОЛ с преимущественным образованием конечных продуктов и более глубоким угнетением антиоксидантной защиты на уровне редокс-системы глутатиона и низкомолекулярных антиоксидантов. Поэтому при выборе средства для коррекции наиболее выраженных нарушений в системе «ПОЛ — АОЗ» у крыс в условиях окислительного стресса, по-нашему мнению, предпочтительно было использовать композицию эхинохрома с медом, антиоксидантное действие которой обусловлено присутствием активного начала — 2,3,5,6,8-пентагидрокси-7-этил-1,4-нафтохинона
Таблица 2
Показатели системы «ПОЛ — АОЗ» в печени крыс с алиментарными ДЛП после введения антиоксидантов морского происхождения
Показатель Алиментарная ДЛП (1-я модель) + + композиция эхинохрома и меда, n = 7 Алиментарная ДЛП (2-я модель) + композиция белково-полисахаридного комплекса и цитрусового пектина, п = 7
Содержание ДК, нмоль/мг липидов 71 %** 74 %*
Содержание МДА, нмоль/мг липидов 67 %** 60 %*
Содержание ШО, у.е./мг липидов 72 %** 76 %*
Активность ГЛ, мкг/мг белка 135 %** 109 %
Активность ГП, нмоль ГЛ/(мин x мг белка) 116 %** 101 %
Активность ГР, нмоль НАДФН/(мин x мг белка) 145 %** 133 %*
Содержание а-токоферола, нг/мг липидов 144 %** 106 %
Содержание витамина А, нг/мг липидов 116 % 98 %
Примечание: за 100 % принято значение показателя у крыс с моделью ДЛП; изменение значимо: * - при р = 0,004, ** - при р = 0,002.
(эхинохром), относящегося к классу водорастворимых антиоксидантов — полигидроксинафтохи-нонам.
Коррекция окислительного стресса при действии данной композиции у крыс с алиментарной ДЛП (1-я модель) сопровождалась увеличением в ткани печени активности ГП (на 16 %, р = 0,002), катализирующей процесс удаления гидроперекисей липидов с участием в качестве восстановительного эквивалента эндогенного глутатиона (табл. 2).
Удаление липопероксидов предотвращает разветвление цепей и тем самым резко тормозит процесс свободнорадикального окисления (СРО) липидов, что подтверждалось достоверным (р = 0,002) уменьшением содержания конечного продукта ПОЛ — МДА на 33 %, а также вторичных продуктов взаимодействия МДА с различными аминопроизводными — ШО — на 28 %. Значительное увеличение активности фермента ГР (на 45 %, р = 0,002), принимающего участие в восстановлении окисленного ГЛ, приводило к повышению содержания восстановленной формы ГЛ в печени крыс на 35 % (р = 0,002). Возраста-
ние содержания а-токоферола (на 44 %) в печени экспериментальных животных, по-видимому, связано со снижением его потребления для инактивации перекисных радикалов липидов в результате конкурентного участия в данном процессе эхинохрома.
Механизмы антиоксидантного действия эхинохрома имеют двойственную природу и обусловлены способностью полигидроксинафтохинонов, с одной стороны, перехватывать свободные радикалы, возникающие при перекисном окислении мембранных липидов, с другой — тормозить Бе2+-индуцированное окисление липидов в результате связывания прооксиданта (катионы двухвалентного железа) в малоактивный комплекс [14]. Эхинохром стимулирует антирадикальную и антипе-рекисную линии защиты.
Полученные нами результаты свидетельствовали, что активация антиперекисной линии АОЗ может происходить также за счет восстановления глутатионом пероксидов липидов в присутствии глутатиопероксидазы и глутатионредуктазы, осуществляющей регенерацию окисленного глутатио-на в восстановленный (рис.).
Механизмы действия антиоксидантов из морских гидробионтов
Детоксикация АФК: супероксиддисмутаза каталаза глутатионпероксидазы Реакции обрыва цепи - «перехват» радикалов липидов молекулами антиоксидантов -«.ловушками радикалов»
і \ і \
Уменьшение Уменьшение
содержания ДК содержания МДА
Уменьшение Увеличение
содержания МДА содержания а-ТФ
Композиция эхинохрома с медом
Композиция белковополисахаридного комплекса с модифицированным цитрусовым пектином
Первая линия защиты антикислородная Вторая линия защиты антирадикальная Третья линия защиты антиперекисная
і г і г і г
Удаление гидроперекисей липидов за счет:
• восстановления глутатионом в присутствии глутатионзависимых ферментов -глутатионпероксидаз и глутатионтрансфераз;
• глутатионредуктазы, осуществляющей регенерацию окисленного глутатиона в восстановленный глутатион.
• связывание ионов железа комплексонами.
Увеличение содержания ГЛ Увеличение активности ГП Увеличение активности ГР Уменьшение содержания МДА
Антиоксидантные свойства пищевой композиции из трепанга и пектина, проявляющиеся в ингибировании процессов ПОЛ в печени крыс при алиментарной ДЛП (2-я модель), характеризовались статистически значимым (р = 0.004) уменьшением содержания всех продуктов ПОЛ: МДА (на 40 %), ДК (на 26 %) и ШО (на 24 %) (табл. 2). Это связано, по-видимому, с активацией первой линии АОЗ — «антикислородной», осуществляющей детоксикацию активных форм кислорода ферментами супероксиддисмутазой, каталазой, т. к. большинство изученных нами показателей АОЗ сохраняли значения на уровне модели ДЛП (рис.). В пользу этого заключения свидетельствовал и тот факт, что при действии данной композиции, несмотря на сохраняющееся угнетение глутатионзависимого ферментативного звена АОЗ и истощение резерва низкомолекулярных антиоксидантов (витамины Е и А), наблюдался высокий уровень ингибирования ПОЛ, сопоставимый по интенсивности с действием композиции эхинохрома с медом, антиоксидантная активность которой осуществлялась на второй и третьей линиях защиты. Выявленная способность пищевой композиции из трепанга и пектина повышать активность ГР (на 33 %, р = 0,002) не компенсировала значительное угнетение активности этого фермента у крыс со 2-й моделью ДЛП, которая даже при коррекции окислительного стресса оставалась на достаточно низком уровне по сравнению с контрольной группой, что являлось недостаточным условием для нормализации работы редокс-системы глутатиона. В результате этого резерв восстановленного ГЛ оставался низким и не достигал физиологического уровня животных контрольной группы. Поскольку ГР является лимитирующим звеном в системе «глутатионредуктаза — глутати-онпероксидаза», факт увеличения ее активности можно интерпретировать как стимуляцию третьей линии АОЗ — антиперекисной.
В составе данной композиции присутствует водорастворимый модифицированный цитрусовый пектин, относящийся к энтеросорбентам, которые по данным разных авторов нормализуют показатели СРО (МДА, ДК, гидроперекиси липидов и др.) при ишемических и острых воспалительных процессах [15], что связано, по-видимому, со способностью пищевых волокон сорбировать эндогенные цитотоксические вещества, к которым можно отнести и продукты ПОЛ.
Выводы
Композиция эхинохрома с медом эффективно препятствует развитию у крыс при алиментарной ДЛП окислительного стресса, действуя на второй — антирадикальной и третьей — антиперекисной линиях антиоксидантной защиты. Антирадикальное действие обусловлено содержанием растворимых полигидроксинафтохинонов, которые выступают в роли перехватчиков радикалов, тем самым способствуют обрыву цепи СРО липидов. Анти-
перекисная линия защиты осуществляется за счет удаления перекисей липидов, что резко тормозит процесс разветвления цепей ПОЛ.
Механизмы действия белково-полисахаридного комплекса из трепанга и модифицированного цитрусового пектина заключаются в активации первой линии АОЗ — антикислородной, сопровождающейся инактивацией активных форм кислорода за счет ферментов, что препятствует образованию гидроксил-радикала, инициирующего СРО липидов, а также в стимуляции третьей, антиперекис-ной, линии АОЗ и сорбции цитотоксических продуктов ПОЛ.
Использование композиций, содержащих биологически активные субстанции из морских гид-робионтов, способствует коррекции окислительного стресса при алиментарных ДЛП. Механизмы и степень их корригирующего воздействия зависят от природы антиоксиданта, генеза ДЛП и степени дисбаланса между процессами пероксидации липидов и антиоксидантной защиты при окислительном стрессе.
Литература
1. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания. Новосибирск: АРТА, 2008. 284 с.
Menshikova Е.В., Zenkov N.K., Lankin V.Z. et al. Oxidative stress: Pathological states and diseases. Novosibirsk: АЯТА, 2008. 284 p.
2. Буеверова Е.Л., Драпкина О.М., Ивашкин В.Т. Атерогенная дислипидемия и печень // Рос. мед. вестн. 2008. 13. (1). 17-23.
Bueverova E.L., Drapkina О.М., Ivashkin V.T. Atherogenic dyslipidemia and the liver // Ros. med. vestn. 2008. 13. (1). 17-23.
3. Formenty B., Derson F., Pessayre D.
Microvesicular steatosis and steatohepatitis: role
mitochondrial dysfunction and lipid peroxidation // Hepatology. 1997. 26. (suppl. 1). 13-22.
4. Koichi A., Kazuhisa F, Takhi O. Simultaneous occurrence of hypercholesterolemia and hemolytic anemia in rats fed cholesterol diet // Life Sci. 1986. 39. (6). 499-505.
5. Cole T.G., Kuish I., Patseh W., Sehonfeld G. Effects of high cholesterol diets on rat plasma lipoproteins and lipoprotein-cell interactions // J. Lipid Res. 1984. 25. (6). 593-603.
6. Стальная И.Д. Метод определения диеновой коньюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. М.: Медицина, 1977. 64-66.
Stal’naya I.D. Diene conjugation of unsaturated higher fatty acids’ evaluation method // Modern methods in biochemistry / Ed. V.N. Orekhovich. М.: Medicine, 1977. 64-66.
7. Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тио-
барбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. М.: Медицина, 1977. 66-68.
Stal’naya I.D., Garishvili T.G. The method of determination of malondialdehyde by thiobarbituric acid // Modern methods in biochemistry / Ed. V.N. Orekhovich. М.: Medicine, 1977. 66-68.
8. Shimasaki H, Hirai N., Ueta N. Comparison of fluorencence characteristics of products of peroxidation of membrane phospholipids with those of products derived from reaction of malonaldehyde with glycine as a model of lipofucsin fluorescent substances // J. Biochem. 1988. 104. 761-766.
9. Bidlack W.R., Tappel A.L. Fluorescent products of phospholipids during lipid peroxidation // Lipids. 1973. 8. (4). 203-207.
10. Taylor S.L., Lamden M.P., Tappel A.L. Sensitive fluoremetric method for tissue tocopherol analysis // Lipids. 1976. 11. 530-538.
11. Moron M.S., Depierre J.W., Mannervik B. Levels of glutathione, glutathione-reductase and glutatione S-transferase activities in rat lung and liver // Biochim. Biophys. Acta. 1979. 582. 67-78.
12. Carlberg I., Mannervik B. Purification and characterization of the flavoenzyme glutathione
reductase from rat liver // J. Biol. Chem. 1975. 250.
(14). 5475-5480.
13. Васильева Е.М. Перекисное окисление липидов в аорте нормотензивных и спонтанно ги-пертензивных крыс при сахарном диабете // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. 1992. (5). 495-496.
Vasilyeva Е.М. Lipids peroxidation in aorta of normotensive and spontaneous hypertensive rats in case of diabetes mellitus // Bull. eksperim. biologii i meditsiny. 1992. (5). 495-496.
14. Лебедев A.В., Богуславская Л.В., Левицкий Д.О., Максимов О.Б. Механизмы ингибирования Fe2+-индуцированного окисления фосфа-тидилхолинов полигидроксинафтахинонами // Биохимия. 1988. 53. (4). 598-603.
Lebedev A.V., Boguslavskaya L.V., Levitsky D-О., Maksimov О.B. Mechanisms of inhibition of phosphatidycholines Fe2+-induced oxidation by polyhydroxynaphthaquinones // Biokhimiya. 1988. 53. (4). 598-603.
15. Энтеросорбция / Под ред. H.A. Белякова. Л., 1991. 336 с.
Enterosorption / Ed. N.A. Belyakov. L., 1991.
336 p.
OXIDATIVE STRESS CONTROL IN CASES OF ALIMENTARY DYSLIPIDEMIA BY ANTIOXIDANTS PRODUCED FROM MARINE HYDROBIONTS
Vera Innokent’yevna YAN’KOVA1, Vera Vasilyevna KNYSHOVA1, Vadim Zinovyevich LANKIN2
1The Vladivostok department of the Far Eastern research center for physiology and respiratory pathology of SB RAMS ■ Institute of Medical Climatology and Rehabilitation Treatment 690105, Vladivostok, Russkaya st., 73g
2Research Institute of Clinical cardiology n.a. A.L. Myasnikov, Federal State Institution Russian Cardiological Research and Production complex of Roszdrav 121552, Moscow, 3-ya Cherepkovskaya st., 15a
The results were presented to evidence the effectiveness of administration of complexes contain biologically active essence produced from marine hydrobionts for pro-oxidant and anti-oxidant processes imbalance correction in case of alimentary dyslipidemias. The possible mechanisms of oxidative stress control by antioxidants produced from marine hydrobionts are also were discussed in the work.
Key words: oxidative stress, dyslipidemia, antioxidants.
Yan’kova V.I. — candidate of biology sciences, assistant professor, academic secretary, e-mail: [email protected]
Knyshova V.V. — candidate of medical sciences, senior researcher of rehabilitation treatment laboratory Lankin V.Z. — doctor of biology sciences, professor, the Head of Laboratory of free radical processes
