Механизмы изменений систем клеточного обновления при экспериментальном сахарном диабете Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616.4

Н. Н. Ермакова, А. М. Дыгай, В. В. Жданов, Г. Н. Зюзьков,

Т. И. Фомина, Л. А. Ермолаева, Л. А. Гурьянцева, Т. Ю. Хричкова, Т. В. Ветошкина, Л. А. Ставрова, Е. В. Удут, Е. В. Симанина

МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЕНИЙ

СИСТЕМ КЛЕТОЧНОГО ОБНОВЛЕНИЯ

ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ САХАРНОМ ДИАБЕТЕ

ГУ НИИ фармакологии Томского научного центра СО РАМН

На модели экспериментального сахарного диабета изучалось состояние системы крови и универсальных систем, ответственных за клеточное обновление. Выявлены изменения картины периферической крови, отражающие состояние костномозгового гемопоэза, снижение количества органоспецифичных стволовых клеток в поджелудочной железе, повышение содержания в органе клеток-предшественников стромы на фоне отсутствия целенаправленной компенсаторной реакции со стороны глубокого резерва адаптации - мезенхимальных стволовых клеток костного мозга.

Ключевые слова: сахарный диабет, аллоксан, стволовые клетки.

Введение

Заболевания поджелудочной железы являются весьма распространенными и занимают значительное место в структуре смертности и инвалидизации населения. При этом особую опасность для здоровья и социальную значимость представляет сахарный диабет, радикальных способов лечения которого на сегодняшний день не существует [1]. Указанное обстоятельство свидетельствует о необходимости более глубокого изучения механизмов формирования данного заболевания и участия различных приспособительных реакций организма в компенсации нарушений функционирования эндокринного аппарата поджелудочной железы. Согласно современным представлениям в тканях взрослого организма существуют стволовые клетки (СК), обладающие высоким пролиферативным и дифференцировочным потенциалом, способным обеспечивать процессы как физиологической, так и репаративной регенерации [2, 3]. Причем восстановление морфофункционального состояния различных органов при их альтерации оказывается возможным за счет не только стимуляции регионарных СК, но и миграции в зону повреждения высокопластичных клеточных элементов (мезенхимальных СК) из других тканей, в первую очередь из костного мозга [2].

Целью настоящего исследования является изучение морфологических изменений подже-

лудочной железы, показателей периферической крови и костномозгового кроветворения, состояния костномозгового и циркулирующего пулов мезенхимальных клеток-предшественников различной степени зрелости, а также регионарных стволовых клеток поджелудочной железы при экспериментальном сахарном диабете.

Методика исследования

Исследования проводились на 2-месячных мышах линии СВА/ CaLac обоих полов (п=215) в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N° 755). Конвенциональные линейные мыши 1-й категории получены из питомника ГУ НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН (сертификат имеется). Экспериментальной моделью служил сахарный диабет, воспроизводимый путем подкожного введения одноводного аллоксана по следующей схеме: в течение 4 дней ежедневно по 300 мг/кг, затем еще раз в той же дозе на 7-й день и после последнего введения.

Животных умерщвляли методом краниоцер-викальной дислокации под эфирным наркозом. На 8, 11, 15, 21 и 28-е сутки с начала эксперимента проводили морфологическое исследование поджелудочной железы, определяли показатели периферической крови и костномозгового кроветворения стандартными гематологическими

методами, а также структурно-функциональную организацию костного мозга [4]. Кроме того, изучали содержание фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф) в костном мозге и периферической крови [4, 5], количество КОЕ-Ф и регионарных паренхиматозных стволовых клеток в поджелудочной железе (КОЕп.ж.), а также на 8-е сутки количество мезенхимальных стволовых клеток (МСК) в костном мозге и периферической крови [5-7].

Содержание глюкозы в крови определяли утром натощак с помощью глюкометра «ОрШ^е» (Венгрия).

Для морфологического исследования часть поджелудочной железы, прилежащую к селезенке, фиксировали в 10 %-м растворе формалина и заливали в парафин по стандартной методике. Депарафинизированные срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. На срезах определяли площадь 10 последовательных островков Лангерганса методом графического компьютерного анализа, подсчитывали в них общее количество клеток, число пикноти-зированных клеточных элементов и вычисляли количество клеток на единицу площади островка и процент пикнотизированных элементов.

Обработку результатов проводили методом вариационной статистики с использованием ^критерия Стьюдента и непараметрического и-критерия Вилкоксона - Манна - Уитни. Частоту встречаемости МСК в костном мозге и периферической крови определяли с помощью обобщенной линейной модели для распределения Пуассона. Соответствие данных, полученных методом лимитирующих разведений, одномерной модели Пуассона, оценивалось посредством линейной log-log регрессии. При этом теоретическая фракция отрицательных лунок щ распределялась как щ = exp(-fxj), где f — частота встречаемости МСК; х[ — количество клеток, высаженных в лунку [6, 7]. Использовалась программа «Statistica 6.0».

Полученные результаты

Введение аллоксана мышам CBA/CaLac приводило к пикнозу значительной части клеток островков Лангерганса, наблюдаемому во все сроки исследования. Максимальное значение этого показателя (до 417,0 % от фона) регистрировалось на 8-е сутки опыта. Кроме того, на протяжении всего эксперимента были отмечены выраженные явления отека и гиперемии

эндокринного аппарата поджелудочной железы. Изменения количества клеток на единицу площади островка, несмотря на повреждающее действие токсического агента на р-клетки [8, 9], не регистрировалось в течение 21 сут наблюдения. Вероятно, это связано с развитием умеренной лимфоидно-макрофагальной инфильтрации ткани в ответ на повреждение. На 28-е сутки эксперимента количество клеток в островках достоверно снижалось по сравнению с исходным уровнем. В островках отмечалось также появление фибробластов, что свидетельствует о развитии склероза. Закономерным отражением патоморфологических изменений со стороны поджелудочной железы явилось развитие стойкой гипергликемии. Отмечалось значительное возрастание содержания глюкозы в периферической крови на протяжении всего периода наблюдения, с максимумом до 225,9 % исходных значений на 21-е сутки исследования (рис. 1).

Изучение показателей белой крови после введения аллоксана позволило установить достоверное снижение общего количества лейкоцитов (ОКЛ) на всем протяжении опыта по сравнению с контролем. Наиболее выраженное падение числа клеток белой крови отмечено на 21-е сутки эксперимента. Аналогичной была и динамика содержания отдельных форм лейкоцитов. Так, на 15-21-е сутки исследования наблюдалось резкое снижение числа сегментоядерных лейкоцитов и лимфоцитов в крови животных. Введение аллоксана вызывало существенное уменьшение содержания циркулирующих палочкоядерных нейтрофилов у мышей опытной группы на 8-е сутки наблюдения. Динамика показателей костномозгового кроветворения также изменялась во время эксперимента: общее количество миелокариоцитов достоверно возрастало с 11-х по 21-е сутки. При анализе миелограмм зарегистрировано выраженное увеличение числа эритроидных клеток на протяжении всего опыта с максимумом до 315 % исходных значений на 15-е сутки исследования (рис. 2). При этом содержание незрелых форм нейтрофильных лейкоцитов и лимфоцитов статистически значимо не изменялось, а количество зрелых ней-трофилов достоверно снижалось на 8-е сутки эксперимента. Сравнительное изучение картины периферической крови и костного мозга позволило сделать предположение о том, что резкое уменьшение содержания циркулирующих ней-

трофилов на фоне развития сахарного диабета обусловлено преимущественно токсическим воздействием аллоксана.

Изучение структурно-функциональной организации костного мозга показало увеличение выхода клеточных комплексов, ассоциированных как с фибробластами (на 11-е сутки), так и с макрофагами (на 8-е, 11-е сутки) у животных в условиях сахарного диабета. Анализ их качественного состава позволил выявить повышение числа гранулоцитарных (на 11-е сутки) и смешанных (на 8-е, 11-е сутки) гемо-поэтических островков, а также снижение

Рис. 1. Динамика содержания глюкозы в крови (а), клеток на площадь островка (б) и пикнотизированных клеток в островке Лангерганса (в) у мышей CBA/CaLac при экспериментальном сахарном диабете:

По оси абсцисс - сроки исследования (сутки); по оси ординат - значения показателя: а - ммоль/л; б - пиксель х 103; в - %.

Доверительные интервалы при р<0,05

числа эритроидных островков (на 21-е сутки) (рис. 3). Активация формирования гемопоэ-тических островков, обусловливает ускорение созревания клеток-предшественников в морфологически идентифицируемые костномозговые элементы. Указанные обстоятельства во многом объясняются установленным в настоящей работе фактом повышения продукции фибробластов при экспериментальном сахарном диабете. Так, при культуральных исследованиях на 11-е, 15-е сутки эксперимента обнаружено увеличение количества КОЕ-Ф в кроветворной ткани. В то же время достоверного повышения числа родоначальных мезенхимальных клеток в костном мозге не регистрировалось (выявленные изменения состояния пула КОЕ-Ф, очевидно, являлись неспецифическими и были связаны с активацией стрессреализующих систем организма при формировании патологии поджелудочной железы с помощью аллоксана).

Изучение динамики содержания различных СК в периферической крови на фоне моделирования сахарного диабета не выявило признаков мобилизации в кровь ни коммитированных, ни примитивных стромальных клеток-предшествен-ников. Напротив, на 21-е сутки опыта отмечалось статистически значимое падение содержания колониеобразующих единиц фибробластов относительно фоновых значений, по-видимому, связанное с «оседанием» стволовых клеток различной степени зрелости при данном виде воздействия на пораженный орган. Тем не менее даже наличие хоминга данных клеточных элементов на фоне отсутствия мобилизации как КОЕ-Ф, так и МСК из костного мозга оказывалось недостаточным для восполнения содержания регионарных клеток-предшественников в поджелудочной железе. Так, на протяжении всего эксперимента отмечалось падение количества КОЕп.ж. в ее ткани (до 40,7 % исходного уровня на 11-е сутки опыта), вероятно, вызванное токсическим действием агента на указанные элементы, обладающие высоким пролиферативным потенциалом (см. таблицу 1) [3, 5]. В то же время в поздние сроки эксперимента (15-е, 21-е сутки) в поджелудочной железе наблюдалось появление большого количества коммитирован-ных мезенхимальных клеток-предшественников (КОЕ-Ф), биологическую роль которых исходя из полученных результатов точно определить не представляется возможным. Развитие выявлен-

Динамика величин различных пулов КОЕ-Ф и содержания паренхиматозных клеток-предшественников в поджелудочной железе (на 105 нуклеаров) у мышей линии CBA/CaLac при экспериментальном сахарном диабете (Х±m)

Сроки исследования, сутки КОЕ-Ф Содержание КОЕп.ж в поджелудочной железе

Костный мозг Периферическая кровь Поджелудочная железа

Интактный контроль 2,00±0,37 14,33±1,98 0±0 15,17±1,30

8-е 7,67±0,76* 17,17±0,79 0±0 8,83±0,54*

11-е 5,67±1,05* 16,83±0,65 0±0 6,17±0,87*

15-е 5,50±0,67* 11,50±0,85 5,33±0,42* 8,17±1,25*

21-е 3,50±0,67 6,83±1,40* 1,50±0,34* 6,50±0,76*

Примечание. * - достоверность отличия показателя от контрольных значений при р<0,05.

6 1

4 -

2

6 -

2

Фон

Фон

11

11

15

15

21

21

1,2 и 0,9 . 0,6 . 0,3 .

20 18 -16 -14 -12 -10 -8 -

Фон

Фон

11

11

15

15

21

21

Рис. 2. Динамика общего количества лейкоцитов (а), содержания палочкоядерных (б) и сегментоядерных (в) нейтрофильных лейкоцитов в периферической крови, а также динамика общего количества миелокариоцитов (г), содержания зрелых нейтрофильных гранулоцитов (д) и эритроидных клеток (е) в костном мозге мышей CBA/CaLac при экспериментальном сахарном диабете:

По оси абсцисс - сроки исследования (сутки); по оси ординат: а-в - содержание клеток в периферической крови (х 109/л), г-е - содержание клеток в костном мозге (на бедро).

Доверительные интервалы при р<0,05

24 1 21 -

18 -

15 -12 -9 -6 -3 -О -

М

Фон

11 15 21

Фон 8 11 15 21

18 1 15 -

12 -

9 -

6 -

3 -

О -

Фон

11

15

21

Рис. 3. Динамика общего количества гемопоэтических островков (а), содержания их макрофагпозитивных (б), макрофагнегативных (в), эритроидных (г), гранулоцитарных (д) и смешанных (е) форм в костном мозге мышей линии CBA/CaLac при экспериментальном сахарном диабете:

По оси абсцисс - сроки исследования (сутки); по оси ординат - содержание ГО в костном мозге (х103 на бедро).

Доверительные интервалы при р<0,05

ного феномена, очевидно, может быть обусловлено как активацией склеротических процессов, так и, напротив, возрастанием интенсивности процессов реституции. Возможно, имела место регенерация тканевого микроокружения, также, вероятно, оказавшегося поврежденным в результате воздействия аллоксана. При этом известно, что микроокружение, в свою очередь, способно оказывать значительное влияние на функциональную активность органоспецифичных клеток in situ [2].

Таким образом, развитие экспериментального сахарного диабета сопровождалось патомор-

фологическими изменениями поджелудочной железы с развитием стойкой гипергликемии, изменением картины периферической крови и костного мозга, истощением пула паренхиматозных стволовых клеток поджелудочной железы, повышением содержания в органе стромальных клеток-предшественников на фоне отсутствия целенаправленной компенсаторной реакции со стороны мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, что указывает на общее токсическое воздействие аллоксана на стволовые клетки различных классов.

MECHANISMS OF THE CHANGE THE SYSTEMS CELLUAR RENOVATION UNDER EXPERIMENTAL SUGAR DIABETES

N. N. Ermakova, A. M. Dygai, V. V. Zhdanov, G. N. Zyuz'kov, T. I. Fomina, L. A. Ermolaeva, L. A. Gur'yanceva, T. Y. Hrichkova,

T. V. Vetoshkina, L. A. Stavrova, E. V. Udut, E. V. Simanina

On models of the experimental sugar diabetes studied the condition of the blood system and universal system responsible for cellular renovation. Revealed change the picture peripheral blood, reduction amount organ specificity stem cells in pancreas, increasing of the contents in organ of the progenitor cells stroma on background of the absence goal-directed compensation reactions on the part of deep reserve of the adaptation — mesenchymal stem cells of the bone marrow.

Литература

1. Дедов И. И. Федеральная целевая программа «Сахарный диабет»: Метод. рекомендации / И. И. Дедов, М. В. Шестакова, М. А. Максимова. - М., 2002. -96 с.

2. Гольдберг Е. Д. Гипоксия и система крови / Е. Д. Гольдберг, А. М. Дыгай, Г. Н. Зюзьков. - Томск, 2006. - 142 с.

3. Гольдберг Е. Д., Дыгай А. М., Жданов В. В. Современные взгляды на проблему стволовых клеток и возможности их использования в медицине // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - № 4. - С. 184-199.

4. Гольдберг Е. Д. Методы культуры ткани в гематологии / Е. Д. Гольдберг, А. М. Дыгай, В. П. Шахов. -Томск, 1992. - 264 с.

5. Гольдберг Е. Д., Дыгай А. М., Жданов В. В. и др. Состояние пулов стволовых клеток при экспериментальном сахарном диабете // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2006. - № 3. - С. 123-127.

6. Bonnefoix T., Bonnefoix P., Callanan M., et al. Graphical representation of a generalized linear model-based statistical test estimating the fit of the single-hit poisson model to limiting dilution assays // J. Immunol. - 2001. -Vol. 167. - P. 5725-5730.

7. Int Anker P. S., Noort W. A., Scherjon S. A., et al. Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophe-notype but a heterogenous multilineage differentiation potential // Haematologica. - 2003. - Vol. 88. - P. 845-852.

8. Алеева Г. Н., Киясов А. П., Миннебаев М. М. и др. Динамика b- и a-клеточных популяций поджелудочной железы и содержания глюкозы в крови крыс при аллоксановом диабете // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2002. - № 2. - С. 151-153.

9. Ferner R. E. Drug-induced diabetes // Bailliers Clin. Endocrinol. Metab. - 1992. - № 6. - Р. 849.