CC BY
141
Механизмы формирования антибиотикорезистентности бактерий рода Campylobacter
В. В. СТЕЦЕНКО, *Н. Р. ЕФИМОЧКИНА
Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, Москва
The Mechanisms of Antibiotic Resistance in Bacteria of The Genus Campylobacter
V. V. STETSENKO, N. R. EFIMOCHKINA
Federal Research Center of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Moscow
Антибиотикорезистентность бактерий, контаминирующих пищевые продукты, является в настоящее время одной из наиболее острый проблем здравоохранения. Широкое использование антибиотиков в ветеринарии с лечебной целью, а также в качестве профилактических средств или стимуляторов роста сельскохозяйственный живот ных и птицы, создаёт условия для селективного давления на бактериальные популяции, приводит к их адаптации и распространению антибиотикорези-стентнык штаммов эмерджентных пищевых патогенов, к числу которых относятся бактерии рода Campylobacter. По данным ВОЗ, кампилобактериозные гастроэнтероколиты сохраняют лидирующие позиции среди острый кишечных инфекций с пищевым путём передачи. Проведён анализ особенностей генетической трансформации и формирования резистентности возбудителей кампилобактериоза к нескольким классам антимикробных препаратов, наиболее часто применяемым в медицине и ветеринарии. Показано, что бактерии рода Campylobacter обладают множественными способами усиления устойчивости, которые включают горизонтальную передачу ДНК (через механизм природной трансформации), плазмидный трансфер генов резистентности и хромосомные мутации. Приведены данные о специфических механизмах антибиотико-резистентности Campylobacter jejuni к фторхинолонам, тетрациклинам, аминогликозидам, макролидам. Показано, что экспрессия резистентности у Campylobacter spp. наиболее выражена в отношении тетрациклинов, что в последние годы привело к быстрому нарастанию до 61—87% доли тетрациклиноустойчивык штаммов среди популяций кампилобактеров, контаминирующих пищевые продукты. Проведён анализ данных, подтверждающих трансфер генов резистентности и тотальную устойчивость C.jejuni к фторхинолонам, которая сформировалась в результате длительного воздействия сублетальных доз этих препаратов. Тенденция к формированию устойчивости C.jejuni к макролидам, в первую очередь к эритромицину, обусловленная не только хромосомными мутациями, но и наличием трансмиссивной плазмидной резистентности, в настоящее время рассматривается как серьёзная угроза здоровью населения.Поиск новых информативных маркеров антибиотикорезистентности Campylobacter spp. позволит делать прогнозные оценки риска формирования устойчивости возбудителей кампилобактериоза к наиболее часто используемым антимикробным препаратам.
Ключевые слова: кампилобактериоз, антибиотикорезистентность, Campylobacter jejuni, антимикробные препараты, генетические детерминанты.
Antibiotic resistance ofbacteria that contaminate raw food products is currently one of the most acute public health problems. The widespread use of antibiotics for therapeutic or prophylactic purposes in veterinary medicine and as growth promoters for farm animals and poultry creates the conditions for selective pressure on bacterial populations, leading to their adaptation and dissemination of antibiotic-resistant strains of emergent foodborne pathogens, including bacteria of the genus Campylobacter. According to the WHO, campy-lobacteriosis gastroenteritis retains its leading position among the acute foodborne infections. The article analyzes the features of genetic transformation and formation of resistance of Campylobacter bacteria to several classes of antimicrobial drugs, most commonly used in medicine and veterinary. It is shown that Campylobacter spp. have multiple ways to enhance resistance, which include horizontal DNA transfer (through the mechanism ofnatural transformation), plasmid transfer ofresistance genes and chromosomal mutations. The article presents the data on specific mechanisms of Campylobacter jejuni antibiotic resistance to fluoroquinolones, tetracyclines, aminoglycosides, and macrolides. It is shown that the expression of resistance in Campylobacter spp. is the most pronounced in relation to tetracyclines, which in recent years has led to a rapid increase to 61—87% of the proportion of tetracycline-resistant strains among the populations of campylobacters, contaminating food products. The analysis of data confirming the transfer of resistance genes and total resistance of C.jejuni to fluoroquinolones, which was formed as a result ofprolonged exposure to sublethal doses of these drugs, was carried out. The tendency of C.jejuni to form resistance to macrolides, primarily to erythromycin, caused not only by chromosomal mutations, but also by the presence of transmissive plasmid resistance, is now considered as a serious threat to public health. The search for new informative antibiotic resistance markers of Campylobacter spp. will allow making prognostic assessment of the risk of formation of resistance of campylobacteriosis pathogens to the most frequently used antimicrobial agents.
Keywords: campylobacteriosis, antibiotic resistance, Campylobacter jejuni, antimicrobial agents, genetic determinants.
© В. В. Стеценко, H. P. Ефимочкина
Адрес для корреспонденции: 109240, г. Москва, Устьинский проезд, д.2/14.
В течение двух последних десятилетий в развитых странах отмечается резкий рост заболеваемости кампилобактериозом, число случаев которого стало превалировать над другими распространёнными диарейными инфекциями бактериальной природы — сальмонеллёзом и шигеллё-зом. Широкое распространение кампилобакте-риоза в различных странах мира и большой социально-экономический ущерб от этого заболевания объясняют его включение Всемирной Организацией здравоохранения в список эмерджент-ных пищевых инфекций [1, 2].
Бактерии рода Campylobacter распространены повсеместно в природе, они присутствуют в организме домашней птицы или теплокровных животных и могут персистировать длительное время в окружающей среде при неблагоприятных условиях. Шесть таксонов рода Campylobacter. C.jejuni ssp. jejuni, C.jejuni ssp. doylei, C.coli, C.lari, C.upsaliensis и C.helveticus образуют генетически родственную группу термофильных кампилобак-теров с оптимальной температурой роста +42°С, обладающих способностью инфицировать человека и теплокровных животных [2, 3].
Наибольшую эпидемиологическую значимость представляют Campylobacter jejuni, которые обусловливают до 90% подтверждённых случаев кампилобактериоза. Причины подъёма заболеваемости кампилобактериозом остаются неизвестными. Имеются предположения о его взаимосвязи с повышением доли в питании населения продуктов из птицы, обычным обитателем кишечника которой являются бактерии рода Campylobacter, и распространением новых технологий упаковки пищевых продуктов в пленки и модифицированную газовую атмосферу, способствующих сохранности и проявлению биологических свойств возбудителя. Изучение ответов на стрессовые воздействия у бактерий рода Campylobacter имеет важное значение для выяснения механизмов приобретения продуктами, загрязнёнными этими микроорганизмами, опасных свойств. Изменения метаболических профилей C.jejuni в результате экспрессии генов патогенности рассматриваются как адаптивные процессы, которые во многом зависят от технологических режимов обработки сырья в процессе производства пищевых продуктов и способствуют селекции новых устойчивых штаммов возбудителей.
Общие механизмы защитных свойств Campylobacter spp. могут реализоваться в различных вариантах взаимодействия бактерий с окружающей средой, способствуя формированию устойчивых вариантов микроорганизмов как in vitro, так и в производственных условиях под влиянием стрессовых техногенных или биологических факторов. Наиболее выраженной тенденцией в изменении свойств C.jejuni является повышение
их резистентности к бактерицидным воздействиям, которые обусловлены повсеместным применением антимикробных препаратов (АМП), в том числе антибиотиков и биоцидов.
Антибиотикорезистентность бактерий, кон-таминирующих пищевые продукты животного происхождения, стала в последние годы проблемой общественного здравоохранения в большинстве стран мира [4—6]. Широкое использование антибиотиков с лечебной целью в медицине и ветеринарии, сопровождающееся формированием резистентных штаммов, приводит к снижению эффективности применения лекарственных средств и создаёт серьёзные проблемы в терапии инфекционных заболеваний. Острое беспокойство вызывают ситуации, когда противомикробные препараты используются в качестве профилактических средств или стимуляторов роста, поскольку воздействие малых доз антибиотиков, применяемых в течение длительного времени, создаёт условия для селективного давления на популяции бактериальных патогенов, приводит к их адаптации и распространению высоко- и мультирезис-тентных штаммов [7].
В последние годы получены многочисленные сведения о том, что появление антибиотикоус-тойчивых штаммов возможно не только в клинических условиях, но и в процессе персистенции патогенных бактерий в окружающей среде. Это привело к появлению термина «глобальная рези-стома», подразумевающего совокупность всех генов резистентности к антибиотикам в геномах патогенных, условно патогенных и сапрофитных микроорганизмов, живущих в природных условиях различных экосистем [8]. Для изучения этого феномена используются достижения метаге-номного анализа, позволяющего определять совокупность всех генов устойчивости к определённому антибиотику в конкретном микробном сообществе, где могут присутствовать и некульти-вируемые формы микроорганизмов [9, 10].
Возникновение и распространение генов устойчивости, мобильных генетических элементов, и, как следствие, мозаичная структура геномов, играют ведущую роль в эволюции свойств анти-биотикорезистентных микроорганизмов.
На современном этапе рассматриваются следующие основные процессы формирования резистентности бактерий рода Campylobacter к антимикробным препаратам.
♦ плазмидный или транспозонный варианты передачи резистентности;
♦ хромосомный тип передачи резистентности;
♦ природная (естественная) трансформация генома бактерий Campylobacter.
Наибольшее внимание уделяется возможности передачи чужеродной хромосомной ДНК, несу-
Механизмы антибиотикорезистентности Campylobacter
Группы антибиотиков Механизмы Гены резистентности Локализация
Фторхинолоны (ципрофлоксацин, Мутации субъединицы А GyrA Хромосомная
налидиксовая кислота) ДНК гиразы
Тетрациклины (тетрациклин, доксициклин) Энзиматическая инактивация, трансмембранная помпа (effluxpump), изменения структуры рибосом Ш^) На плазмцдах (67—70% штаммов) или в хромосоме (33%), а также на других мобильных элементах
Макролиды (эритромицин) Модификация мишени, Метилирование или мута- Хромосомная и плазмидная
efflux pump ции участков 238 рибосо-мальной РНК, ген ДНК-метилазы em (B) локализация
Аминогликозиды (канамицин, гентамицин) Продукция аминогликозид фосфотрансфераз AphA Плазмидная локализация
ß-лактамы (пенициллины) Продукция ß-лактамаз — Плазмидная локализация
щей гены резистентности, в микробную клетку реципиента при обычных ростовых условиях (интергеномная рекомбинация). Этот механизм природной трансформации генома бактерий достаточно часто реализуется у отдельных видов кишечных патогенов, включая Campylobacter spp. [11, 12]. Наиболее перспективным в этом плане является изучение феномена природной трансформации C.jejuni под влиянием стрессовых воздействий, обусловленного формированием биоплёнок как специфического резервуара для генного обмена и контакта с чужеродной ДНК, способствующего появлению мутаций и новых антибиотикорезис-тентных популяций. Образующиеся в биоплёнках микросистемы обладают оптимальными условиями для выхода из клеток донорской интактной ДНК и включения её в геном реципиента, который приобретает таким образом новые свойства, включая резистентность к антибиотикам [13].
Устойчивость к антибиотикам у бактерий рода Campylobacter реализуется в основном за счёт механизма «efflux pump» (трансмембранной помпы), синтеза белков, защищающих рибосомы, и хромосомных мутаций. Детерминанты резистентности обычно локализованы на плазмидах, что обеспечивает их быстрое внутри- и межвидовое распространение. Бактерии рода Campylobacter имеют труднопреодолимую систему рестрикции — модификации, которая в большинстве случаев уменьшает поглощение чужеродного генетического материала и естественным образом трансформируется.
Приобретение отдельными штаммами Campylobacter новых детерминант патогенности и факторов, обеспечивающих им селективные преимущества в какой-либо экологической нише, приводит к быстрой экспансии вновь сформировавшегося клона. В процессе эволюции подобные события, вероятно, могут происходить неоднократно, вызывая появление новых патогенов, адаптированных к существованию в различных условиях, в частности формирование антибиотико-резистентных бактерий. Известные в настоящее время специфические механизмы появления и
экспрессии антибиотикорезистентности бактерий рода Campylobacter [3, 13, 14] приведены в таблице.
Закономерности формирования и проявления признаков резистентности Campylobacter могут быть рассмотрены по отношению к отдельным наиболее значимым группам антибактериальных веществ.
Фторхинолоны
Первые сообщения об устойчивости кампи-лобактерий к фторхинолонам появились в конце 1980 — начале 1990 годов [4, 15, 16]. С тех пор резистентность к данной группе противомикроб-ных препаратов постоянно растёт. Сочетание неадекватного использования фторхинолонов у людей и интенсивного применения данной группы антибиотиков в животноводстве и птицеводстве способствовало распространению резистентных штаммов Campylobacter [6, 17, 18].
Нарастание антибиотикорезистентности в популяциях Campylobacter spp.
Интенсивное использование фторхинолонов в птицеводческих хозяйствах сопровождалось появлением и распространением резистентных штаммов C.jejuni, при этом большинство из них за
| | Устойчивость к ципрофлоксацину | | Устойчивость к тетрациклинам
96
87 -
70 54
14
2
2001-2007 гг. 2011-2014 гг. 2016-2017 гг.
Нарастание антибиотикорезистентности в популяциях Campylobacter spp.
короткий промежуток времени превращались из абсолютно чувствительных в антибиотикоустой-чивые [19, 20]. По данным Национальной системы мониторинга антимикробной резистентности возбудителей кишечных инфекций в США, при кампилобактериозах, связанных с употреблением мяса кур, в 14% случаев выделяли резистентные к фторхинолонам штаммы Campylobacter (рисунок). В отчете Европейского Агентства по безопасности пищи приводятся результаты исследований, проведённых 28 странами Евросоюза по оценке антибиотикорезистентности штаммов нескольких групп возбудителей пищевых зоонозов, включая Campylobacter jejuni и C.coli [6]. Показано, что штаммы, выделенные от больных людей, а также обнаруженные в мясе птицы (кур-бройлеров, индеек), обладали высокой резистентностью к ципрофлоксацину (в среднем 70%) и налидик-совой кислоте (65%).
Ограничение или прямое запрещение использования фторхинолонов для ветеринарных целей во многих странах, включая Соединенные Штаты, Данию, Австралию и Финляндию [13, 21] способствовало значительному улучшению ситуации и сопровождалось резким снижением уровня фторхинолоновой резистентности. Так, в Австралии при исследовании 150 штаммов Campylobacter, выделенных из мяса бройлеров, число устойчивых к фторхинолонам составило не более 2,4%, что коррелировало с низкой частотой резистентности (2%) у клинических изолятов кампилобактеров [21]. В Финляндии ограничение использования фторхинолонов в ветеринарии также привело к низкому уровню устойчивости к этим антибиотикам, что выявлялось при тестировании местных штаммов Campylobacter. По данным Датской комплексной программы мониторинга устойчивости к противомикробным препаратам (DANMAP), в 2011 г. резистентными были 11% штаммов Cjejuni, выделенных из мяса домашних бройлеров и 57% штаммов, выделенных от импортируемых бройлеров [21]. В США с 2004 г. запрещено применение в ветеринарии в терапевтических целях энрофлоксацина — антибиотика из группы фторхинолонов, из-за опасения, что увеличивающийся уровень резистентности Campylobacter к фторхинолонам отразится на повышении устойчивости к данным антибиотикам у штаммов, выделенных от человека [15].
Хинолоны ингибируют синтез бактериальной ДНК, вызывая гибель клеток. Мишенью хиноло-нов являются два фермента: ДНК-гираза (топо-изомераза II) и топоизомераза IV. Эти ферменты совместно участвуют в репликации, транскрипции, рекомбинации и репарации бактериальной ДНК. ДНК-гираза и топоизомераза IV являются гетеротетрамерными белками, состоящими из двух субьединиц А и В. Гены, кодирующие субье-
диницы А и В, называются gyrA и gyrB (ДНК-ги-раза) или parC и parE (ДНК-топоизомераза IV). Устойчивость к этому классу противомикробных препаратов возникает вследствие замещения аминокислот в целевой области соответствующей топоизомеразы, называемой «участок определения резистентности к хинолону» (QRDR), который расположен на внутренней части ДНК-свя-зывающего домена на поверхности этих ферментов [4, 22]. Устойчивость к фторхинолонам обусловлена, главным образом, хромосомными мутациями в QRDR гена gyrA. Мутации в субъединице GyrB у Campylobacter не описаны.
Система «еГйих pump» (CmeABC), снижающая внутриклеточную концентрацию антибиотиков, является главным механизмом обеспечения антибиотикорезистентности бактерий рода Campylobacter к нескольким противомикробным препаратам, включая фторхинолоны и макролиды [4, 7, 23]. CmeABC кодируется опероном, состоящим из трёх генов cmeA, cmeB и cmeC, ответственных за синтез периплазматического белка, транспортера лекарственного средства внутренней мембраны и белка наружной мембраны, соответственно. Это наиболее распространённая система у Campylobacter, которая функционирует в синергизме с мутацией гена GyrA, и вызывает устойчивость к фторхинолонам. Инактивация CmeABC подавлением гена cmeB или ингибиторами эффлюкс насоса сопровождается повышением чувствительности к различным антибиотикам у штаммов Campylobacter (в том числе обладающих врождённой резистентностью). Это свидетельствует о том, что система CmeABC играет ключевую роль в обеспечении как природной, так и приобретённой антибиотикоустойчи-вости кампилобактерий. Кроме того, при блокировке эффлюкс насоса значения минимальной ингибирующей концентрации (MIC) для ципро-флоксацина снижаются до уровня чувствительных штаммов, у которых обнаружены мутации в гене GyrA [4].
Макролиды
Макролидные антибиотики представляют собой большие молекулы (MW>700), они продуцируются преимущественно микроорганизмами рода Streptomyces и родственными таксонами [15]. Наиболее распространённым антибиотиком из группы макролидов является эритромицин, синтезируемый Saccharopolyspora erythraea [24]. В настоящее время этот антибиотик считается препаратом выбора при лечении инфекций, вызванных Campylobacter spp., обладая высокой надёжностью и эффективностью в отношении данного возбудителя. До недавнего времени считалось, что кампи-лобактеры не обладают генетически закреплённой устойчивостью к эритромицину, поскольку
возникновение резистентности связывали только с возможными мутациями участков 23 S рибосо-мальной РНК (консервативный вертикальный способ передачи устойчивости). Трансмиссивная плазмидная резистентность к эритромицину была впервые описана лишь в 2014 г. при исследовании штаммов Campylobacter, выделенных в Китае от продуктивных животных и птиц, при этом уровень резистентности (МИК) достигал очень высоких значений — 512 мг/л [25, 26].
Тенденция к формированию у кампилобакте-рий устойчивости к макролидам во многих странах рассматривается как серьёзная угроза здоровью населения вследствие повсеместного распространения эмерджентных возбудителей пищевых инфекций. Частота появления резистентных к макролидам штаммов C.jejuni на Тайване и в Испании составляла, соответственно, 10 и 11%, тогда как в Болгарии, Сингапуре и Нигерии были зарегистрированы более высокие показатели — 31, 51 и 79%, соответственно [13]. В Европейском Союзе наиболее высокие уровни резистентности к макролидам у C.jejuni выявлены на Мальте (10%) и в Италии — 33% [15].
Резистентность к макролидным антибиотикам у Campylobacter связана либо с модификацией мишени антибиотика путём метилирования или мутации, либо с нарушением проницаемости клеточной стенки бактерии для этих антибиотиков и оттоком (эффлюксом) антибиотика из бактериальной клетки [15, 23]. Модификации мишени, вызывающие устойчивость к макролидам, могут быть обусловлены точечной мутацией в гене 23S рРНК и посттрансляционными изменениями рибосомных белков L4 и L22 [4, 13, 22—24].
Наиболее распространёнными мутациями, обеспечивающими устойчивость к эритромицину у C.jejuni и C.coli (МИК>128 мг/л), являются замены остатков аденина в положениях 2074 и 2075 оперона rrnB гена 23S рРНК. Поскольку эти виды кампилобактеров имеют три копии гена 23 S рРНК, у резистентных к эритромицину штаммов связанные с макролидами мутации, как правило, выявляют во всех трёх копиях. Штаммы, имеющие мутации в двух генах 23S рРНК, характеризуются более низкими уровнями МИК. Сведений о резистентных к макролидам штаммах Campylobacter, содержащих только одну мутированную копию гена 23S рРНК нет [27]. Устойчивость к эритромицину, как правило, соответствует перекрёстной резистентности к другим макролидам (например, азитромицину и кларитромицину), а также к родственным им препаратам группы линкозамидов (в частности, клиндамицину) и стрептограминовым группам [4].
Другим наиболее значимым механизмом, обуславливающим резистентность к макролидам у Campylobacter, является «еГйих pump», для
которого описано по меньшей мере восемь различных систем оттока. Одним из них является мультирезистентный насос CmeABC, который синергетически функционирует с мутациями 23S рРНК и обеспечивает высокоуровневую резистентность к макролидам. У резистентных к макролидам штаммов Campylobacter с мутациями в положениях A2074G или A2075G инактивация CmeABC приводит к заметному снижению уровня резистентности, что подтверждает синергетические взаимодействия эффлюксной системы с целевыми мутациями 23S рРНК [24]. Штаммы, обладающие низким уровнем резистентности к эритромицину (МИК 8—16 мг/л), у которых отсутствуют мутации в целевом гене, могут восстанавливать чувствительность к эритромицину после инактивации эффлюксного насоса CmeABC, обеспечивающего природную резистентность Campylobacter. Штаммы с высокой исходной резистентностью к эритромицину (МИК>128 мг/л) с мутацией в гене 23S рРНК проявляли уменьшение уровня резистентности к эритромицину в 2—4 раза после инактивации CmeABC, что подтверждает синергизм действия эффлюксного насоса и целевых мутаций рибосомных белков в обеспечении приобретённой устойчивости к макролидам у C.jejuni и C.coli [4, 24].
Третий механизм устойчивости к макролидам предполагает снижение проницаемости стенок бактерий для антибиотиков, за счёт экспрессии основного порина наружной мембраны. Порины представляют собой белки наружной мембраны, которые образуют трансмембранные поры, обеспечивая пассивную диффузию гидрофильных молекул. Свойства пор, включая размер и характеристики заряда, лежат в основе их селективности. Порины C.jejuni и C.coli могут формировать катион-селективные поры, размеры которых ограничивают транспорт антибиотиков с молекулярной массой более 360 MW, таких как макролиды (MW>700). Учитывая, что макролиды считаются эффективными препаратами при лечении кампилобактериоза, они должны обладать способностью проникать через наружную и цито-плазматическую (внутреннюю) мембраны. Поскольку порины обеспечивают водную среду для переноса гидрофильных молекул, считается, что относительно гидрофобные макролиды получают доступ к цитоплазме грамотрицательных бактерий через «гидрофобный путь». По-видимому, этот путь активируется штаммами, несущими мутации в генах синтеза липополисахаридов. Поэтому наружные мембраны этих мутантных штаммов более гидрофобны, чем у исходных штаммов, проявляя повышенную восприимчивость к гидрофобным антибиотикам, включая макролиды [15].
Тетрациклины
Контаминация продуктов бактериями рода Campylobacter, несущими детерминанты трансмиссивной тетрациклиновой резистентности, является одной из актуальный проблем безопасности пищи. Широкомасштабное применение антибиотиков тетрациклиновой группы в целях профилактики и лечения сельскохозяйственных животных повышает риск попадания остатков этих препаратов в пищевую продукцию. Данных о частоте обнаружения устойчивыгх к тетрациклинам C.jejuni и механизмах формирования антибиотикорезистентности недостаточно. В последние годы наблюдается нарастание числа тетрациклино-устойчивых кампилобактеров, при этом уровень резистентности в отдельных случаях достигает 61—87% с ингибиторными дозами свыше 64 мг/л [18, 28]. Выявлены значительные различия при сравнении свежевыщеленных культур с ранее полученными изолятами (2001—2007 гг.), что указывает на интенсивные процессы формирования тетрациклиновой резистентности в популяциях циркулирующих кампилобактеров (рисунок).
Тетрациклины, в основе антимикробного действия которыгх лежит подавление синтеза белков бактерий, являются специфическими ингибиторами связывания аминоацил-тРНК с A-уча-стком бактериальной 70S рибосомы. В настоящее время описано 47 генов tet, кодирующих различные механизмы резистентности к этим антибиотикам, включая выброс из клетки (эффлюкс), ри-босомальную защиту, а также прямую ферментативную деградацию тетрациклинов. Среди резистентных грамотрицательных бактерий наиболее распространён эффлюкс-механизм, среди грам-положительных микроорганизмов — механизмы рибосомальной защиты.
Детерминанты резистентности обычно локализованы на плазмидах, что обеспечивает их быстрое внутри- и межвидовое распространение. Гены, определяющие устойчивость к тетрациклину (tet) грамотрицательных бактерий, часто обнаруживаются в транспозоне Tn10, передаваемом между ними крупными коныюгативными плазмидами. Плазмидная резистентность к тетрациклину связана с уменьшением его аккумуляции клеткой, обратным транспортом (гены tetA-tetE, tetG и tetH), внутриклеточной инактивацией (tetX) и защитой рибосом-мишеней ^Мили tetQ) [13, 15, 24].
Поскольку тетрациклины представляют собой ингибиторы синтеза липофильного белка, которые используют систему «гидрофобного пути», описанного для макролидов, а также порины наружной мембраны для проникновения в бактериальную рибосому, в основе резистентности кам-пилобактерий к тетрациклинам лежит изменение рибосомной мишени тетрациклина и эффлюкс. Для прохождения через поры внешней мембраны
тетрациклин связышается с катионами Mg2+; проникнув через клеточную стенку в периплазмати-ческое пространство, тетрациклин отсоединяется от магния и пассивно перемещается в цитоплазму для связывания с рибосомальной 30S субыедини-цей, приводя к ингибированию синтеза белка [4].
Резистентность к тетрациклинам у Campylobacter обеспечивается геном tet(O), которыш присутствует у большинства возбудителей кампилобактериоза, включая C.jejuni и C.coli [4, 29], другие гены резистентности tet у кампилобактеров обнаружены не были. Ген tet(O), кодирующий рибосомальные белки защит (RPPs), расположен на собственной трансмиссивной плазмиде размером от 45 до 58 КБ и обеспечивает высокие уровни резистентности к тетра-циклинам (до 512 мг/л). Опубликованы данные о наличии на tet(O)-содержащих плазмидах перемещающегося встроенного элемента IS607, аналогичного обнаруженному на хромосоме Helicobacter pylori, поэтому не исключено, что другие мобильные генетические элементы, помимо трансмиссивных плазмид, имеют отношение к приобретению и распространению гена антибиотикорезистентности tet(O) [4].
Несмотря на то, что высокий уровень устойчивости к тетрациклинам обусловлен только геном tet(O), роль эффлюкса в отношении этих антибиотиков подтверждается увеличением МИК тетрациклина даже при генетической инактивации протонной помпы. Нарушение работы системы cmeG приводило к повышению (в 4 раза) восприимчивости мутантного штамма по сравнению со штаммом дикого типа. Кроме того, инактивация эффлюксного насоса CmeABC путём повреждения cmeB сопровождалась 8-кратным уменьшением МИК тетрациклина для штамма, у которого не был выявлен ген tet(O) [24].
Аминогликозиды и другие антимикробные препараты
Плазмидная резистентность к аминоглико-зидным антибиотикам (гентамицину, стрептомицину и др.) у кампилобактерий связана с их энзимной модификацией. У Campylobacter известно несколько модифицирующих аминогликозид-ферментов, в том числе аминогликозид фосфо-трансфераза I, III, IV и VII, аминогликозид аде-нилтрансфераза и 6-аминогликозид аденилтран-сфераза, каждый из которыгх имеет свои собственные характерные участки модификации и субстраты. Все три фермента действуют по аналогичному механизму: продуцирование 30-0-аминог-ликозид-фосфотрансферазы, кодируемой геном aphA-3. Ген aphA-3 является наиболее распространённым источником устойчивости к аминог-ликозидам у Campylobacter. Описаны и другие гены, в частности aphA-1 и aphA-7, обеспечивающие резистентность к канамицину [24, 30]. В отличие от aphA-3 и aphA-1, которые, как считается,
были получены путём горизонтального переноса, aphA-7 имеет сходный G-C состав с хромосомной ДНК C.jejuni, свидетельствуя о том, что aphA-7 свойственен кампилобактерам. Резистентность к канамицину часто опосредуется плазмидой, которая также кодирует устойчивость к тетрациклину и переносится путём конъюгации между штаммами Campylobacter [31].
Идентификация генетических детерминант C.jejuni позволила установить значительное разнообразие присутствующих маркеров резистентности и высокую степень соответствия феноти-пических и генетических профилей антибиоти-коустойчивости пищевых изолятов кампилобак-терий. У 85 % штаммов, фенотипически устойчивых к аминогликозидам, были выявлены один, два или более генов резистентности aphA. У большинства (64%) изученных тетрациклинорезис-тентных штаммов был обнаружен ген tetO [28].
Бета-лактамные антибиотики нарушают сшивание пептидогликанов при образовании клеточной стенки бактерий, что приводит к гибели клеток. Причиной резистентности кампилобактерий к пенициллинам и цефалоспоринам являются мутации в генах пенициллинсвязывающих белков. Они приводят к пониженной аффинности этих белков к бета-лактамным антибиотикам. Подавляющее большинство штаммов C.jejuni и C.coli способны продуцировать р-лактамазы, которые инактивируют молекулу бета-лактама путём гидролиза структурного лактамного кольца. Кроме того, устойчивость к этой противомикроб-ной группе может быть связана с изменениями в структуре мембраны или в поринах и системе эф-флюксных насосов [15, 32].
Хлорамфеникол ингибирует биосинтез бактериальных белков, предотвращая элонгацию пептидной цепи. Он обратимо связывается с центром пептидилтрансферазы в рибосомной субъединице 50S. Плазмидная резистентность к хлорамфени-колу ассоциируется с наличием у бактерий генов
ЛИТЕРАТУРА
1. World Health Organization. The global view of campylobacteriosis: report of an expert consultation, Utrecht, Netherlands, 9—11 July 2012.//ISBN 978 92 4 156460 1. www.who.int
2. Campylobacter Ecology and Evolution./ 2014, Caister Academic Press, Norfolk, UK, edited by S.K. Sheppard. 359, ISBN: 978-1-908230-2.
3. Nachamkin I., Guerry P. Campylobacter infections. Foodborne Pathogens: Microbiology and Molecular Biology. Wymondham, 2005; 285—293.
4. Wieczorek K, Osek J. Antimicrobial Resistance Mechanisms among Campylobacter. BioMed Research International 2013; 2013: 1—12.
5. John E, Moore N, Barton M.D. The epidemiology of antibiotic resistance in Campylobacter. Microb Infect 2006; 8: 1955—1966.
6. European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union summary report on antimicrobial resistance in zoonotic and indicator bacteria from humans, animals and food in 2014. EFSA J 2016; 14: 2: 4380. www.efsa.europa.eu/efsajournal.
7. Mavri A., Ribic U, Mozina S.S. The Biocide and Antibiotic Resistance in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli. Emerging and Traditional Technologies for Safe, Healthy and Quality Food 2015; 269—283.
хлорамфеникол ацетилтрансферазы (cat), которая модифицирует хлорамфеникол таким образом, что препятствует его связыванию с рибосомами. Несмотря на то, что резистентность к хлорамфе-николу у Campylobacter встречается редко, у C.coli был обнаружен ген резистентности к хлорамфе-николу, расположенный на плазмидах [4, 24].
Резистентность C.jejuni к сульфаниламидам (сульфонамидам) также хромосомно опосредована путём мутационного замещения четырёх аминокислотных остатков в дигидроптероатсинтета-зе (DHPS), что приводит к пониженной аффино-сти к этим препаратам [4].
Таким образом, данные о регуляторных системах антибиотикорезистентности и генетических детерминантах резистентных популяций кампилобактеров охватывают различные аспекты закономерностей проявления изменчивости микроорганизмов и роли условий внешней среды как эволюционных факторов, позволяющих возбудителям приобретать ранее малоизвестные селективные признаки патогенности.
Изучение механизмов формирования устойчивости C.jejuni к различным антимикробным препаратам позволяет осуществлять поиск новых информативных маркеров резистентности и толерантности бактерий рода Campylobacter, прогнозировать интенсивность размножения бактериальных популяций в продовольственном сырье и готовых продуктах, оценивать способность возбудителя к преодолению защитных барьеров макроорганизма с целью разработки более эффективных и точных алгоритмов контроля возбудителя кампилобактериоза. Эти данные также необходимы для создания эффективных систем микробиологического контроля на всех этапах сельскохозяйственного производства, переработки и хранения пищевых продуктов.
Работа выполнена при поддержке Российского научного фонда (проект № 15-16-00015-П).
8. Виноградова К.А., Булгакова В.Г., Полин А.Н., Кожевин П.А. Устойчивость микроорганизмов к антибиотикам: резистома, её объем, разнообразие и развитие. Антибиотики и химиотер. — 2013. — Т. 58. — № 5—6, С. 38—48. / Vinogradova K..A, Bulgakova V.G., Polin A.N., Kozhevin P.A. Ustoychivost' mikroorganizmov k antibiotikam: rezistoma, ee ob"em, raznoobrazie i razvitie. Antibiotiki i khimioter 2013; 58: 5—6: 38—48. [in Russian]
9. Aminov R.I. and Mackie R.I. Evolution and ecology of antibiotic resistance genes. FEMS Microbiol Lett 2007; 271: 2: 147—161.
10. Monier J.-M, Demaneche S, Delmont T.O. et al. Metagenomic exploration of antibiotic resistance in soil. Curr Opin Microbiol 2011; 4: 3: 236—243.
11. Bae J., Oh E, Jeon B. Enhanced transmission of antibiotic resistance in Campylobacter jejuni biofilms by natural transformation. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58: 12: 7573—7575.
12. Gangaiah D, Kassem I.I., Liu Z, Rajashekara G. Importance of polyphosphate kinase 1 for Campylobacter jejuni viable-but-noncultur-able cell formation, natural transformation, and antimicrobial resistance. Applied Environ Microbiol 2009. — vol.75. — No 24. —p.7838—7849.
13. Alfredson D.A., Korolik V. Antibiotic resistance and resistance mechanisms in Campylobacter jejuni and Campylobacter coli./ FEMS Microbiol Lett 2007; 277: 123—132.
14. Wang Y, Dong Y, Deng F, Liu D.,Yao H, Zhang Q.et al. Species shift and multidrug resistance of Campylobacter from chicken and swine, China, 2008-14. J Antimicrob Chemother 2016; 71: 666—669.
15. Iovine N.M. Resistance mechanisms in Campylobacter jejuni. Virulence 2013; 4: 3: 230—240.
16. Acheson D, Allos B. M. Campylobacter jejuni infections: update on emerging issues and trends. Clin Infect Dis 2001; 32: 8: 1201—1206.
17. Man S.M.The clinical importance of emerging Campylobacter species. Natur Rev Gastroenterol Hepatol 2011; 8: 12: 669—685.
18. Ефимочкина HP., Короткевич Ю.В., Стеценко В В., Пичугина Т.В., Быкова И.Б., Минаева Л.П., Шевелева С.А. Антибиотикорезистент-ность штаммов Campylobacter jejuni, выделенных из пищевых продуктов. Вопросы питания. — 2017. — № 1. — С.18—28. / Efimochkina N.R., Korotkevich Yu.V., Stetsenko V.V., Pichugina T.V., BykovaIB., Minaeva L.P., SHeveleva S.A. Antibiotikorezistentnost' shtammov Campylobacter jejuni, vydelennykh iz pishchevykh produktov. Voprosy pitaniya 2017; 1: 18—28. [in Russian]
19. McDermott P.E., Bodeis S.M., English L.L., White D.G., Wagne D.D. High-level ciprofloxacin MICs develop rapidly in Campylobacter jejuni following treatment of chickens with sarafloxacin. In: American Society for Microbiology, 101st Annual Meeting, Orlando, Florida, ASM Press, Washington, D.C. (2001), p. 742 Abstract Z-20.
20. Unicomb L. E., Ferguson J., Stafford R. J.et al. Low-level fluoroquinolone resistance among Campylobacter jejuni isolates in Australia. Clin Infect Dis 2006; 42: 10: 1368—1374.
21. Use of antimicrobial agents and occurrence of antimicrobial resistance in bacteria from food animals, food and humans in Denmark. 2012; ISSN 1600-2032: 80—83.
22. Payot S., Bolla J. M., Corcoran D. et al. Mechanisms of fluoroquinolone and macrolide resistance in Campylobacter spp. Microb Infect 2006; 8: 7: 1967—1971.
23. Olkkola S. Antimicrobial Resistance and Its Mechanisms among Campylobacter coli and Campylobacter upsaliensis with a special focus on streptomycin. Dissertationes Schola Doctoralis Scientiae Circumiectalis, Alimentariae, Biologicae. 2016.
24. Hannula M. Mechanisms and development of antimicrobial resistance in campylobacter with special reference to ciprofloxacin university of Helsinki. Faculty of Veterinary Medicine. 2010; 73: 1—73.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:
Стеценко Валентина Валерьевна — аспирант лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома Федерального государственного бюджетного учреждения науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи (ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»), Москва
25. Qin S., Wang Y., ZhangQ., Deng F., Shen Z., Wu C. et al. Report ofribo-somal RNA methylase gene erm(B) in multidrug resistant Campylobacter coli. Antimicrob Chemother 2014; 69: 964—968. http://dx.doi.org/ 10.1093/jac/dkt492/
26. Wang Y., Zhang M., Deng F., Shen Z., Wu C., Zhang J. et al. Emergence of Multidrug-Resistant Campylobacter Species Isolates with a Horizontally Acquired rRNA Methylase. Antimicrob Agents Chemother 2014; 58: 5405—5412.
27. Vacher S., Menard A., Bernard E., Santos A., Megraud F. Detection of mutations associated with macrolide resistance in thermophilic Campylobacter spp. by real-time PCR. Microb Drug Resist 2005; 11: 40—47.
28. Ефимочкина H P., Стеценко В В., Быкова И.Б., Маркова Ю.М., Полянина A.C., Алешкина А.И., Шевелева С.А. Исследование фенотипиче-ской и генотипической экспрессии антибиотикорезистентности Campylobacter jejuni под влиянием стрессовых воздействий. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2017. — Т. 164. — № 10. — С. 464—472. / Efimochkina N.R., Korotkevich YU.V, Stetsenko V.V., Pichugina T.V., Bykova IB, Minaeva L.P., SHeveleva S.A. Antibiotikorezistentnost' shtammov Campylobacter jejuni, vydelennykh iz pishchevykh produktov. Voprosy pitaniya 2017; 1: 18—28. [in Russian]
29. Laprade N., Cloutier M., Lapen D. R. et al. Detection of virulence, antibiotic resistance and toxin (VAT) genes in Campylobacter species using newly developed multiplex PCR assays. J Microbiol Methods 2016; 124: 41—47.
30. Sahin O., Shen Z., Zhang Q. Methods to study antimicrobial resistance in Campylobacter jejuni. Campylobacter jejuni. Humana Press, New York, NY. 2017; 29—42.
31. Gibreel A., Tracz D.M., Nonaka L., Ngo T.M., Connell S.R., Taylor D.E. Incidence of Antibiotic Resistance in Campylobacter jejuni Isolated in Alberta, Canada, from 1999 to 2002, with Special Reference to tet(O)-Mediated Tetracycline Resistance. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48: 9: 3442—3450.
32. Zhang Q., Plummer P.J. Mechanisms of antibiotic resistance in Campylobacter. Campylobacter, Third Edition. Amer Soc Microbiol 2008; 263—276.
Ефимочкина Наталья Рамазановна — д.б.н, ведущий научный сотрудник лаборатории биобезопасности и анализа нутримикробиома ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», Москва
