CC BY
599
Вестник ДВО РАН. 2006. № 6
А.М.ПОПОВ
Механизмы биологической активности гликозидов женьшеня: сравнение с гликозидами голотурий
Женьшень Panax ginseng, произрастающий на Дальнем Востоке и широко применяемый в восточной медицине, приобретает все большую популярность в мире. Главные активные компоненты женьшеня - гинзенозиды - включают три группы тритерпеновых гликозидов, которые обладают широким спектром медико-биологического действия. Разнообразные виды активности обусловлены способностью этих групп гликозидов взаимодействовать с различными рецепторами-мишенями на клеточной плазматической мембране, а также оказывать активное влияние на функциональную активность разных биохимических путей и внутриклеточных мишеней. Приведены последние данные сравнительных исследований гинзенозидов и тритерпеновых гликозидов голотурий, где основное внимание уделено мембранной, противоопухолевой и иммуномодулирующей активности с описанием возможных механизмов их действия.
Mechanisms of biological activity of ginsenosides: comparison with holothurian glycosides. A.M.POPOV (Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS, Vladivostok).
Ginseng is a highly valued herb in the Far East which has gained popularity in the West during the last decade. The main active components of ginseng are ginsenosides wich include three groups of triterpene glycosides, possessing the broad spectrum of medical-biological action. The diverse types of activities are conditioned by the ability of these groups of glycosides to interact with different receptors-target on the cellular plasmatic membrane, as well as to render the active influence upon functional activity of different biochemical ways and intracellular target. In this paper recent comparative studies of ginsenosides and triterpene glycosides of sea cucumbers, focused on the membrane, antitumor and immunomodulating properties, and their possible modes of action, are revierved.
Женьшень Panax ginseng C.A.Meyer - легендарное лекарственное растение, произрастающее на Дальнем Востоке и широко применяемое в восточной медицине, приобретает все большую популярность во всем мире. В течение прошлого столетия ученые пытались исследовать препараты женьшеня, используя фармакологические методы, классические для своего времени, и получали противоречивые результаты [11].
Первыми исследователями медико-биологических свойств женьшеня было показано, что его препараты обладают адаптогенным действием, т.е. способствуют улучшению приспособляемости организма к изменяющимся неблагоприятным условиям окружающей среды, задерживают наступление мышечного и умственного утомления, уменьшают воспалительные реакции на температурные и химические воздействия, ускоряют регенерацию поврежденных тканей [1].
В начале 1960-х годов группа сотрудников Дальневосточного филиала АН СССР под руководством Г.Б.Елякова выделила из корней женьшеня индивидуальные гликозиды три-терпеновой природы - панаксозиды [2]. Примерно в то же время группа японских химиков под руководством С.Шибата также выделила и установила структуру ряда гликозидов из корней женьшеня. Им присвоили название «гинзенозиды» [18]. Большинство современных исследователей использует в своих работах именно это название.
ПОПОВ Александр Михайлович - доктор биологических наук (Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, Владивосток).
К настоящему времени накоплена обширная научная информация, отражающая действие препаратов женьшеня на центральную нервную систему (память, обучение и поведение), нейроэндокринные функции, метаболизм углеводов и липидов, иммунную и сердечно-сосудистую системы [3, 6]. Кроме того, показано [11, 19], что женьшень и его компоненты обладают антинеопластическим, антистрессорным и антиоксидантным действием. Экстракт из корня женьшеня помогает при переохлаждении и перегревании, повышает устойчивость к различным инфекциям и токсическим веществам, активизирует ослабленные функции желез внутренней секреции, в частности половых желез, оказывает иммунотропное, противодиабетическое и противолучевое действие. Препараты на основе женьшеня активизируют восстановительные процессы в организме при выполнении тяжелой работы и после пребывания в экстремальных ситуациях. Эти препараты рекомендуют больным в период выздоровления для восстановления иммунологического статуса, людям пожилого возраста, а также спортсменам после истощающих тренировок [1, 3, 18].
В настоящее время принято считать [19], что тритерпеновые гликозиды женьшеня выступают как основные фармакофоры легендарного корня. Эти гликозиды (гинзенозиды), относящиеся к трем группам - протопанаксадиола (ППД), протопанаксатриола (ППТ) и олеаноловой кислоты (ОК) (рис. 1), обладают широким спектром медико-биологического действия.
Протопанаксадиол Протопанаксатриол Олеаноловая кислота
Рис. 1. Структурные формулы агликонов и гликозидов женьшеня. Состав углеводных остатков в формулах:
Гинзенозиды Я1 *2 Гинзенозиды Я1 Я2
Протопанаксадиол Протопанаксатриол
ш>1 Glc2 - Ю1е G1c6 - Ю1е Яе G1c2 - 1ЯЬа G1c
яь2 G1c2 - Ю1е G1е6 - 1Ага(р) G1е2 - Ю1е Н
Яе G1c2 - Ю1е G1c6 - ^аф Я§1 G1е G1е
яа G1c2 - Ю1е G1c КЬ1 G1е Н
Я§3 G1c2 - Ю1е Н F1 Н G1е
кь2 G1c Н Олеаноловая кислота
К (М1) Н G1c Яо G1еUA2 - Ю1е G1е
7-Я1 G1еUA2 - 1G1е Н
^о
|?,о
Гликозиды женьшеня, как вещества, обладающие нейротропными и анаболическими свойствами, способны оказывать прямое действие на центральную синаптическую передачу путем изменения ионного транспорта, модуляции специфического связывания классических нейротрансмиттеров с рецепторами и влияния через вторичные посредники на различные гормональные биохимические пути [6, 10, 19].
С древних времен и до настоящего времени препараты на основе женьшеня принимают в лечебных целях перорально. Важно обратить внимание на тот факт [13], что при попадании в желудочно-кишечный тракт большая часть нативных гликозидов подвергается воздействию кислотной среды желудка и ферментов кишечных бактерий, которые создают условия для их частичного или полного гидролиза. В результате таких метаболических превращений резко возрастает доля малополярных гинзенозидов и их генинов, которые в
нативном корне женьшеня встречаются в следовых количествах, например гинзенозидов К (М1), Я^3, ЯЬ2, Я^, 2-Я1 и агликонов - протопанаксадиола, протопанаксатриола и оле-аноловой кислоты (см. рис. 1).
Согласно современным представлениям [5-9, 11, 19], эти гликозиды имеют разные рецепторы-мишени как на плазматической мембране, так и внутри клетки. Взаимодействие с этими рецепторами приводит к регуляторному изменению метаболических процессов в различных органах и тканях. Гликозиды женьшеня в зависимости от структуры способны, подобно мембраноактивным комплексонам, взаимодействовать с компонентами мембран и, подобно гормонам, связываться и активировать внутриклеточные рецепторы стероидных гормонов, вызывая экспрессию специфических генов и изменение метаболических процессов.
Мембранотропная активность тритерпеноидов женьшеня и голотурий
В результате проведенного нами сравнительного изучения активности три-терпеновых гликозидов, выделенных из корней женьшеня и тела голотурий, определены существенные различия и характерные особенности мембранной активности этих групп гликозидов. Эти особенности в механизме мембранотропного действия позволяют разделить гликозиды женьшеня и голотурий на 4 группы [9], которые представлены на рис. 2.
Тритерпеновые
гликозиды
голотурий
Эхинозиды А и В, голотурины А и В, голотоксин Ах, кукумариозид Єї
Активность прямо пропорциональна содержанию стерина в мембране
Гликозиды женьшеня
ЗР-, 20Р-глюкозиды протопанаксадиола (Ші2, М1)
Активность обратно пропорциональна содержанию стерина в мембране
Зр-глюкуронозид олеаноловой кислоты гинзенозид Ъ-К\
Активность модулируется pH среды (увеличение активности при pH < 7,0)
Нативные гликозиды женьшеня (Ш)і, Ясі, Яе, и др.), минорные гликозиды панаксатриола
Отсутствие мембранолити-ческого действия
Рис. 2. Разделение гликозидов женьшеня и голотурий по механизму мембранотропной активности
Гликозиды голотурий - типичные представители первой группы тритерпеновых гликозидов (рис. 2). Эти гликозиды взаимодействуют с биологическими и модельными мембранами, содержащими природные стерины, с образованием гликозид-стериновых проводящих комплексов, резко увеличивающих мембранную проницаемость. Характер изменения мембранной проницаемости зависит от дозы гликозида в растворе и вида стерина в мембране. Из других групп низкомолекулярных мембраноактивных комплексонов, которые также специфично взаимодействуют со стеринсодержащими мембранами, следует назвать полиеновые антибиотики [15] и гликоалкалоиды [14]. Динамика образования и структуры мембранных комплексов гликозидов голотурий, полиенов и гликоалкалоидов со стеринами сильно различаются между собой [14, 15]. Интересно, что гликозиды голотурий наиболее эффективно действуют на мембраны, содержащие холестерин. В отличие от них, полиеновые антибиотики и стероидные гликоалкалоиды проявляют большее сродство к эргостерину и растительным стеринам (в-ситостерину и фукостерину) соответственно.
Тритерпеновые гликозиды голотурий по структуре агликона являются производными ланостерина и относятся к голостановому ряду (рис. 3) [4]. Из разных видов голотурий к настоящему времени выделено более 70 гликозидов с установленной полной структурой.
Эхинозид А Эхинозид В Голотурин А
Голотурии В Голотоксин А] Кукумариозид в]
Рис. 3. Структурные формулы агликонов и гликозидов различных голотурий
Агликонами этих веществ являются различные окисленные производные голостанола, а углеводные цепи присоединены в положении С-3 этих агликонов. Представленные на рис. 3 гликозиды из голотурий, обитающих в морях Тихого, Индийского и Атлантического океанов, обладают высокой мембранолитической и цитотоксической активностью [6].
В настоящее время накоплена обширная информация о взаимосвязи цитотоксической активности гликозидов голотурий с фрагментами их структуры. Подавляющее большинство активных гликозидов голотурий содержит 18(20)-лактон в агликоне. Важно подчеркнуть, что при переходе от гликозидов, не имеющих лактона вообще или имеющих 18(16)-лактон, к голостановым производным мембранотропная активность повышается почти на два порядка. При переходе от веществ, содержащих 9(11)-двойную связь и 16-кетогруппу, к веществам с 7(8)-двойной связью и 23-ацетоксигруппой происходит рост цитотоксической активности в 2-3 раза [4].
Углеводные цепи гликозидов голотурий достаточно вариабельны, но их общий план строения чрезвычайно стабилен. Уровень цитотоксической активности прямо пропорционален числу моносахаридных остатков в углеводной цепи. Наибольшую активность проявляют гликозиды, имеющие линейный тетрасахаридный углеводный остаток. При переходе к веществам, содержащим хиновозу, активность возрастает в 4-8 раз. Тритерпеновые гликозиды специфичны для достаточно крупных таксонов голотурий - родов и подсемейств - и, следовательно, выступают одним из хемотаксономических маркеров [4].
Цитотоксичность гликозидов голотурий - основной фактор защиты, гарантия выживания, распространения и процветания различных видов голотурий в морских биоценозах. Помимо выполнения защитных функций, тритерпеновые гликозиды, по-видимому, принимают участие в различных внутритканевых биохимических процессах (транспортных, сигнальных и т.д.), частным проявлением которых является функция контроля нереста [4].
В начале 1980-х годов нами была выдвинута «стериновая гипотеза» механизма биологического действия гликозидов голотурий и резистентности клеток и тканей к собственным токсинам. Согласно этой гипотезе, биологическая активность данной группы сапонинов - тритерпеновых гликозидов определяется сродством к стерину, образованием в мембране гликозид-стериновых проводящих комплексов, которые перфорируют мембрану и изменяют мембранную проницаемость. В процессе эволюции присутствие в теле голотурий токсичных гликозидов привело к скоординированному изменению набора сте-ринов по сравнению с другими классами животных. В теле голотурий, синтезирующих токсичные гликозиды, вместо холестерина представлены необычные Д9(11)- и Д7-стерины. При этом общее содержание свободных стеринов уменьшено за счет их сульфатирования и гликозилирования. Наличие в теле голотурий необычных модифицированных стеринов способствует резистентности их клеточных мембран к токсичным гликозидам [6].
Гинзенозиды протопанаксадиола К(М1), Rh2, Rg3 составляют вторую группу сапонинов (см. рис. 1 и 2). Мембранная активность этих гликозидов обратно пропорциональна содержанию холестерина в мембране. В отличие от гликозидов голотурий, они достигают максимального мембранотропного эффекта при взаимодействии с липидным бислоем, не содержащим холестерина. Кроме того, активность этих гликозидов заметно возрастает при снижении рН среды инкубирования [9].
Гинзенозид олеаноловой кислоты Z-R1 можно отнести к третьей группе гликозидов, проявляющей выраженные рН-зависимые свойства (см. рис. 1 и 2). В основе их мембранной активности лежат механизмы, связанные с резким нарушением барьерных свойств мембран при снижении рН среды, по-видимому, вследствие нейтрализации заряда карбоксильной группы, погружения в бислой гидрофобного агликона и образования в нем проводящих структур. С ростом концентрации этих гликозидов в кислой среде наблюдается процесс дестабилизации и лизиса клеточных мембран вне зависимости от их липидного состава. Взаимодействие этих гликозидов с мембранными компонентами при рН7 носит «обратимый» характер. Такими же свойствами обладает каулозид С из растения стеблелист мощный Caulophyllum robustum Maxim. [9]. Эту категорию гликозидов составляет многочисленная группа кислых монодес-мозидов, имеющих свободную карбоксильную группу в положении С-17 (гликозиды олеаноловой кислоты, хедерагенина и др.). Нельзя исключить и другие механизмы действия кислых гликозидов на клетки. Кислые тритерпеноиды, к которым относятся 18-а- и 18^-глицирретовая, урсоловая и олеаноловая кислоты, являются высокоселективными ингибиторами цАМФ-зависимой протеинкиназы А, но не действуют на активность других ферментов этого типа [6].
Наконец, четвертую группу составляют сапонины, не нарушающие барьерных функций мембран и не обладающие цитотоксической активностью (см. рис. 1 и 2). В эту категорию входит основная часть нативных гликозидов женьшеня, а именно: Rb1, Re, Rg2, Rg1, Rd, Rf, Ro и др. Две углеводные цепи, присоединенные к агликону с разных концов молекулы, а также расположение функциональных групп агликона, препятствующих его свободному проникновению в мембранный бислой, определяют их принадлежность к данной группе. При нормальных условиях содержание гинзенозидов с двумя углеводными цепями является доминирующим по сравнению с гликозидами, содержащими одну углеводную цепь. Это своего рода форма хранения, «депонирования» сапонинов в растениях. Следует подчеркнуть, что благодаря отсутствию цитотоксических свойств отдельные представители этой группы могут проявлять гормоноподобную активность, оказывать существенное положительное влияние на функциональную активность мембранных ферментов и клеточных сигнальных систем, особенно дифференцированных клеток [9].
Как отмечено выше, гликозиды голотурий являются эффективными защитными средствами благодаря селективному взаимодействию со «стериновым рецептором» с образо-
ванием в мембране гликозид-стери-новых проводящих комплексов. При этом чем выше аффинитет к стерину, тем действеннее гликозид как средство защиты. Тритерпеновые глико-зиды женьшеня не имеют одного явного «рецептора» на липидной части клеточной мембраны, но одним из доминирующих факторов мембранной активности некоторых гликози-дов женьшеня являются условия рН среды, которые резко изменяются в ответ на проникновение патогенного микроорганизма, что связано с особенностями развития общей для всех растений защитной гиперчув-ствительной реакции (рис. 4). Ги-перчувствительный ответ приводит к некрозу ткани в местах проникновения патогена, закислению среды и модификации структуры гликозидов в сторону усиления их мембранолитического и цитотоксического действия. Условия протекания гиперчувствительной реакции оптимальны для проявления защитной функции гликозидами женьшеня в организме-продуценте [6].
Противоопухолевая и антиметастатическая активность гликозидов женьшеня и их синтетических аналогов
Рост, развитие и метастазирование злокачественных опухолей являются многозвенным процессом, патогенетический механизм которого недостаточно изучен, а химиотерапевтические способы ингибирования опухолевого роста в организме не отличаются эффективностью и надежностью. Поэтому направленный поиск и разработка противоопухолевых и антиметастатических агентов остаются чрезвычайно актуальной проблемой.
Наши предварительные исследования показали, что нативные гликозиды женьшеня: гинзенозиды Rbp Rd (ППД), Rgp Rf (ППТ) и Ro (ОК) - не оказывают цитотоксического действия на опухолевые клетки in vitro и не обладают достоверной противоопухолевой активностью in vivo. Однако минорные гликозиды: гинзенозиды Rh2 и М1 (20(8)-ППД), Z-R1 (ОК) - эффективно ингибируют рост опухолевых клеток.
Листья дальневосточных видов берез рода Betula содержат в сравнительно больших количествах тритерпеногенин даммаранового ряда бетулафолиентриол, который отличается от одного из генинов гликозидов корня женьшеня 20(8)-протопанаксадиола (рис. 1) только конфигурацией гидроксильной группы у С-3 положения. Близкое структурное сходство агликонов гликозидов женьшеня и тетрациклических тритерпеноидов даммаранового ряда из листьев берез позволило использовать последние в качестве относительно доступного исходного сырья для полусинтетического получения некоторых минорных гликозидов женьшеня, которые являются к тому же наиболее вероятными активными метаболитами основных нативных гликозидов, и их аналогов [12].
Мы исследовали противоопухолевую активность и некоторые стороны механизма действия 3ß-0-(I), 12ß-0-(II), 20Р-О-(Ш)-моноглюкозидов протопанаксадиола и 3a-0-(IV), 12a-0-(V), 20a^-(VI) моноглюкозидов бетулафолиентриола [8]. Серия экспериментов с использованием разных доз и схем лечения показала, что эти гликозиды обладают
Рис. 4. Предполагаемое участие гликозидов женьшеня в защитном ответе этого растения на проникновение патогена
умеренной противоопухолевой активностью, увеличивая среднюю продолжительность жизни животных на 30-80%. Так, средняя продолжительность жизни мышей достоверно увеличивалась при однократном лечении моноглюкозидом I на 44%, II - на 53, III - на 44, IV - на 25, V - на 33, VI - на 78%. Значительной редукции опухолевого роста удается достигнуть на начальном этапе развития опухоли (до 10-12 дн.), в последующие дни отмечается возобновление опухолевой массы. При этом указанные гликозиды стимулируют фагоцитарную активность макрофагов в течение 24-48 ч, но затем эта активность быстро снижается. Участие макрофагов в опосредовании противоопухолевого действия, очевидно, отвечает за способность минорных гликозидов женьшеня и их синтетических аналогов стимулировать их цитотоксический потенциал [8].
Используя в качестве биологического теста асцитные опухолевые клетки Эрлиха, мы изучили действие исследуемых моноглюкозидов на биосинтез ДНК, РНК и белка. Было показано, что они ингибируют включение меченых предшественников в кислотонерастворимую фракцию опухолевых клеток, но не в одинаковой степени. Ингибирующая активность моноглюкозидов протопанаксадиола возрастает в ряду I < II < III. Эффективность ингибирования внутриклеточного биосинтеза моноглюкозидами бетулафолиентриола возрастает в ряду V < IV < VI. При этом не прослеживается характерных различий в действии исследуемых монозидов на включение меченых предшественников в биосинтез ДНК, РНК и белка.
В пользу первичного нарушения клеточной мембранной проницаемости свидетельствуют данные о действии исследуемых моноглюкозидов на избирательную проницаемость опухолевых клеток для УФ-поглощающих веществ, где выход из клеток внутриклеточного нуклеотидного пула, индуцированный монозидами, четко коррелирует с ингибированием включения меченых предшественников в биосинтез макромолекул [8].
Таким образом, можно предположить, что механизм ингибирующего действия данных моноглюкозидов на опухолевые клетки связан с нарушением избирательной проницаемости клеточных мембран, т.е. они проявляют свойства типичных цитолитиков.
Представляло интерес изучить антиметастатическую активность и действие на макро-фагальное звено иммунитета четырех минорных гликозидов женьшеня, которые в зависимости от структуры их агликонов можно отнести к трем различным группам гликозидов: Rh2 и M1 (20(Б)-ППД), Rf (20(Б)-ПЦД) и Z-R1 (ОК) (см. рис. 1). Гинзенозиды Rh2 и М1 получены в результате химической трансформации бетулафолиентриола, а гинзенозиды Rf и Z-R1 выделены из корня Panax ginseng C.A.Meyer [5].
Экспериментальные легочные метастазы вызывали у белых беспородных мышей введением в латеральную хвостовую вену по 0,1 мл опухолевых клеток карциномы Эрлиха, доведенных физраствором до плотности около 5 х 107 на 1 мл. Исследуемые вещества вводили перорально в течение 5 дн. через 24 ч после инокуляции опухоли. Через 20 дн. мышей подвергали эвтаназии и их легкие помещали в фиксирующий раствор. Критериями антиметастатической активности служили частота метастазирования в легкие (% животных в группе), среднее количество метастазов на животное, а также индекс торможения метастазирования (ИТм).
Результаты эксперимента показали (табл. 1), что лечебное пероральное применение гликозидов Rh2, M1 и Z-R1 в дозе 20 мг/кг в течение 5 дн. приводит к заметному уменьшению частоты метастазирования карциномы Эрлиха в легочной ткани экспериментальных животных. Величины индексов торможения метастазирования для Rh2, M1 и Z-R1 составили 36,5, 39,6 и 20,5% соответственно. Гликозид протопанаксатриола Rf при указанной схеме лечения и маршруте введения антиметастатической активностью не обладал. Для более глубокого понимания всех сторон антиметастатического действия этих веществ необходимо учитывать их влияние на различные компоненты иммунной системы.
Влияние гликозидов на метастазирование карциномы Эрлиха в легкие экспериментальных животных
Соединение Количество животных Лечебная доза, мг/кг х дни Частота мета-стазирования, % Количество ме-стастазов на 1 животное 8 %
^2 9 20 х 5 68,5 6,1 ± 1,0* 36,5
М1 8 20 х 5 64,2 5,8 ± 0,8* 39,6
И/ 8 20 х 5 98,0 9,2 ± 0,9 -
2-Я1 8 20 х 5 78,3 7,2 ± 1,2* 20,5
Контроль 10 - 100,0 9,6 ± 1,4 -
* Различия статистически достоверны при р < 0,05.
При изучении активности исследуемых гликозидов мы провели определение функциональной активности макрофагов внутриперитонеального экссудата (количество фагоцитов, захвативших микробные клетки, от их общего числа). Измерение генерации макрофагами активных форм кислорода (АФК) проводили в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест).
Экспериментальные данные показали (табл. 2), что под действием Rh2, М1 и 2-И1 в концентрациях от 1 до 20 мкг/мл способность макрофагов поглощать микробные клетки увеличивается на 15-40%. Если глюкозиды Rh2 и М1 (ППД) вызывали активирующее или ингибирующее влияние на продукцию АФК макрофагами в зависимости от их концентрации в инкубационной среде, то гликозид 2-И1 (ОК) достоверно повышал респираторную активность макрофагов только в дозе 20 мкг/мл. Гликозид Rf (ППТ) в исследованном диапазоне концентраций не оказывал достоверного влияния на фагоцитарный показатель (менее 5%) и практически не вызывал изменения в продукции АФК.
Таблица 2
Влияние гликозидов на продукцию АФК клетками перитонеального экссудата мышей -носителей метастазирующей опухоли (восстановление нитросинего тетразолия, ОО650 х 1000)
Соединение Концентрация гликозидов в растворе, мкг/мл
5 10 20 40
145±12* 165±15* 155±13* 115±10
М1 158±13* 175±18* 148±14* 110±12
И/ 124±12 128±13 132±11 138±15
2-Я1 133±11 140±16* 127±15 120±13
Контроль 125±15
* Различия статистически достоверны при р < 0,05.
Среди активных форм кислорода оксид азота (N0) играет ключевую роль в цитотоксичности активированных макрофагов в отношении опухолевых и бактериальных клеток-мишеней. Макрофагальные клетки внутриперитонеального экссудата, полученные от групп животных - носителей метастазирующей опухоли, которые проходили курс лечения гликозидами Rh2, М1 и 2-И1 в дозе 20 мг/кг в течение 5 дн., имели повышенный уровень формирования нитрит-ионов (30-80% по сравнению с контролем). Уровень нитрит-ионов в макрофагах, полученных от группы животных, проходивших лечение гликозидом Rf, не превышал уровня контрольных значений [5].
Помимо действия на макрофагальное звено иммунитета исследуемые глико-зиды модулируют активность нормальных киллерных клеток (НК-активность) (рис. 5). Гликозиды вводили перорально в дозе 20 мг/кг в течение 5 дн., начиная со следующего дня после введения опухолевых клеток. Спленоциты получали по стандартной методике из контрольных и опытных групп животных на 20-й день после инокуляции опухоли и использовали в качестве эффекторных клеток против клеток-мишеней линии УАС-1.
На рис. 5 можно видеть, что цитотоксичность спленоцитов, полученных от групп животных, проходивших лечение гликозидами и М1, значительно выше, чем у двух контрольных групп. Спленоциты животных, которым вводили лечебные дозы гликозида И/, проявляли умеренную киллер-ную активность. Пероральное применение 2-Ю в лечебной дозе 20 мг/кг не приводило к достоверному изменению киллерной активности спленоцитов.
Одно из главных событий во время программируемой клеточной смерти - резкое увеличение концентрации ионов Са2+ и активных форм кислорода в цитоплазме. Мы определили основные параметры взаимодействия между метаболизмом Са2+ и формированием АФК после действия минорных гликозидов женьшеня на опухолевые клетки. Было показано, что в низких дозах гинзенозиды КЪ2, М1 и 2-Ю индуцируют освобождение ионов Са2+ из эндо-плазматического ретикулума в цитоплазму с последующим его восстановлением до нормальных значений (около 100 мкМ). При этом возрастает продукция АФК, что указывает на тесное сопряжение этих процессов. Следует подчеркнуть, что оптимальные концентрации ионов Са2+ и активных форм кислорода способны выполнять регуляторные функции, включая экспрессию необходимых для клетки генов. С повышением дозы гликозидов в среде индуцируются необратимое повышение уровня цитоплазматического Са2+, резкий выброс активных форм кислорода - важные индикаторы последующей утраты клетками жизнеспособности и сигнал развития апоптотической гибели опухолевых клеток [5].
Способность гликозидов ИЪ2, М1 и 2-Ю повышать биологическую реактивность ин-тактного и опухолевого организма, положительно влиять на его иммунологический статус (стимуляция иммуногенеза, усиление фагоцитарной, цитотоксической активности макрофагов и активности нормальных киллерных клеток) сочетается со способностью оказывать прямое цитостатическое действие на метастазирующие опухолевые клетки [5]. Механизм иммуномодулирующей активности этих моногликозидов, по-видимому, связан с индукцией дополнительных костимулирующих сигналов, возникающих при их воздействии на иммунокомпетентные клетки [16, 17].
Мембраноактивные сапонины могут привлекать клетки макрофагального ряда в участки инъекции, а также, вызывая повышение проницаемости клеток, способствовать распространению антигенов в региональные лимфоузлы и тем самым оказывать влияние на их функциональную активность как гуморального, так и клеточного звена иммунитета, а именно: вызывать стимулирование продукции иммуноглобулинов и широкого набора лимфокинов, например таких, как у-интерферон и различные интерлейкины [20].
Объяснение антиметастатической и иммуномодулирующей активностей гликозидов КЪ2, М1 и 2-Ю можно представить с позиций мембранной теории «мягкого стресса» [5]. Эти мембраноактивные гликозиды изменяют структурно-функциональные свойства клеточных плазматических мембран и, как следствие, клеточный гомеостаз опухолевых и иммуноком-
30
20
10
■ Э:М= 20:11
□ Э:М = 50:11 Т
■п л Л1 (\ л
Ш2
1
Рис. 5. Влияние гликозидов ЯИ2, М1, 2-Ю и И/ на НК-ак-тивность клеток селезенки мышей - носителей метастази-рующей опухоли Эрлиха.
По оси абсцисс - группы животных; по оси ординат - активность НК-клеток, %. Контрольные группы: 1 - ин-тактные мыши; 2 - нелеченые мыши. Опытные группы: 3 - ЯИ2; 4 - М1; 5 - И/; 6 - 2-Ю. Э - эффекторные клетки; М - клетки-мишени
петентных клеток. В ответ активируются вторичные мессенджеры внутриклеточных стресс-активируемых систем и связанные с ними определенные биохимические пути, включающие сети митоген- и стресс-активируемых протеинкиназ. В результате этих изменений в части опухолевых клеток развиваются апоптотические процессы, а в части иммунокомпетентных клеток, например в гранулоцитах и макрофагах, составляющих первое звено иммунной защиты организма, запускаются реакции «дыхательного взрыва». В свою очередь цитоток-сическая активность макрофагов, которая обусловлена активными формами кислорода, генерируемыми НАДН-оксидазой, NO-cинтазой, а также другими внутриклеточными ок-сидазами, опосредует позитивный противоопухолевый эффект данных гликозидов (рис. 6).
«Дыхательный взрыв» с образованием токсичных активных форм кислорода
I
Усиление цито токсичности макрофагов, НК-клеток, активация Т- и В-клеток
Рис. 6. Предполагаемый механизм противоопухолевого действия минорных гликозидов женьшеня
На основании вышеизложенных результатов можно заключить, что активные глико-зиды реализуют свое противоопухолевое действие двумя путями: прямым ингибированием пролиферации опухолевых клеток и опосредованно - через иммунобиологические реакции организма. В связи с этим минорные гликозиды женьшеня и их синтетические аналоги, сочетающие прямое цитотоксическое действие на опухолевые клетки с иммуномодулирующей активностью, представляют большой интерес как потенциальные противоопухолевые агенты.
Иммуномодулирующая активность тритерпеновых гликозидов даммаранового и голостанового ряда
Несмотря на большое количество средств, способных оказывать иммуностимулирующее влияние, полностью безопасные и дающие однонаправленный эффект препараты с точным механизмом действия в настоящее время практически отсутствуют. Поэтому
остается актуальным поиск новых малотоксичных иммуномодуляторов. Термином «иммуномодуляция» обозначают дозозависимое усиление или угнетение клеточного и гуморального иммунитета и специфических факторов защиты. Крайние проявления иммуномодуляции - иммуносупрессия (подавление иммунного ответа) и иммуностимуляция, иммунопотенцирование (усиление иммунных реакций).
Поиск новых иммуностимуляторов, действие которых сопоставимо или превосходит известные органические и минеральные адъюванты (полный адъювант Фрейнда, соли алюминия и др.), определяет интерес исследователей к изучению природных тритерпе-новых гликозидов. Одним из возможных способов модуляции иммунного ответа является модификация структуры и функции биологических мембран лимфоцитов. Тритерпеновые гликозиды растительного и животного происхождения, воздействующие на структуру и функции лимфоцитарных мембран, - перспективный класс иммуномодуляторов с разнообразным спектром иммунотропного действия. Среди представителей данного класса соединений в этом отношении наиболее изучены сапонины из Quillaja saponaria [16]. Приведенные ниже результаты свидетельствуют о перспективности использования в лечебных и профилактических противоинфекционных препаратах тритерпеновых гликозидов женьшеня и морских беспозвоночных.
Как говорилось выше, на основе бетулафолиентриола были разработаны пути синтеза для получения в достаточном количестве минорных гликозидов женьшеня и их синтетических аналогов, главным образом монозидов, которые проявляют противоопухолевую, антимета-статическую и иммунотропную активность. Представляло интерес изучить в сравнительном плане иммуномодулирующую активность гликозидов даммаранового ряда: моноглюкозидов 3-О-, 12-О-, 20-0-протопанаксадиола и бетулафолиентриола, а также гликозидов голостанового ряда (см. рис. 3): голотуринов А и В, эхинозида А и голотоксина А1 [7].
Нефракционированные спленоциты, а также Т- и В-клетки культивировали в 96-луноч-ных микроплейтах в 200 мкл полной ростовой среды с добавлением увеличивающихся доз гликозидов (от 0,001 до 100 мкг/мл). Было обнаружено, что пролиферативная активность спленоцитов в значительной степени зависит от дозы гликозида в среде и его химической структуры [7]. В серии опытов с исследуемыми гликозидами были выявлены оптимальные дозы, вызывающие позитивный иммунный ответ как нефракционированных спленоцитов, так и субпопуляций Т- и В-лимфоидных клеток. Предварительная обработка лимфоцитов гликозидами голотурий в дозах от 0,01 до 0,1 мкг/мл и минорными гликозидами женьшеня и их аналогами в дозах от 0,1 до 10 мкг/мл в течение 24 ч приводит к значимому изменению функциональной активности лимфоцитов (от 10 до 40%), что отражает их последующий ответ на воздействие поликлональных митогенов. С дальнейшим ростом концентрации гликозида в среде стимулирующий эффект сменяется на противоположный.
Инкубация спленоцитов в присутствии оптимальных доз гликозидов в течение 18 ч приводит к заметным изменениям в их функциональной активности. Об этом можно судить по их реакциям in vitro на добавление в среду митогенов - конканавалина А (Кон А) и фитогемагглютинина (ФГА). Можно видеть, что в оптимальных дозах исследуемые глико-зиды обладают митогенным и митоген-стимулирующим действием как на нефракционированные клетки, так и на Т- и В-клетки селезенки. Однако оптимальные дозы гликозидов даммаранового и голостанового рядов, вызывающие стимулирующее и ингибирующее действие на бластогенез лимфоидных клеток, значительно различаются между собой -10 мкг/мл и выше в случае минорных гликозидов женьшеня и их аналогов и 0,1 мкг/мл и ниже - в случае гликозидов голотурий.
Для приготовления супернатантов от культур лимфоцитов, стимулированных гликози-дами, спленоциты культивировали с исследуемыми гликозидами в среде без сыворотки. Соответствующие надосадочные жидкости были пятикратно обработаны на мембранном фильтре РМ-10 фирмы «Amicon» (США). Концентраты стерилизовали пропусканием через фильтр и до использования хранили при -20°С. Для определения хелперной активности надосадочной жидкости в инкубационную ростовую среду со спленоцитами
добавляли супернатанты (25% от конечного объема) от культур спленоцитов, стимулированных разными гликозидами. Для определения бластогенеза к сходной серии культур добавляли субоптимальные концентрации поликлональных митогенов - ФГА (25 мкг/мл) или Кон А (10 мкг/мл) [7].
Показано, что присутствие в бессывороточной среде оптимальных доз гликозидов индуцирует в культуре спленоцитов секрецию растворимых факторов, которые вызывают пролиферацию лимфоцитов. Добавление оптимальных доз митогенов Кон А и ФГА вызывает в этих культурах устойчивое усиление пролиферативного ответа [7].
Исследуемые гликозиды при действии на культуру спленоцитов в оптимальных концентрациях индуцируют секрецию растворимых медиаторов (цитокинов), которые вызывают пролиферацию лимфоцитов и усиливают их бластогенез. При этом иммуномодулирующий эффект аналогов гликозидов женьшеня заметно выше, чем у «морских» гликозидов голостанового ряда. Самую высокую активность в отношении иммунокомпетентных клеток проявляет гинзенозид Rh2, наиболее эффективно индуцирующий освобождение из клеток вторичных медиаторов (цитокинов), которые активируют эффекторные лимфоидные клетки, ответственные за Т-клеточную цитотоксичность. Супрессивное действие четко коррелирует со степенью выраженности цитотоксического и мембранотропного эффекта. Можно предположить, что в оптимальных дозах исследуемые гликозиды способны усиливать иммунный ответ через сигнальные системы иммунокомпетентных клеток путем потенцирования секреции растворимых медиаторов (цитокинов), миграция которых в кровоток может регулировать функционирование иммунной системы [7].
Исследуемые гликозиды голотурий влияют на потенциал цитостатической активности макрофагов в зависимости от их концентрации в инкубационной среде. Так, в дозах выше 1 мг/кг они оказывают супрессивное действие на макрофагальную активность. Однако после внутрибрюшинного введения голотоксина А1 в дозах 0,1 и 0,01 мг/кг уже через 4 ч усиливается (от 20 до 50%) способность макрофагов ингибировать включение [3Н]-тимидина в ДНК клеток карциномы Эрлиха. Цитостатическая активность макрофагов проявляется и через 24 ч после введения и слабо уступает по ингибированию синтеза ДНК макрофагам, полученным через 4 ч. Следует отметить, что макрофаги, активированные гликозидами, могут играть важную кооперирующую роль в иммуномодулирующей активности гликозидов.
Проведенная работа позволила сравнить особенности иммуномодулирующей активности тритерпеновых гликозидов даммаранового и голостанового рядов. Сходство проявляется прежде всего в дозозависимой двойственности их эффектов, т.е. в прямо противоположном действии «высоких» и «низких» доз. Правда, сами понятия - низкие и высокие дозы - различаются, составляя 0,01 и 1,0 мкг/мл для исследуемых гликозидов голостанового ряда и 0,5 и 50 мкг/мл для моноглюкозидов даммаранового ряда. Обе группы гли-козидов, являясь в оптимальных дозах стимуляторами иммунологических реакций, при повышении концентрации проявляют супрессивное действие [7].
Значительное сходство в действующих концентрациях гликозидов голостанового ряда можно объяснить сходством в их строении и механизме действия на клетку. У этих гликозидов родственные агликоны, включающие лактонное кольцо. Что касается исследованных гликозидов даммаранового ряда, то они различаются между собой только положением моноглюкозидных остатков (3-О-, 12-О-, 20-0-) или конфигурацией (а- или ß) ОН-группы в С-3 положении.
Механизмы, посредством которых эти вещества влияют на активность иммунокомпе-тентных клеток, еще не ясны. Одно из объяснений можно связать с мембранотропными свойствами этих веществ и их способностью вызывать изменения структурно-функциональных свойств клеточных и модельных мембран. Модифицирующее действие этих веществ на клеточные мембраны приводит к изменению ионного гомеостаза, к увеличению транспорта, в первую очередь ионов и малых молекул, что, очевидно, индуцирует трансмембранные сигналы и модулирует активность клеточных трансдукторных систем и сигнальных путей, ответственных за деление, дифференцировку и апоптоз иммунокомпетентных клеток [7].
Характер действия гликозидов голотурий на различные клеточные системы, содержащие стерины, строго зависит от их концентрации в среде. Примером могут служить обнаруженные нами модулирующее воздействие на активность иммунокомпетентных клеток, «поэтапное» воздействие на развитие эмбрионов морского ежа и на проницаемость эритроцитов [6]. Эти данные наводят на мысль, что образующиеся при малых концентрациях гликозидов небольшие каналы в некоторых случаях могут менять проницаемость биологических мембран в соответствии с интересами клетки.
Исследованные нами минорные гликозиды женьшеня и их синтетические аналоги в зависимости от дозы способны либо супрессировать (от 10 до 100 мкг/мл), либо стимулировать (от 0,1 до 5 мкг/мл) активность иммунокомпетентных клеток, т.е. проявляют иммуномодулирующие свойства. Поэтому можно предположить, что при приеме внутрь препаратов на основе женьшеня именно модифицированные малополярные формы гликозидов женьшеня и их генины, всасываясь после гидролиза в тонком и толстом отделах кишечника, вносят важный вклад в разнообразную фармакологическую активность этих препаратов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Брехман И.И. Женьшень. Л.: Медгиз, 1957. 179с.
2. Еляков Г.Б., Оводов Ю.С. Гликозиды аралиевых // Химия природ. соединений. 1972. № 6. С. 697-709.
3. Журавлев Ю.Н., Коляда А.С. Araliaceae: женьшень и другие. Владивосток: Дальнаука, 1996. 280 с.
4. Калинин В.И., Левин В.С., Стоник В.А. Химическая морфология: тритерпеновые гликозиды голотурий. Владивосток: Дальнаука, 1994. 284 с.
5. Попов А.М., Атопкина Л.Н., Уварова Н.И., Еляков Г.Б. Антиметастатическая и иммуномодулирующая активности минорных гликозидов женьшеня // Докл. АН. 2001. Т. 380, № 1. С. 113-116.
6. Попов А.М. Биологическая активность и механизмы действия вторичных метаболитов из наземных растений и морских беспозвоночных: дис. ... д-ра биол. наук. Владивосток: Тихоокеан. ин-т биоорган. химии ДВО РАН, 2003. 222 с.
7. Попов А.М., Атопкина Л.Н., Самошина Н.Ф., Уварова Н.И. Изучение иммуномодулирующей активности тетрациклических тритерпеновых гликозидов даммаранового и голостанового ряда // Антибиотики и химиотерапия. 1994. Т. 39, № 7. С. 19-23.
8. Попов А.М., Агафонова И.Г., Шенцова Е.Б., Атопкина Л.Н., Самошина Н.Ф., Уварова Н.И. Сравнительное изучение противоопухолевой активности моногликозидов протопанаксадиола и бетулафолиентриола // Антибиотики и химиотерапия. 1994. Т. 39, № 7. С. 24-29.
9. Попов А.М. Сравнительное изучение цитотоксического и гемолитического действия тритерпеноидов женьшеня и голотурий // Изв. РАН. Сер. биол. 2002. № 2. C. 155-164.
10. Попов А.М., Малиновская Г.М., Уварова Н.И., Атопкина Л.Н., Лоенко Ю.Н., Артюков А.А., Еляков Г.Б. Характеристика нейропротекторной активности тритерпеновых гликозидов и разработанной на их основе композиции «Женсолар» // Докл. АН. 1998. Т. 358, № 3. С. 413-415.
11. Attele A.S., Wu J. A., Yuan C.-S. Ginseng pharmacology // Biochem. Pharm. 1999. Vol. 58. P. 1685-1693.
12. Atopkina L., Uvarova N.I., Elyakov G.B. Simplified preparation of the ginsenoside-Rh2 minor saponin from ginseng // Carbohydr. Res. 1997. Vol. 303. P. 449-451.
13. Karikura M., Miyase T., Tanizawa H., Takino Y., Taniyma T., Hayashi T. Studies on absorption, distribution, еxcretion and metabolism of ginseng saponins. V. The decomposition products of ginsenoside Rb2 in the large intestine of rats // Chem. Pharm. Bull. 1990. Vol. 38. P. 2859-2861.
14. Keukens E.A.J., Vrije de T., Boom van den C., Waard de P., Plasman H.H., Thiel F., Chupin V., Jongen W.M.F., Kruijff de B. Molecular basis of glycoalkaloid induced membrane disruption // Biochim. Biophys. Acta. 1995. Vol. 1240. P. 216-228.
15. Kruijff de B., Demel R.A. Polyene antibiotic-sterol interactions in membranes of Acholeplasma laidlawii cells and lecithin liposomes. III. Molecular structure of the polyene antibiotic-cholesterol complexes // Biochim. Biophys. Acta. 1974. Vol. 339. P. 57-70.
16. Morein B., Hu K.-F. Biological aspects and prospects for adjuvants and delivery systems // New Vaccine Technologies. Eurekah. Com. 2000. Ch. 16. P. 274-291.
17. Rivera E., Pettersson F., Inganas M., Paulie S., Gronvik K.O. The Rb1 fraction of ginseng elicits a balanced Th1 and Th2 immune response // Vaccine. 2005. Vol. 23. P. 5411-5419.
18. Shibata S. Saponins with biological and pharmacological activity // New natural products and plant drugs with pharmacological, biological or therapeutical activity. Berlin; Heidelberg: Springer Verlag, 1977. P. 177-196.
19. Soldati F. Panax ginseng: standartization and biological activity // Biologically active natural products: pharmaceuticals. CRC Press LLC, 2000. P. 209-232.
20. Wu C.-A.,Yang Y.-W. Induction of сell death by saponin and antigen delivery purpose // Pharmaceutical Res. 2004. Vol. 21. P. 271-277.
