CC BY
42
Лекарственные растения
© ШАНТАНОВА Л.Н., ПЕТУНОВА А.Н., НИКОЛАЕВ С.М., АЛЕКСЕЕВА Э.А. -
МЕХАНИЗМЫ АНТИСТРЕССОРНОГО ДЕЙСТВИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА "ПЕНТАФИТОН"
Л.Н. Шашпанова, А.Н. Петунова, С.М. Николаев, Э.А. Алексеева.
(Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, г. Улан-Удэ, директор - проф. В.М. Кор-супов)
Резюме. Механизмы антистрессорного действия многокомпонентного растительного средства "Пентафитон" обусловлены наличием антиоксидантной активности.
Ключевые слова: стресс, механизмы антистрессорного дейцствия, растительные адаптогены "Пентафитон".
За последние десятилетия накоплен достаточно большой клинико-экспериментальный материал, свидетельствующий об эффективности профилактики и коррекции стрессорных повреждений с помощью адаптогенов, в ряду которых наиболее перспективными являются средства природного происхождения. Нами раннее было установлено, что настойка "пентафитон" из растительного сырья Poligonatum odoratum (Mill) Druce, Peuceda-num morisonii Bess., Paeonia anómala L., Asparagus officinalis L., Tribulus terrestris L., обладает адап-тогенной активностью, повышая резистентность организма к действию экстремальных факторов различной природы, в том числе острому иммо-билизапионному и эмоциональному стрессу.
Целью настоящего исследования явилось определение возможных механизмов антистрессорного действия растительного средства "пентафитон".
Материалы и методы
Исследования выполнены на крысах линии Вистар обоего пола массой 160-170 г. Животные были разделены на 4 группы: 1 - интактныс животные (п=6); 2 - контрольные животные, которых подвергали иммобилизапионному стрессу (п=10); 3 - животные, получавшие "пентафитон" при иммобилизапионном стрессе (п=10); 4 - животные, принявшие препарат сравнения (п=10). Иммобилизапионный стресс воспроизводили путем фиксации животных в положении на спине в течение 12 часов. Животным 3 группы внутриже-лудочно вводили деалкоголизированный раствор "пентафитона" в объеме 3,0 мл/кг превентивно в течение 7 дней до иммобилизации. Крысы контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды по аналогичной схеме. В качестве препарата сравнения использовали деалкоголизированный раствор экстракта элеутерококка в объеме 3,0 мл/кг. На 8-е сутки эксперимента животных контрольной и опытных групп подвергали 12-часовому стрессу, после чего декапитировали под легким эфирным наркозом и определяли выраженность катаболических изменений: массу надпочечников, селезенки и тимуса, а также появление язвенных повреждений в сли-
зистой оболочке желудка с расчетом индекса Паулса. С пелыо выявления возможных механизмов антистрессорного действия фитосредства определяли интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) по накоплению ТБК-активных продуктов в сыворотке крови [12], о состоянии антиоксидантной системы судили по активности супероксиддисмутазы (СОД) [14], ката-лазы [8], содержанию восстановленного глутатио-на [15]. В серии дополнительных экспериментов с использованием модельных систем определяли мембраностабилизирующую активность и влияние испытуемого средства на кинетику Ре"-инду-цированной хемилюминесценции (ХЛ). Мембраностабилизирующую активность оценивали по степени перекисного и осмотического гемолиза 1% суспензии эритроцитов донорской крови. Гемолиз эритроцитов вызывали реактивом Фентона (перекисный гемолиз) и добавлением дистиллированной воды (осмотический гемолиз) [6]. Компоненты, входящие в состав реактива Фентона, были использованы в минимальных концентрациях, вызывающих полный лизис эритроцитов: Ре304Х
Х7Н;0 - 0,01 мг/мл; Н;0; - 0,2 мг/мл (в пересчете на 100% раствора перекиси). В инкубационную среду (общим объемом 9 мл) добавляли деалкоголизированный раствор "пентафитона" в объеме 1 мл. Степень гемолиза измеряли через 24 часа по поглощению при 420 нм. Действие испытуемого средства на гемолиз оценивали в процентах по отношению к поглощению в контроле (без добавления испытуемого средства). Оценку влияния "пентафитона" на интенсивность свободнорадикальных процессов осуществляли общепринятым методом [9] с использованием суспензии липосом куриного желтка [5]. Среда инкубации содержала 1 мл фосфатного буфера; 0,5 мл суспензии липосом; 0,5 мл раствора эозина. Испытуемое средство в инкубационную среду добавляли в объеме 0,1 мл при разведениях: 1:0 (неразведенное); 1:2; 1:5; 1:10; 1:50. После 2-минутной инкубации в систему добавляли 0,2 мл РеЗОлНлО (38,5 мМ) и в течение 30 с регистрировали спонтанный уровень свечения на "Хемилюминометре РХЬ-ОГ' (Россия), после чего регистрировали свечение
Влияние "пентафитона" на выраженность катаболических повреждений органов белых крыс при 12-часовом иммобилизаиионном стрессе
Группы животных Средние величины массы, мг/ЮОг
тимуса надпочечников селезенки
1. Интактная 153,5±7,21 20,Ь± 1,54 653,7+24,02
2 Контрольная (стресс+ЩО) 104,4+10,40 31,3+1,06 294,3+26,04
3. Опытная 1 (стресс+пентафитон) 125,5+9,8* 22,5+ 1,03* 396,0+13,65*
4. Опытная 2 (стресс+элеутерококк) 119,6+7,10* 22,5+2,42* 429,6+26,02*
Примечание: * - здесь и далее значения, достоверно отличающиеся отданных животных контрольной группы при Р<(),()5.
контрольной пробы, не содержащей испытуемого средства. Определяли интенсивность быстрой вспышки (1бн), латентный период ХЛ, скорость ХЛ на начальной экспоненциальной стадии медленной вспышки. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием и-критерия Манна-Уитни [10].
Результаты и обсуждение Установлено, что 12-часовой иммобилизапи-онный стресс сопровождается развитием классического комплекса дистрофических изменений внутренних органов, характерных для стрессор-ной реакции: инволюцией иммунокомпетентных
органов, гипертрофией надпочечников, появлением язвенных повреждений желудка. Как следует из данных, приведенных в таблице 1, профилактическое введение растительного средства "пента-фитон" на фоне 12-часовой иммобилизации оказывало антистрессорное действие, о чем свидетельствует уменьшение выраженности признаков стресс-реакции: масса надпочечников у крыс
опытной группы была на 28% меньше, а масса тимуса и селезенки соответственно на 16% и 25% больше по сравнению с аналогичными показателями животных контрольной группы. Наряду с этим, превентивное введение испытуемого средства уменьшало степень катаболических изменений стенки желудка белых крыс, задерживая развитие глубоких деструкций (табл.2.). Так, у опыт-
ных животных число эрозий встречалось лишь в 50% случаев при 100% поражении в контроле. Соответственно, индекс Паулса для эрозий у животных, принимавших испытуемое средство, был меньше, чем таковой у крыс контрольной группы и составил 0,5 против 1,0 в контроле. При этом у крыс, получавших испытуемое средство, не наблюдалось образования полосовидных язв, тогда как у животных контрольной группы в 100% случаев отмечалось появление такого глубокого поражения как полосовидные язвы. При этом эффективность испытуемого средства несколько превосходила таковую у препарата сравнения.
Данные, приведенные в таблице 3, свидетельствуют, что иммобилизация продолжительностью 12 часов вызывает у крыс контрольной группы повышение концентрации ТБК-активных продуктов в 2 раза и значительное снижение активности ферментов антиоксидантной защиты: супероксид-дисмутазы. на 78% и каталазы на 30% по сравнению с аналогичными данными интактных животных. Превентивное введение испытуемого средства оказывало антиоксидантное действие, о чем свидетельствует снижение концентрации ТБК-ак-тивных продуктов на 26% по сравнению с контролем, увеличение содержания восстановленного глутатиона в сыворотке крови, а также повышение активности каталазы и супероксиддисмутазы соответственно на 20% и 50% по сравнению с ана-
Таблица 2.
Влияние "пентафитона " на выраженность язвенных повреждений слизистой оболочки желудка г белых крыс на фоне 12-часового иммобилизационного стресса
Показатели Группы животных
Интактная Контрольная (стресс+Н;0) Опытная 1 (стресс+пентафитон) Опытная 2 (стресс+элеутерококк)
55 з- о и а К© н & % поражения животных 0 42,0 50,0 83,0
Среднее число деструкций на 1 животное 0 2,0 1,0 1,5
Индекс Паулса 0 0,84 1.0 1.2
Б &1 дп % поражения животных 0 100 50,0 50,0
Среднее число деструкций на 1 животное 0 1,0 1,0 1,0
Индекс Паулса 0 1,0 0,5 0,5
Полос язвы % поражения животных 0 100,0 0 0
Среднее число деструкций на 1 животное 0 1,6 0 0
Индекс Паулса 0 . 1,6 0 0
Влияние "пентафитона " на концентрацию ТБК-активных продуктов и показатели антиоксидантной системы белых крыс на фоне 12-часового иммобилтационного стресса
Показатели Средние величины показателей в руппах животных
Интактная (и=6) Контрольная (стресс) (и= Ю) Опытная 1 (стресс+пентафитон) (п=Т0) Опытная 2 (стресс+элеутерококк) (и=10)
ТБК продукты, нмоль/мл 7,4±0,48 14,9±2,38 11,0±0,95* 9,1 ±0,71
Каталаза, мкат/л 1,07+0,11 1,1 ±0,14 1,4±0,02 1,3±0,05
СОД, мкмоль/мл 21,1 + 1,00 4,7+0,52 11,0+0,82* 12,5±0,60
Восстановленный глутатион, мкмоль/мл 354,2+25,81 248,8±29,03 280,6±1 8,55 318,4±22,71
логичными показателями животных контрольной группы. При этом антноксндантная активность испытуемого средства была аналогичной таковой у препарата сравнения.
Полученные данные о наличии у "иентафито-на" антиоксидантной активности были подтверждены в серии экспериментов in vitro (табл.4,5).
Таблица 4.
Влияние "пентафитона " на Fe1' -индуцированную
хемилюминесценцию суспензии липосом
Условия опыта Разведения пентафитона Показатели
I б.в., мм (п=5) 8, усл.ед. (п=5)
Контроль 2,5±0,02 2,77±0,25
Пентафитон 1:0 1,7±0,01*
- ■ - 1:2 1,6±0,01*
1:5 2,0±0,01* 0,75±0,03*
а 1:10 2,1 ±0,01 * 1,2±0,10*
1:50 2,60+0,02 2,3±0,22
Как следует нз приведенной таблицы 4, испытуемое средство в указанных разведениях оказывает выраженное ингибирующее влияние на кинетику Ре ''-индуцированной хемилюминесценции суспензии лнпосом яичного желтка, о чем свидетельствует уменьшение амплитуды "быстрой вспышки", а также снижение скорости хемилюминесценции на начальной экспоненциальной стадии "быстрой вспышки". При этом выявлен дозозависимый эффект: при увеличении разведения испытуемого средства его ингибирующее действие снижалось. Так, введение в инкубационную среду не разведенного средства уменьшало интенсивность "быстрой вспышки" более, чем в два раза по сравнению с данными контрольных проб, нарастания "медленной вспышки" не отмечалось. Введение данного средства при разведении 1:2 оказывало аналогичный ингибирующий эффект. При использовании данного средства в разведениях 1:5 и 1:10 обнаруживалось достоверное снижение интенсивности "быстрой вспышки", а также снижение скорости нарастания "медленной вспышки". При более сильном разведении (1:50) испытуемое средство не оказывало влияния на параметры индуцированной хемилюминесценции липо-протеидов яичного желтка. Полученные данные свидетельствуют, что механизм антиоксидантного
действия указанного средства, наряду с активацией антиокислительной системы организма, связан также с наличием прямого антирадикального действия.
Известно, что активация свободнорадикальных процессов сопровождается нарушениями структурной организации и функциональной состоятельности клеточных мембран, в связи с чем, в следующей серии экспериментов была исследована мембраностабилизирующая активность "пентафитона".
Как известно, реагент Фентона, содержащий в своем составе перекись водорода и ионы железа, индуцирует свободнорадикальные процессы, ведущие к деструкции клеточных мембран. В частности, установлено, что добавление реагента Фентона к 1% суспензии эритроцитов донорской крови вызывало перекисный гемолиз (табл.5 Введение испытуемого средства в инкубационную среду, содержащую реактив Фентона, сопровождалось уменьшением выраженности перекисного гемолиза эритроцитов в среднем на 40% по сравнению с показателями контрольных проб. При этом испытуемое средство не оказывало существенного влияния на осмотический гемолиз эритроцитов. Полученные данные дают основание полагать, что механизм его мембраностабилизирующего действия связан с ингибированием процессов свободнорадикального окисления, Поскольку свободные радикалы, образующиеся в реакции Фентона, индуцируют перекисное окисление липидов в клеточных мембранах и приводят к гемолизу эритроцитов.
Таблица 5.
Влияние "пентафитона " на перекисный и осмотический гемолиз эритроцитов
Условия опыта Средние величины показателей
Перекисный гемолиз, % Осмотический гемолиз, %
Контроль(п=6) 0,86±0,015 0,62±0,04
Пентафитон(п=6) 0,51+0,013* 0,54±0,05
Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что превентивное введение "пентафитона" в объеме 3,0 мл/кг на фоне 12-часового иммобилиза-ционного стресса оказывает стресс-лимитирующее действие, предупреждая чрезмерную активацию стрессорной реакции. Установлено, что аитистрес-сорная активность испытуемого средства обуслов-
лена ограничением свободнораднкальных процессов, нндукцня которых при стрессе является ведущим патогенетическим механизмом перехода физиологической адаптации в ее патологическое звено н развития стрессорных повреждений [3,4,7]. При этом антиоксидантная активность испытуемого средства обусловлена, как ингибированием процессов иерекисного окисления липидов, так и повышением мощности эндогенной антиокислительной системы организма. Ограничение чрезмерной активации свободнорадикальных процессов под влиянием "пентафитона" обеспечивается входящими в его состав соединениями фенольной природы, обладающими, как известно, прямым радикалперехваты-ваюпшм действием [1,15], что было подтверждено полученными нами данными об ингибировании индуцированной хемилюминесценции. В основе ан-тирадикального действия фенольных соединений "пентафитона" очевидно, лежит непосредственно реакция ингибитора с образующимися свободными радикалами, поскольку для молекулярной структуры флавоноидных соединений, как и для классических антиоксидантов типа а-токоферола, характерно наличие ароматических колец с ОН-группами, являющихся акцепторами электронов [2,11]. Вместе с
тем нельзя исключить, что в реализацию антиради-кального действия "пентафитона" определенный вклад вносит и хелатирующая способность фенольных соединений, образующих комплексы с металлами переменной валентности и тем самым предотвращающих развитие свободнорадикальных процессов [13]. Кроме этого, биологически активные соединения, входящие в состав испытуемого средства и, прежде всего витамины и некоторые микроэлементы, оказывают опосредованное антиокислитель-ное действие [2,4], выражающееся в способности защищать от окислительной деструкции важнейшие эндогенные соединения, участвующие в антиокси-дантой защите: супероксиддисмутазу, каталазу и тиоловые соединения, способствуя тем самым усилению и пролонгированию их эффекта. Таким образом, "пентафитон", содержащий комплекс фенольных соединений, оказывает прямое радикалперехва-тывающее действие, обеспечивает активацию ферментов антиокислительной зашиты организма и уменьшение расхода эндогенных резервов антиоксидантов, что в конечном итоге ограничивает окислительный стресс, ведущий к нарушению структурной и функциональной состоятельности биологических мембран.
THE MECHANISMS OF ANT IS TRESS OR Y EFFECT OF A PLANT REMEDY "PENT APHYTON" L.N. Shantanova, A,N. Petunova, S,M. Nikolayev, E.A. Alexeyeva (Institute of General and Experimental Biology, Siberian Department of PAS, Ulan-Ude)
The mechanisms of antistressory action of multicomponent vegetable remedy "Pentaphyton" are explained with its antioxidantive activity.
Литература
1. Барабой В.Л., Брехман И.И., Голотин В.Г., Кудряшов К),Б. Перекисное окисление и стресс. - СПб. -1992. - 142 с.
2. Владимиров К).Л. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестник РЛМН. - 1998. - №7. - С.898-902.
3. Дурнев Л.Д., Сазонтова Т.Г., Гусева Н.В. и др. Влияние диоксина и циклофосфана на перекисное окисление липидов и активность супероксиддисму-тазы и каталазы у мышей линии С57В 1/6 и ВЛЬВ/е // Бюлл. ткспер. биол. и мед. - 1996. -№5. - С,528-532.
4. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс. - М., 2001. - 343 с.
5. Клебанов Г.П., Теселкин К).О., Владимиров К).Л. Ингибирование антиокислительной активности плазмы крови азидом натрия // Биофизика. - 1988. -Т.33, №3. - С.5 1 2-5 1 6.
6. Ковалев И.Е., Данилова Н.П., Лндронати С.Л. и др. Влияние тномеланина на гемолиз тритроцитов, вызываемый свободнорадикальными реакциями и другими факторами // Фармакол. и токсикол. -1986. -Jfe4.-C.89-9 1 .
7. Коган Л.Х., Кудрин Л.Н., Коктурский Л.В., Лосев Н.И. Свободнорадикальные перекисные механизмы патогенеза ишемии и инфаркта миокарда и их фармакологическая регуляция // Патол. физиол. и тксперим. терапия. - 1992. - №2. - С.5-15.
8. Королюк М.Л., Иванова Л.И., Майорова И Г. и др. Методы определения активности каталазы // Лабор. дело. - 1988. - №1. - С.16-19.
9. Сергеев П.В., Снегирева Г.В., Гукасов В.М., Гацура В В. Соотношение антиоксидантного и противо-иШёмического тффектов некоторых інсргообеспе-чивающих средств // Бюлл. ікспер. биол. и мед. -1991. -№1 0. -С.381-382.
10. Сергиенко В.И., Бондарева И.Б. Математическая статистика в клинических исследованиях. - М., 2000. - 263 с.
11. Сыров В.Н., Хушбактова З.Л., Гукасов В.М. и др. Антиоксидантная активность некоторых растительных фенольных соединений // Хим.-фарм. журн. - 1987, - Т.XXI, №1. - С.59-62.
12. Темирбулатов Р.Л., Селезнев Е.И. Метод повышения интенсивности свободнорадикального окисления липидсодержащих компонентов крови и его диагностическое значение // Лабор. дело. - 1981. -№4. - С.209-21 1.
13. Чевари С., Чаба И., Секей Й. Роль супероксиддис-мутазы в окислительных процессах клетки и метод определения ее в биологических материалах // Лабор. дело. - 1985. -№11. -С.678-681 .
14. Anderson М.Е. Glutathion: chemical, biochemical and medicinal aspects. Pt.A. - N.Y., 1989. - P.333-405.
