CC BY
140
• 7universum.com
UNIVERSUM:
ХИМИЯ И БИОЛОГИЯ
МЕХАНИЗМ АДАПТАЦИИ СПЕРМАТОЗОИДОВ К ДЕЙСТВИЮ УСЛОВИЙ КРИОКОНСЕРВАЦИИ СПЕРМЫ
Максимюк Анна Васильевна
канд. биол. наук, доцент
Львовского национального медицинского университета им. Д. Галицкого,
Украина, г Львов, E-mail: [email protected]
Воробец Зиновий Дмитриевич
д-р биол. наук, профессор Львовского национального медицинского университета им. Д. Галицкого,
Украина, г. Львов E-mail: vorobets@meduniv. lviv. ua
MECHANISM OF SPERM ADAPTATION TO CRYOPRESERVATION CONDITIONS Maksymjuk Anna
candidate of Biological Sciences, associate Professor Danylo Halytsky Lviv National Medical University, Ukraine, Lviv
Vorobets Zinovij
doctor of Biological Sciences, Professor, Danylo Halytsky Lviv National Medical University, Ukraine, Lviv
АННОТАЦИЯ
Изучили изменения концентрации ионов в системе «среда-клетка» в разных условиях технологии криоконсервации спермы. При деконсервации образцов установили антипортное движение Na+ в клетки, а Ca2+ и K+ из них. Возможно, эти процессы обеспечивают переход сперматозоидов из анабиоза в активное состояние.
Максимюк А.В., Воробец З.Д. Механизм адаптации сперматозоидов к действию условий криоконсервации спермы // Universum: Химия и биология : электрон. научн. журн. 2014. № 7 (7) .
: http://7universum.com/ru/nature/archive/item/1430
ABSTRACT
The subject of research are changes of ions concentration in the “medium-cell” system under the various cryopreservation technologies. During depreservation of samples we observed antiport motion of Na+ inbound the cells and Ca2+, K+ outbound. Supposedly these processes provide transition of sperm from a passive anabiosis state to an active state.
Ключевые слова: сперма, криоконсервация, кальций, калий, натрий, защитная среда.
Keywords: semen, cryopreservation, calcium, potassium, sodium, protective medium.
Вступление. Доказано, что полноценность структуры и функций сперматозоидов зависит от состава, концентрации и отношений в сперме неорганических и органических соединений [2, с. 83; 3, с. 91; 4, с. 46; 5, с. 82]. Важное место среди этих агентов влияния принадлежит Ca2+, K+, Na+, которые не только принимают активное участие в процессах преобразования одного вида аккумулированной энергии в иную, но и регулируют обмен питательных веществ в клетках и органах. В этой связи эффективность разрешения текущих проблем криобиологической науки существенно зависит от объективности знаний отдельных моментов многогранного процесса адаптации клеток к действию экзогенных факторов.
Однако имеющиеся сегодня результаты выполненных исследований [9, с. 290; 10, с. 111; 11, с. 491] ещё не позволяют создать эффективную модель, постулаты которой в будущем обеспечат максимально возможное сохранение количества полноценных сперматозоидов в сперме. По этому поводу конкретизация и детализация изменений состояния клеток и гомеостаза ионов системы “среда-клетка”, с учётом внедрённых в практику требований существующих технологий криоконсервации спермы (ТКС), имеют важное значение для поиска способов и средств оптимизации их вредного действия.
Поскольку уровень оплодотворяющей способности сперматозоидов зависит от изменений жизнеспособности, состояния их акросомы и цитоплазматической мембраны, гомеостаза Ca2+, K+, Na+, то цель выполненной работы состоит в определении признаков, которые помогут обосновать возможный механизм адаптации клеток к вредному влиянию условий ТКС.
Материал и методы исследований. В свежеполученных, разведенных, эквилибрированных и деконсервированных образцах спермы, методом электронной микроскопии [6, с. 186] определяли особенности изменений акросомы и цитоплазматической мембраны сперматозоидов. Изменения количества живых клеток и их подвижности оценивали методом световой микроскопии [1, с. 25]. В открытых системах («среда-клетка»), методом пламенной фотометрии [7, с. 10], изучали особенности изменения концентрации Ca2+, K+, Na+. Для статистической обработки результатов исследований использовали программу Microsoft Excel.
Результаты исследований. Исследования особенностей влияния экзогенных факторов на состояние структуры сперматозоидов нативной неразбавленной спермы высокого качества свидетельствуют о том, что 81—82 % её половых клеток имеют типичную форму. Поверхность головки таких сперматозоидов четко выделена плотной акросомой; шейки, тела и хвоста — цитоплазматической мембраной (табл. 1, 2).
Абсолютные изменения структуры и функций сперматозоидов
Спермато- зоиды Защитные среды Сперма
неразбав- ленная разбавленная эквилибри- рованная деконсер- вированная
Типичные (М±т, %) НС* 80,81±2,48 — 27,47±3,27 7,42±0,82
НС** 80,81±2,48 — 27,47±3,27 0,00
ВРК 81,67±2,05 72,47±2,45 57,94±2,87 10,91±1,401
ЗСк 80,55±1,69 74,61±2,20 62,17±2,86 35,94±1,06
ЗСо 81,62±1,82 79,64±0,83 68,64±2,65 52,92±1,48
НС* 67,39±0,76 — 22,75±4,01 М
Л , * 1 НС** 67,39±0,76 — 22,75±4,01 М
ВРК 68,61±1,51 51,43±2,32 44,01±3,46 М
ЗСк 67,59±0,87 57,86±2,00 47,61±1,19 30,05±0,72
w ЗСо 68,44±2,46 67,19±1,82 52,39±1,39 41,17±1,50
Подвижные (М±т, бал) НС* 8,52±0,19 — 3,63±0,34 0,00
НС** 8,52±0,19 — 3,63±0,34 0,00
ВРК 8,38±0,27 7,58±0,19 4,73±0,31 К
ЗСк 7,81±0,19 7,28±0,21 4,50±0,34 3,55±0,21
ЗСо 8,11±0,25 7,66±0,25 6,50±0,15 4,07±0,16
Примечание: НС* — неразбавленная сперма, деконсервированная
без цитрата, НС** — деконсервированная в цитрате, ВРК — водные растворы криопротекторов, ЗСк — защитная среда, контроль, ЗСо — защитная среда, опыт. М — мертвые сперматозоиды, К — колебательное движение сперматозоидов.
После разбавления спермы ВРК, а также ЗСк и ЗСо, в зависимости от их действия, число клеток типичной формы составляет 72—80 %. Четырехчасовое выдерживание разбавленной спермы в термостате при 37 оС снижает их количество до 27—67 %, а её деконсервация в 2,8 %-ном растворе натрия цитрата — до 0—53 %. Это свидетельствует о том, что деструктивное влияние криопротекторов на состояние структуры сперматозоидов и каждого предстоящего этапа ТКС относительно предыдущего возрастает.
В этих условиях количество типичных клеток в разбавленной 3 %-ным раствором глицерина сперме снижается на 25 %; в разбавленной 15 %-ной эмульсией желтка, 9 %-ным раствором лактозы и ЗСк — на 7—8 %. Однако следует отметить, что их количество в 6 %-ном растворе гепарина и ЗСо снижается только на 3 %.
Относительные изменения структуры и функций сперматозоидов
Защитные среды Этапы ТКС Защитный эффект ТКС
Разбавление эквилибрация деконсервация
потери типичных клеток (М, %) остаток типичных клеток (М, %)
НС* — 66 25 9
НС** — 66 34 0
ВРК (1—4) 8, 25, 7, 3 4, 10, 39, 19 64, 61, 41, 65 24, 4, 13, 13
ЗСк 7 15 33 45
ЗСо 3 13 19 65
потери живых клеток (М, %) остаток живых клеток (М, %)
НС* — 66 34 М
НС** — 66 34 М
ВРК (1—4) 8, 35, 35,23 9, 7, 14, 13, 83, 48, 58,63 М, 4, М, М
ЗСк 14 15 26 45
ЗСо 2 22 16 60
потери подвижных клеток (М, %) остаток подвижных клеток (М, %)
НС* — 57 43 0
НС** — 57 43 0
ВРК (1—4) 13, 12, 6, 7 26, 38, 42, 25 61, 50, 52, 68 0, К, К, 0
ЗСк 7 36 9 48
ЗСо 6 14 30 50
Примечание: ВРК (1—4): 1 — желток, 2 — глицерин, 3 — лактоза, 4 — гепарин.
Сперматозоиды после этапа эквилибрации претерпевают наибольшие деструктивные изменения. Добавление к сперме в отношении 1: 1 ВРК создаёт условия, в которых потери типичных клеток — наибольшие в среде с лактозой, наименьшие — с желтком. Изменения их структуры в ЗСк и ЗСо соответственно составляют 15 и 13 %.
Условия деконсервации существенно усугубляют процесс деструкции клеток, которая при разбавлении эмульсией желтка, а также растворами глицерина и гепарина определила наибольшие изменения в сперме. Изменениям подвергается 61—65 % клеток. Параметры изменений в неразбавленной и разбавленной сперме раствором лактозы и ЗСк составляют 25—41 %, что в 1,4—2,4 раза меньше, однако в разбавленной ЗСо — 19 %, что в 3,2—3,4 раза меньше.
В этой связи следует обратить внимание на то, что незащищенная и деконсервированная в цитрате сперма не обеспечивает сохранения целостности сперматозоидов. После деконсервации гранул в среде без натрия цитрата, только 9 % клеток не подвергаются деструкции. В сперме, защищенной ВРК, сохраняется до 24 % клеток без видимых изменений. Наименьшее защитное действие характерно для раствора глицерина, среднее — в лактозе и гепарине, наибольшее — в эмульсии желтка. Следует также указать на существенный защитный эффект ЗСк и ЗСо. В этих средах количество клеток типичной формы после деконсервации гранул составляет соответственно 45 и 65 %.
Объективную оценку вредного влияния экзогенных факторов на сперматозоиды невозможно получить без изучения особенностей изменения их функционального состояния. Поэтому анализ изменений структуры дополняем анализом динамики потерь живых и подвижных клеток (табл. 1).
Установленные на этапах ТКС показатели их абсолютных изменений свидетельствуют о том, что лимит потерь количества живых сперматозоидов в неразбавленной сперме — высший, чем в разбавленной, а в разбавленной — больший, чем в эквилибрированной. Специфическое комплексное действие криопротекторов обусловливает характер изменений сперматозоидов деконсервированной спермы и выживание клеток. Если в неразбавленной и разбавленной растворами лактозы, гепарина и эмульсией желтка сперме не выживают сперматозоиды, то 3 %-ный раствор глицерина, ЗСк и ЗСо — сохраняют их жизнь.
Наименьшее вредное влияние на жизнеспособность сперматозоидов определили после разбавления спермы эмульсией желтка. Действие её составляющих только на 8 % уменьшает число живых клеток в сперме. В растворе гепарина этот показатель возрастает до 23%; глицерина и лактозы — до 35 %. Защитное влияние ЗСк и ЗСо на сперматозоиды различное. Если потери количества живых клеток в контрольной ЗС составляют 14 %, то в опытной — 2 %, что в 7 раз меньше. Потери живых сперматозоидов после
эквилибрации неразбавленной спермы существенные и составляют 66 %, разбавленной ВРК — 7—14 %, а разбавленной ЗСк и ЗСо — 15 и 22 %. После деконсервации гранул неразбавленной и разбавленной спермы эмульсией желтка, растворами лактозы и гепарина не выживает 34—83 % клеток. В то же время при использовании раствора глицерина, только 4 % сперматозоидов сохраняют жизнь (табл. 2). В этих обстоятельствах защитное действие составляющих ЗСк и ЗСо обеспечивает выживание 45 и 60 % клеток, что в 11 и 15 раз больше, чем у 3 %-ном растворе глицерина.
Способность сперматозоидов сохранять вне организма прямолинейное поступательное движение является базовым признаком их полноценности. Поэтому динамику изменений подвижности сперматозоидов анализируем при действии условий каждого отдельно взятого этапа ТКС (табл. 1).
Установленные абсолютные параметры изменений лимитов подвижности сперматозоидов неразбавленной, разбавленной, эквилибрированной и деконсервированной спермы составляют: 8—9, 7—8, 4—7 и 0—4 балла. Их максимальное различие для неразбавленной и разбавленной спермы определили в растворе глицерина и эмульсии желтка. В растворах лактозы, гепарина, ЗСк и ЗСо лимит изменений составляет 6—8 % её первичных значений.
После эквилибрации спермы подвижность клеток уменьшается на 2—5 балла. При этом минимальные 32 % изменения подвижности определили для действия раствора гепарина и ЗСо (20 %). При действии других защитных средств потери значительные и составляют 48—57 % уровня свежеполученной неразбавленной спермы.
После деконсервации гранул неразбавленной и разбавленной спермы эмульсией желтка, а также раствором гепарина сперматозоиды теряют способность к движению. Однако в разбавленной растворами глицерина и лактозы сохраняют колебательное движение. Суммарное, комплексное защитное действие составляющих ЗСк и ЗСо приводит к тому, что 48 и 50 % деконсервированных сперматозоидов имеют подвижность 3,6—4,1 балла.
Поскольку изменения структуры сперматозоидов и их функций инициируют дисбаланс равновесия ионов в системе «среда-клетка», то базовым заданием работы было изучение особенностей механизма адаптации клеток к действию условий этапов ТКС (табл. 3).
Таблица 3.
Реакция сперматозоидов на действие экзогенных факторов
Этапы ТКС Защитные среды пособы движения ионов Перемещённое количество (М, ±%)
разбавление НС* использованный метод не позволяет определить
Н с**
ВРК 2, 3, 4 Симпорт -29, 53, 52 -28, 26, 25 -42, 52, 48
1 Антипорт +21 -4 -17
ЗСк +23 -22 -36
о о З +11 -21 -40
эквилибрация НС* Симпорт -2 -8 -3
Н С** -2 -8 -3
ВРК 1, 3, 4 -7, 3, 4 -30, 4, 7 -6, 1, 3
2 Антипорт -23 -1 +10
ЗСк Симпорт -9 -1 -1
о о З -10 -3 -2
деконсервация НС* Симпорт +42 +12 +35
НС** Антипорт -37 -71 +78
ВРК (1—4) -40, 25, 21, 22 -1, 23, 36, 26 +229, 91, 102, 142
к о З -60 -48 +99
о о З -59 -54 +123
ТКС (Е условий) НС* Симпорт +40 +4 +32
НС** Антипорт -39 -79 +75
ВРК (1—4) -26, 77, 77, 88 -35, 52, 64, 58 +206, 59, 49, 91
к о З -46 -71 +62
о о З -58 -88 +81
Примечание: (+) — количество перемещённых ионов из среды в клетку, (—) — из клетки в среду.
После разбавления спермы растворами глицерина, лактозы, гепарина, за исключением суспензии желтка (антипортное движение Са2+ в сперматозоиды относительно К+ и №+ из них), обнаружили симпортное движение Са2+, К+, №+ из клеток в окружающую их среду. Реакция сперматозоидов на действие ЗСк и ЗСо приблизительно такая же. В системе «среда-клетка» происходит антипортное движение Са2+ в сперматозоиды
относительно К+ и Na+ из них. Это значит, что осмотическое давление составляющих ЗСк перемещает в клетки Са2+, количество которого в 2 раза больше, чем в ЗСо, однако перемещённого в среду K+ и Na+ почти одинаковое.
Реакция сперматозоидов разбавленной спермы на действие условий эквилибрации такая же. Обнаруженное незначительное отличие их ответа связано с количеством перемещённых ионов. Если из клеток в среду (ВРК, ЗСк, ЗСо) симпортным способом перемещается -2 — -10 % Ca2+, K+ и Na+, то количество перемещённого в эмульсию желтка, К+ возрастает до 30 %. Исключением из правила следует считать действие раствора глицерина, который инициирует антипортное движение Na+ в клетки относительно Ca2+ и K+ из них.
Этап деконсервации гранул имеет особенный признак, суть которого в том, что в зависимости от свойств компонентов ЗС, перемещённый в сперматозоиды антипортным способом Na+ вытесняет из них Ca2+ и K+. Следует отметить, что реакция клеток деконсервированных гранул НС* иная.
| Л |
Симпортный способ перемещения ионов увеличивает содержимое Na , Ca и K+ в сперматозоидах. Это значит, что вредное действие дисбаланса ионов неорганических и молекул органических соединений на состояние структуры и функций сперматозоидов можно оптимизировать корректированием внедрённых в производство требований к условиям ТКС.
Выводы:
1. Г омеостаз Ca2+, K+ и Na+ в сперматозоидах свежеполученной спермы высокого качества (81—82 % клеток типичной формы, 67—70 % живых с подвижностью 8—9 баллов) контролирует концентрация макроэлементов, лимиты которой составляют 2—3, 7—9 и 14—22 мМ соответственно.
2. Реакцию сперматозоидов на действие водных растворов глицерина, лактозы, гепарина, за исключением суспензии желтка (антипортное движение Са2+ в клетку, относительно K+ и Na+ из нее), представляет симпортное движение Ca2+, K+, Na+ из клеток в среду. Действие на клетки разбавителей спермы аналогичное, однако при действии контрольной ЗС, перемещённое
количество Са2+ в клетки в 2 раза больше, чем при действии опытной, а K+ и Na+ — почти одинаковое.
3. Образованный после разбавления спермы дисбаланс ионов, за исключением раствора глицерина (антипортное движение Na+ в клетки, относительно Ca2+ и K+ из них), нормализирует симпортное перемещение Ca2+, K+, Na+ из клеток в окружающую их среду. Условия этапа эквилибрации спермы уменьшают количество клеток типичной формы до 27—72, живых — до 23—52 %, подвижность — до 4—7 баллов.
4. Реакцию сперматозоидов на деконсервацию гранул спермы без натрия
цитрата представляет симпортный способ перемещения Ca2+, K+, Na+ в клетки. Их реакция в растворе натрия цитрата иная. Антипортное перемещение Na+ (+7S — +229%) в сперматозоиды, в зависимости от действия составляющих ВРК и ЗС, вытесняет из клеток Ca2+ (-21----60%) и K+ (-1------71%).
5. Выравнивание гомеостаза концентраций Ca2+, K+, Na+, нарушенного действием условий этапов ТКС, обеспечивают симпортный и антипортный способы перемещения ионов. В момент деконсервации гранул антипортное движение Na+ в клетки, относительно Ca2+ и K+ в среду, инициирует переход сперматозоидов из состояния анабиоза в их активное движение.
Список литературы:
1. Буркат В.П. Технологія одержання сперми і способи оцінки життєздатності сперматозоїдів: метод. розробка. — Львів: Оброшино, 200б. — 42 с.
2. Максимюк Г.В. Віковий аспект співвідношень концентрацій Ca2+, K+, Na+ спермальної плазми і сперматозоїдів // Вісник проблем біології і медицини. 2013. — № 2 (100). — с. S3—SS.
3. Максимюк Г.В. Вміст і співвідношення Ca2+, K+, Na+ у тканинах Organa genitalia scrotum bovina //Studia Biologica. — 2010. —. Т. 4. — № 2. — с. 91—9б.
4. Максимюк Г.В. Співвідношення концентрацій Ca2+, K+, Na+ і високомолекулярних насичених неетерифікованих форм жирних кислот між спермальною плазмою і сперматозоїдами //Медична хімія. — 2007. — Т. 9. — № 3. — с. 46—49.
5. Максимюк Г.В., Воробець Д.З. Деякі аспекти взаємозв’язку концентрації сперматозоїдів в еякулятах із концентрацією Ca2+, K+, Na+ у тканинах статевих органів і спермі //Вісник Дніпропетровського університету. Сер.: Біологія. Медицина. 2011. —Вип. 2. — Т. 1. — с. 81—87.
6. Максимюк Г.В., Воробець Д.З. Стандартизована методика визначення ступеня поліморфізму і деструкції сперматозоїдів у нативній та кріоконсервованій спермі //Вісник проблем біології і медицини. — 2011. — № 4 (90) . — с. 186—190.
7. Максимюк Г.В., Максим’юк В.М. Стандартизована методика визначення концентрації і переміщеної кількості Ca2+, K+, Na+ у системі «клітина-середовище» //Фізика живого. — 2011. — Т. 19. — № 1. — с. 10—15.
8. Плохинский Н.А. Биометрия. — М.: МГУ, 1970. — 367 с.
9. Mortimer S.T., Chis W.M. Maxwell Effect of medium on the kinematics of frozen-thawed ram spermatozoa //Reproduction. — 2004. — V. 127. — P. 285—291.
10. Sancho S., Casas I., Ekwall H. and all. Effects of cryopreservation on semen quality and the expression of sperm membrane hexose transporters in the spermatozoa of Iberian pigs //Society for Reproduction and Fertility. — 2007. — V. 134. — P. 111—121.
11. Watson P.F. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen //Animal reproduction science. —2000. —V. 60. — P. 481—492.
