CC BY
14ISSNÜ868-5886
НАУЧНОЕ ПРИБОРОСТРОЕНИЕ, 2ÜÜ4, том 14, № 1, c. 18-32
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК543.51: 547
© А. В. Новиков, Н. В. Савельева, А. Н. Симанкова,
Н. В. Краснов, О. А. Миргородская
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭНЗИМАТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ НА ПРИМЕРЕ АСПАРТАТНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ ИЗ ТЯІСНООЕЯМЛ УІЯЮЕ
Продемонстрирована возможность использования масс-спектрометрии для определения специфических сайтов разрывов в пептидных и белковых субстратах, а также для определения количественных характеристик гидролиза для аспартатной протеиназы из Тпскоёвгша утёв. Изучена зависимость от рН. Определены кинетические параметры для отдельных наиболее быстро гидролизуемых связей. Показано, что результаты, полученные с помощью масс-спектрометрии, совпадают с данными, полученными с использованием ВЭЖХ.
ВВЕДЕНИЕ
Протеолитические ферменты (протеиназы) широко представлены в природе, и к настоящему времени выявлено несколько тысяч их представителей. Эти ферменты играют важную роль в регуляции основных физиологических процессов как в норме, так и при патологии. Кроме того, они используются в качестве катализаторов в технологических процессах, а также в структурных исследованиях белков.
Наиболее важным свойством этого класса ферментов является их специфичность, которая прежде всего определяет их участие в реакциях ограниченного протеолиза, которые инициируют появление из предшественников новых биологически активных соединений. Кроме того, протеиназы участвуют в деградации пептидов и белков. Таким образом, в комплексе протеиназы регулируют содержание пептидов и белков в биологических жидкостях на требуемом уровне в процессе функционирования наиболее важных физиологических процессов.
Как правило, изучение специфичности протеи-наз осуществляется при гидролизе достаточно коротких пептидов или даже соответствующих эфиров аминокислот. Выбор субстратов проводится таким образом, чтобы в них разрывалось ограниченное количество связей, поскольку идентификация образующихся продуктов вызывает некоторые затруднения. При использовании более сложных субстратов, в которых осуществляется гидролиз нескольких пептидных связей, специфичность изучалась только для продуктов исчерпывающего гидролиза. Это обусловлено тем, что наличие более чем одного сайта расщепления на начальных стадиях гидролиза приводит к образованию большого ко-
личества промежуточных продуктов, подвергающихся дальнейшим превращениям. Очевидно, что даже определять состав продуктов в таких смесях затруднительно. А тем более сложно контролировать их текущие концентрации в гидролизатах.
Отметим, что появление таких масс-
спектрометрических методов, как Б81-М8
и МЛЬБ1-М8, в сочетании с ВЭЖХ положило начало изучению специфичности протеиназ на пептидных субстратах, в которых возможны несколько сайтов разрывов [1, 2].
В настоящей работе подобные исследования, включая использование в качестве субстратов не только пептидов, но и белков, были продолжены изучением специфичности карбоксильной про-теиназы из Тпскоёвгта утёв (Ту-протеиназы). Интерес к изучению специфичности именно карбоксильных протеиназ в последнее время значительно возрос, т. к. имеется довольно мало данных
о специфичности гидролиза отдельных амидных связей в олиго- и полипептидных субстратах. Причем необходимо учесть, что именно они являются их природными субстратами.
Новизной этой работы является то, что для изучения специфичности масс-спектрометрия была использована не только для идентификации продуктов гидролиза, но и для количественных измерений концентраций отдельных пептидов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Ранее в работе [1] нашей группой было исследовано действие протеиназы из Тпскоёвгта утёв (Ту-протеиназы) на такие субстраты, как мелиттин (М 2846) и инсулин свиньи (М 5778). Были обнаружены некоторые отличия по специфичности
действия и скоростям гидролиза наиболее быстро разрываемых связей в сравнении с более хорошо изученными пепсином и гастриксином. В частности, было показано, что Tv-протеиназа способна разрывать связи вблизи основной аминокислоты (например, при гидролизе мелиттина по связи Lys-Val), что характерно и для других аспартатных протеиназ из аналогичных источников [1, 2].
1. Изучение специфичности аспартатной протеиназы из Trichoderma viride в отношении гидролиза синтетического пептида сурфагона
Работы по изучению этого фермента были продолжены на примере гидролиза другого субстрата — сурфагона (SPN), являющегося синтетическим аналогом гормона люлиберина (гонадолиберина), регулирующего секрецию как лютеинизирующего, так и фолликулостимулирующего гормонов передней доли гипофиза [3] и имеющего следующую структуру:
Pglu-His-Trp-Ser-Tyr-dAla-Leu-Arg-Pro(NH-Et).
Отличительной особенностью этого биологически активного субстрата является наличие в его последовательности остатка dAla. Ранее нами было показано [2], что гидролиз сурфагона гастрик-сином идет именно вблизи этого остатка по связи Tyr-dAla наряду с гидролизом связей His-Trp и Trp-Ser. Напомним, что в отличие от гастриксина пепсин не гидролизует связь Tyr-dAla, а преимущественно гидролизует связь Trp-Ser. Предстояло прежде всего выяснить, какова специфичность протеиназы из Trichoderma viride в отношении гидролиза сурфагона.
Определение сайтов расщепления в сурфагоне под действием протеиназы из Trichoderma viride
Первые эксперименты показали, что этот субстрат гидролизуется Tv-протеиназой как при рН 3.0 (рис. 1, а), так и при рН 6.5 (рис. 1, б). Причем одинаковая (максимальная) скорость убыли SРN (пик 5, рис. 1, а, б) достигается примерно в 10 раз быстрее при рН 6.5 (30 мин) против рН 3.0 (5 ч).
Масс-спектрометрический анализ выделенных фракций позволил определить продукты гидролиза (табл. 1) и соответственно выявить места разрывов.
Из полученных данных следует, что при рН, близких к нейтральным, наблюдаются преимущественно продукты — результат гидролиза ферментом связей Arg-Pro и His-Trp (рис. 1, б; табл. 1). А в области значений рН, типичных для подобных протеиназ [5] (рис. 1, а; табл. 1), наблюдается еще
Рис. 1. Хроматограмма смеси продуктов расщепления сурфагона грибной протеина-зой при pH 3.0 за 300 минут (а) и при pH 6.5 за 30 минут (б) при 37°С
Табл. 1. Продукты гидролиза сурфагона протеиназой из Тпскоёвгша утёв
Номер пика Масс-спектрометрические данные, ш/г* * ММ продуктов, Ба Продукты
Измерено Рассчитано
1 733.2 732.2 732.4 БРК-(4-9)
2 453.0 452.0 452.2 вРК-(1-3)
3 795.2 794.2 794.4 БРК-(3-8)
4 1043.4 1042.4 1042.5 вРК-(1-8)
5 919.3 918.3 918.4 БРК-(3-9)
6 1167.5 1166.5 1166.4 8РК
Приведены значения моноизотопных масс.
а
б
Рис. 2. Е81-М8 спектры реакционных смесей, полученных при гидролизе 8РМ грибной протеиназой в течение 48 ч при pH 3.0 (а) и при pH 6.0 (б) соответственно.
* — положительно заряженные ионы, регистрируемые в виде М+№
один разрыв по связи Trp-Ser со скоростью, примерно в 2 раза меньшей, чем скорость гидролиза по связи Arg-Pro. Следует отметить, что, как показали результаты масс-спектрометрического анализа гидролизатов SPN (рис. 2, а и б), при увеличении времени гидролиза до 48 ч как при рН 6.0, так и при рН 3.0 в конечном итоге наблюдается появление продуктов, соответствующих одинаковым разрывам связей: Arg-Pro, His-Trp, Trp-Ser и Ser-Tyr. Таким образом, в зависимости от условий проведения гидролиза различие в специфичности для Tv-протеиназы проявляется главным образом на начальных скоростях гидролиза. В результате этого фермент может принимать участие в реакциях ограниченного протеолиза.
Определение рН-оптимума гидролиза SPN под действием Tv-протеиназы
Выявленная зависимость состава продуктов и скоростей их образования при гидролизе SPN была подробно исследована в диапазоне pH 1-9. Результаты экспериментов представлены на рис. 3. Из полученных данных следует, что гидролиз наиболее быстро разрываемой связи Arg-Pro имеет максимум в области рН 5.2-5.6. Образование же продуктов гидролиза в результате разрыва связи Trp-Ser наблюдалось только для двух рассмотренных значений рН 3.0 и 4.0 с максимумом при рН 3.0. Отметим, что скорость гидролиза связи Trp-Ser составляла всего 1 % от скорости гидролиза по связи Arg-Pro в рН-оптимуме (данные на рис.3 не приведены).
Полученные данные отличаются от картины рН-зависимости гидролиза SPN протеиназами желудочного сока человека [4], где основными были разрывы по связям Trp-Ser и dAla-Leu. При этом для первой разрываемой связи максимальная скорость наблюдалась при рН 4.7, гидролиз же второй связи не зависел от рН. Сравнение действия всех трех ферментов показывает, что скорости гидролиза связи Trp-Ser в сурфагоне при рН 3.0 пепсином А и гастриксином выше приблизительно в 60100 раз, чем в случае Tv-протеиназы.
Кинетические исследования гидролиза SPN Tv-протеиназой
Сравнительная оценка способности данной Tv-протеиназы к гидролизу отдельных связей и исследование последовательности гидролиза могут быть проведены только на основании кинетических данных. Для их получения на разных степенях гидролиза SPN Tv-протеиназой отбирались аликвоты, реакция останавливалась кипячением. Концентрации исходного субстрата и основных продуктов его гидролиза прежде всего определялись из хроматографических данных с учетом соответствующих площадей хроматографических
Рис. 3. рН-зависимость скорости гидролиза сурфа-гона (1) грибной протеиназой по связям His-Trp (2) и Arg-Pro (3). Скорость выражена в процентах от максимальной начальной скорости при рН 5.0-5.2
Время реакции, мин
Рис. 4. Кинетические кривые гидролиза 8РМ грибной протеиназой. Условия гидролиза: начальные концентрации 8РМ и протеиназы 850 мкМ и 14 мкМ соответственно; 0.02 М аце-тат-аммонийный буфер; рН 5.0 и 37оС. 1 — 8Р1Ч; 2 — 8РМ-(3-9); 3 — 8РМ-(1-8); 4 — 8РМ-(3-8).
В случаях 3 и 4 концентрация определялась с использованием МЛЬБ1-М8
пиков и коэффициентов экстинкций, рассчитанных по аддитивной схеме с учетом поглощения при выбранной длине волны для пептидных связей и отдельных аминокислот. Результаты одного из экспериментов представлены на рис. 4, рН взято
в значениях, близких к оптимальным. Из серии подобных экспериментов были определены зависимости начальных скоростей гидролиза сурфаго-на по связям Arg-Pro и His-Trp от начальных концентраций субстрата. Полученные значения начальных скоростей в координатах Лайнуивера— Берка представлены на рис. 5. На основании этих данных вычислены значения каталитических Ккат и Km для первичных разрывов по связям Arg-Pro и His-Trp (табл. 2) и эффективность гидролиза как Ккат / Km. Для сравнения в этой же таблице представлены аналогичные характеристики гидролиза SPN пепсином по наиболее быстро гидролизуемой связи.
Видно, что Tv-протеиназа гидролизует SPN значительно более эффективно, чем пепсин. Причем наиболее быстро протеиназа гидролизует связь Arg-Pro, из чего можно сделать вывод о ее участии в реакциях ограниченного протеолиза.
Использование MALDI-MS для получения количественных характеристик гидролиза SPN протеиназой из Trichoderma viride
Как следует из представленных выше данных, масс-спектрометрия позволяет надежно идентифицировать продукты, образующиеся в результате гидролиза. Причем идентификация продуктов гидролиза может осуществляться как после ВЭЖХ в отдельных фракциях, так и непосредственно в реакционной смеси. Однако все количественные характеристики по оценке скоростей гидролиза были получены исключительно из данных ВЭЖХ. В отличие от спектрофотометрических измерений (при ВЭЖХ) интенсивности отдельных регистрируемых ионов при масс-спектрометрической детекции не отражают реальных соотношений содержания соответствующих им соединений в анализируемой смеси. В значительной мере это обусловлено тем обстоятельством, что в зависимости от аминокислотного состава в пептидах выход ионов может не воспроизводиться, особенно при ис-
1/V, мкМ 1с
1/S, мМ-1
Рис. 5. Зависимость скорости гидролиза SPN грибной протеиназой по связям His-Trp (1) и Arg-Pro (2) от концентрации сурфагона в координатах Лайнуивера—Берка
пользовании МАЬБ1-М8. Вместе с тем известно, что в пептидах соотношения изотопных пиков как природного происхождения с 13С, так и при искусственно введенных стабильных изотопах, например 18О, регистрируются пропорционально их концентрациям. И это позволяет использовать "изотопное разбавление" в сочетании с масс-спектрометрическими методами для количественного определения пептидов и белков [5, 6]. Отметим, что для подобных измерений необходимо иметь изотоп, содержащий стандарты. И такие стандарты для пептидов и белков могут быть получены путем гидролиза подходящими ферментами образца анализируемого соединения с известной концентрацией в присутствии тяжелой воды, обогащенной 18О, как это показано, например, в работе [5].
Табл. 2. Кинетические параметры энзиматического гидролиза SPN при 37 oC
Разрываемая связь Фермент рН Km, мкМ Kкат, с-1 Ккат / Km, M-1/ с-1
His-Trp TV-протеиназа 5.0 30 0.011 370
Arg-Pro 5.0 8 0.012 1500
Trp-Ser Пепсин 3.0 660 0.006 9
В случае гидролиза 8РК ТУ-протеиназой стандарты двух пептидов 8РК-(1-8) и 8РК-(3-8) могут быть получены при гидролизе исходного субстрата в Н218О. Отметим, что для нас наибольший интерес представляет получение стандарта для пептида 8РК-(1-8), поскольку именно измерение его концентраций отражает начальные скорости гидролиза 8РК. Поскольку этот пептид является промежуточным продуктом в процессе гидролиза, необходимо выбрать время, когда его содержание в реакционной среде близко к максимальному, и остановить реакцию, например, кипячением. В табл. 3 приведены результаты масс-
спектрометрической детекции пептидов 8РК-(1-8) и 8РК-(3-8), полученных при гидролизе 8РК в Н218О.
В данном случае, как видно из таблицы, осуществлялось включение только одного атома 18О именно в результате гидролиза, поскольку отсутствовал дополнительный обмен, который осуществлялся при получении стандартов для количественного определения белков. Полученный раствор с 18О изотоп-содержащими пептидами далее был высушен и перерастворен в водном растворе. Концентрации отдельных пептидов, далее исполь-
зуемых в качестве стандартов для количественных измерений, были определены с использованием ВЭЖХ. Аликвоты из этого раствора использовались для определения концентраций в гидролизатах 8РК в пробах, соответствующих определению этих же пептидов в гидролизатах, ранее проанализированных с использованием ВЭЖХ.
В табл. 4 приведен в качестве примера результат масс-спектрометрического измерения пептидов 8РК-(1-8) и 8РК-(3-8) в одной из реакционных смесей, полученных при гидролизе 8РК на 52-й минуте (рис. 4) с использованием в качестве стандартов этих же пептидов с изотопным распределением. Расчет концентраций пептидов проводился аналогично процедуре, описанной в работе [5]. Для расчета были использованы значения 4 моно-изотопных пиков. Для масс-спектрометрической детекции к 1 мкл реакционной смеси (после остановки реакции) добавлялось 10 мкл раствора стандарта с концентрацией пептидов 8РК-(1-8) и 8РК-(3-8) в нем 240 и 86 мкМ соответственно. На мишень для МАЬБ1-М8 наносилось 0.3 мкл смеси образца и стандарта. Для ВЭЖХ использовалось непосредственно 100 мкл реакционной смеси. Таким образом, количество образца, необходимое
Табл. 3. Соотношения изотопов 180 по данным масс-спектрометрических измерений в стандартах для двух пептидов 8РМ после гидролиза Ту-протеиназой в Н218О
Пептид Интенсивности (площади) изотопных пиков Расчетный изотопный состав по 18О (в %)
М М+1 М+2 М+3 М+4 М+5 18О0 18О! 18О2
8Ж-(1-8) 40 25 499 307 100 30 7.5 92.5 0
8Ж-(3-8) 22 10 290 135 37 5 7.0 93.0 0
Табл. 4. Масс-спектрометрическое определение и расчет концентраций пептидов 8РМ-(1-8) и 8РМ-(3-8) в аликвоте из реакционной смеси (на 52-й минуте гидролиза). Исходная концентрация 8РМ в реакционной смеси составляла 856 мкМ
Пептид Содержание стандарта Интенсивности (площади) изотопных пиков Содержание пептида в смеси
в смеси, мкМ МАЬБ!-М8 ВЭЖХ
М М+1 М+2 М+3 мкМ % %
вРК-(1-8) 24 817 464 852 481 26 30 30
БРК-(3-8) 9 1002 470 492 205 21 24.5 25
для МЛЬБ1-М8 и ВЭЖХ, соотносится примерно как 3/1000. Причем с учетом чувствительности современных приборов МЛЬБ1-М8 можно проводить детектирование пептидов в концентрациях, почти на 2 порядка меньших, чем в наших экспериментах. При этом определение может осуществляться без предварительного фракционирования, поскольку селективность гарантируется выбором соответствующих значений m/z исходя из молекулярного веса анализируемого образца.
Полученные с использованием МЛЬБ1-М8 значения концентраций пептидов на 52-й минуте в кинетическом эксперименте совпадают со значениями, полученными ранее с использованием ВЭЖХ. Аналогичным образом с использованием этих же стандартов для пептидов 8РК-(1-8) и 8РК (3-8) с помощью МЛЬБ1-М8 были проанализированы остальные реакционные смеси в этом эксперименте, и полученные значения концентраций, выраженные в % по отношению к исходной концентрации 8РК, приведены на рис. 4. Наблюдается хорошее совпадение при использовании обоих методов — МЛЬБ1-М8 и ВЭЖХ.
Возможность использования масс-спектро-метрии для оценки скоростей гидролиза отдельных субстратов протеиназами по сути открывает возможности измерения большинства энзиматических характеристик любых ферментов (рН-оптимума, термолабильности, кинетических параметров и т.д.). При этом измерение скоростей будет проводиться по накоплению индивидуальных продуктов, концентрация которых может определяться в реакционных смесях без их предварительного разделения. В принципе, возможно с использованием такого подхода определять одновременно содержание в биологических средах протеиназ по начальным скоростям гидролиза специально подобранных индивидуальных субстратов.
2. Изучение активации трипсиногена
и химотрипсиногена аспартатной
протеиназой из Тпскоёвгта
Как уже отмечалось, выявленная способность
к эффективному расщеплению пептидных связей
вблизи основных аминокислот дает основание по-
лагать, что Ту-протеиназа может участвовать в ре-
акциях ограниченного протеолиза. Традиционно
для изучения этого типа реакций для аспартатных
протеиназ в качестве субстрата используется трипсиноген (ТГ) и химотрипсиноген (ХТГ). Как
показано в работе [4], при обработке вышеуказан-
ных субстратов кислыми протеиназами наблюда-
ется образование активного трипсина (Т) и химо-трипсина (ХТ). В настоящее время считается, что
активация тГ (УВВВБК6-17Уо...) заключается
в отщеплении с К-конца гексапептида в результате
разрыва связи Ьу8-11е и образования Т. В случае ХТГ (СаУРЛ10РУЬ8аЬ8Я15-116Уа...) наблюдается расщепление связи Л^15-11е16 с получением ХТ. В обоих случаях разрывается связь именно вблизи основных аминокислот.
Как показали первые эксперименты, протеина-за из Тпскоёвгта утёв действительно способна к образованию активного Т и ХТ при взаимодействии с ТГ и ХТГ. Контроль за этим процессом легко осуществляется традиционным образом — наблюдением активности вновь образующихся ферментов по их воздействию на низкомолекулярные субстраты. Отметим, что непосредственно Ту-протеиназа эти субстраты не гидролизует. Изучение этих процессов может быть дополнено использованием масс-спектрометрических методов, поскольку наряду с активационными процессами можно ожидать и протекания деструктивных процессов, т. к. нельзя исключить возможности гидролиза отличных от ожидаемых при активации сайтов расщепления.
Изучение рН-зависимости активации ТГ и ХТГ Ту-протеиназой
Прежде всего была изучена зависимость скорости активации ТГ и ХТГ Ту-протеиназой в диапазоне рН 2.0-5.2. Контроль за этим процессом проводился измерением активности вновь образующихся ферментов. Как следует из данных, представленных на рис. 1, максимальная скорость активации ТГ Ту-протеиназой наблюдается при рН 3 .25, в случае ХТГ это значение составляет
Активность, %
Рис. 6. рН-зависимости: активации ТГ (1) и ХТГ (2) грибной протеиназой; активности грибной протеиназы после хранения в течение 2 недель при 4 оС (3)
рН 3.8 (рис. 6). Полученные значения лежат в диапазоне рН, несколько сдвинутых в область менее "кислых" значений, характерных для подобных протеиназ. Например, для протеиназ из этой же Тпскоёвгта утёв, а также и Тпскоёвгта lignorum значения рН-оптимумов гидролиза гемоглобина составляют 2.3 и 2.8 соответственно [1]. Возможно, в действительности эти различия обусловлены тем, что гидролиз гемоглобина, использованного в этих экспериментах в качестве субстрата, протекает по многим связям. И выявленный в этом случае рН-оптимум отражает некоторую усредненную характеристику вне зависимости от гидролиза какого-либо типа связи. Полученные нами данные указывают также на то, что если в белках контролировать гидролиз отдельных связей, то рН-оптимум будет лежать в более широкой области значений рН. Таким образом, можно лишь полагать, что при участии подобного типа протеиназ переход от менее специфичного гидролиза к реакциям ограниченного протеолиза может регулироваться выбором подходящих значений рН.
Масс-спектрометрический контроль за активацией ТГ и ХТГ Ту-протеиназой
Образование Т из ТГ было подтверждено с помощью МЛЬБІ-М8 (рис. 7). Наряду с Т, представленным в виде моно- и двузарядных ионов (т/г = = 23294.5 и mlz = 11647.8 соответственно), регистрируется ряд других продуктов, идентифицировать которые на основании масс-спектрометрических данных не удалось. Отметим только, что масс-спектрометрические измерения гидролизата на более ранних стадиях не зарегистрировали каких-либо других продуктов с молекулярными массами между Т и ТГ. Это означает, что по крайней мере связь Ьу86-І1е7 в исходном ТГ гидролизуется быстрее, чем любая из связей в отщепляющемся К-концевом пептиде. Наличие отщепляемого пептида зарегистрировано в этом же спектре в виде иона с Ка+ (т/г = 728.2). Аналогичные по массам продукты зарегистрированы также с помощью Е8І-М8. Фрагмент Е8І-спектра отщепляемого пептида, регистрируемого в данном случае в виде иона с Н+ (т/г = 706.0), представлен на рис. 7, б.
Интенсивность, %
т/г
Рис. 7. МЛЬБІ-масс-спектр (а) и фрагмент Е8І-масс-спектра (б) гидролизата ТГ грибной протеиназой при рН 3.2
В соответствии с обозначениями, принятыми в литературе [6], химотрипсиноген А:
Н^-Суз1- ... -Ьеи13-8ег14-А^15-11е16- ... -Туг146-ТЬг147-А8п148-А1а149- ... -А8п245ОН.
При активации ХТГ возможно образование нескольких форм ХТ:
п-ХТ (ММ 25674.1), разрывы: 15-16;
8-ХТ (ММ 25430.8), разрывы: 13-14, 15-16;
Х-ХТ (ММ 25448.8), разрывы: 13-14, 15-16, 146-147; а-ХТ (ММ 25233.6), разрывы: 13-14, 15-16, 146-147,
148-149.
При этом предполагается, что грибные протеи-назы так же, как трипсин, осуществляют лишь один разрыв связи 15-16. Все последующие превращения происходят автолитически [7].
С помощью масс-спектрометрии нами показано (рис. 8), что под действием Ту-протеиназы наблюдается образование всех последующих за п-ХТ форм, включая а-ХТ (т/г = 25235.5), а также 8-ХТ и Х-ХТ, регистрируемых в виде суммарного пика с т/г = 25240.1. Необходимо отметить, что использованная масс-спектрометрическая техника не позволяет разрешать пики двух близких по массам форм химотрипсина, а именно 8- и Х-ХТ, поскольку их разница в 18 Да оказывается существенно меньшей, чем полуширина регистрируемых пиков.
Анализируя полученные данные (рис. 8), следует отметить, что при рН 4.2 (кривая 2) наблюдается образование форм ХТ от 8 до а, в то время как при рН 5.0 (кривая 3) можно говорить только
о 8- и Х-ХТ. При рН 3.2 (кривая 1) через 48 ч ХТ не регистрируется. Вместе с тем дополнительные
Интенсивность (число имп.)
5000 10000 15000 20000 25000
т/г
Рис. 8. МАЬБ1-масс-спектры гидролизата ХТГ грибной протеиназой (48 ч) при рН 3.2 (1), pH 4.2 (2) и pH 5.0 (3)
Активация, %
Время активации, ч
Рис. 9. Активация ТГ (а) (37 мкМ) и ХТГ (б) (33 мкМ) при 37 оС в 0.05 М ацетат-аммонийном буфере рН 3.25 и 3.8 соответственно в зависимости от концентрации протеиназы:
1 — 2.6, 2 — 0.26, 3 — 0.052, 4 — 2.3, 5 — 0.23 мкМ
эксперименты с использованием Е8І-М8 показали, что формы от 5-ХТ до а-ХТ образуются на начальном этапе (через 5 мин) и исчезают через 90 мин (данные не представлены). Эти результаты показывают, что при рН 3.2 все эти формы подвержены дальнейшему гидролизу Ту-протеиназой. Таким образом, следует констатировать, что в зависимости от выбранного значения рН мы в принципе можем иметь разные продукты гидролиза. Полученные данные также позволяют считать возможным, что при функционировании этих про-теиназ фактор рН среды наряду с другими факторами в значительной степени может определять участие этих ферментов в различных процессах: от достаточно глубокого гидролиза до реакций ограниченного протеолиза. Кроме того, необходимо еще раз подчеркнуть, что зависимость появления различных форм ХТ от рН указывает на участие Ту-протеиназы в реакциях, аналогичных самопре-вращению п-ХТ.
Т, мкМ
ТГ, мкМ
Рис. 10. Зависимость количества трипсина (Т), образовавшегося при активации протеиназой трип-синогена (ТГ), от количества вносимого в реакцию ТГ. Концентрация протеиназы 0.034 мкМ; рН 3.25; 37 оС
Процессы активации ТГ и ХТГ Ту-протеиназой, используемой в различных концентрациях, измеряемые по гидролизу специфических низкомолекулярных субстратов, представлены на рис. 9. Во-первых, из полученных данных видно, что с увеличением концентрации Ту-протеиназы начальные скорости активации возрастают, и легко рассчитать, что начальные скорости активации протеина-зой обоих субстратов в своем рН-оптимуме прямо пропорциональны концентрации фермента. Во-вторых, следует, что при приблизительно равных концентрациях фермента скорость активации ХТГ существенно ниже скорости активации ТГ. Соответственно наблюдаемая при значительных концентрациях фермента инактивация образующихся Т и ХТ оказывается выше в случае ТГ.
Изучение активации Ту-протеиназой ТГ при различных его концентрациях показало, что в рассмотренном интервале (от 1.6 до 52.0 мкМ) максимальное количество образовавшегося активного Т строго пропорционально концентрации вносимого в реакцию ТГ (рис. 10). Абсолютное количество активного Т при активации ТГ в максимуме во всех случаях составляет приблизительно лишь 42 % от исходной концентрации ТГ. Остальное количество ТГ гидролизуется с образованием более низкомолекулярных, чем Т, продуктов — по данным МАЬБ1-М8 (данные не приводятся) и ВЭЖХ (рис. 11). Отметим, что в выбранных условиях проведения ВЭЖХ мы не смогли разделить Т и ТГ. Более того, каждый из этих двух белков всегда был представлен на хроматограмме в виде двух пиков, как это показано на рис. 11, а для ТГ. Возможно, это обусловлено тем, что данные белки склонны к образованию димеров, образующихся или не разрушающихся в процессе хроматографирования. Масс-спектрометрический анализ этих
Относительная концентрация, %
Объем элюции, мл
Рис. 11. Хроматограммы исходного ТГ (а) и продуктов его активации (б) протеиназой из Тпск. утёв через 5 мин (1), 20 мин (2) и 4 ч (3) инкубации. Количество загруженного на колонку вещества составляет 5 мкг (а) и по 18.3 мкг (б) соответственно. Условия реакции см. в подписи к рис. 10
пиков показал, что в каждом из них по мере гидролиза регистрируются либо ТГ, либо Т, либо оба вместе (данные не приводятся).
Распределение на хроматограмме других продуктов зависит от времени гидролиза (рис. 11, б), причем начальная скорость образования активного Т более чем в 2 раза ниже скорости образования низкомолекулярных продуктов (рис. 12). По мере накопления отличных от Т продуктов именно они сами становятся предпочтительными объектами для последующего гидролиза ТУ-протеиназой. В результате вместо ожидаемого из распределения
Рис. 12. Образование активного трипсина (1) и низкомолекулярных продуктов (2) в процессе активации трипсиногена (50.8 мкМ) протеиназой (0.085 мкМ) в условиях 0.045 М ацетат-аммоний-ного буферного раствора с рН 3.25 и 37 оС
начальных скоростей гидролиза количества Т менее 30 % мы наблюдаем образование активного Т в количестве около 42 % от вносимого ТГ.
Относительная стабильность Т в условиях реакции (рис. 12) также указывает на тот факт, что все низкомолекулярные продукты образуются исключительно из ТГ. Учитывая, что аминокислотные последовательности ТГ и Т, за исключением гексапептида, одинаковы, можно предположить, что отщепление этого гексапептида вызывает изменения в конформации образующейся молекулы Т. И именно это делает молекулу Т менее доступной для протеиназы по сравнению с ТГ. Вместе с тем, как показано на рис. 9, а (кривые 1, 2), такое изменение конформации не является достаточным, поскольку при значительном увеличении концентрации протеиназы наблюдается инактивация Т.
Идентифицировать на данном этапе места разрывов в ТГ протеиназой оказалось невозможным вследствие большого числа полученных продуктов гидролиза и трудности соотнесения регистрируемых масс к определенным аминокислотным последовательностям, в том числе из-за наличия дисульфидных связей.
Отметим, что в контрольном эксперименте показано, что инкубация ТГ в аналогичных условиях, но без ТУ-протеиназы не приводит к его гидролизу, включая активацию.
В случае активации ХТГ количество образо -ванного ХТ выше, чем Т в рассмотренном случае, и составляет приблизительно 80 % от исходного
ХТГ. Остальные 20 %, по данным ВЭЖХ, представляют собой низкомолекулярные продукты, образование которых подтверждается с помощью масс-спектрометрии. Места разрывов, как и в случае гидролиза ТГ, не идентифицированы.
Определение кинетических параметров реакции активации ТГ и ХТГ протеиназой проводили при рН 3.25 и 3.8 соответственно. Полагали, что, поскольку образование активных ферментов и других продуктов гидролиза для обоих субстратов на начальных участках гидролиза идет строго параллельно, то в качестве контроля за процессом активации использование начальных скоростей
образования Т или ХТ оказывается достаточно корректным. Полученные данные суммированы в табл. 5.
Из полученных данных прежде всего следует отметить, что скорости активации протеиназой из Trichoderma viride ТГ на порядок превышают таковые для ХТГ, в то время как значения Km сопоставимы. Аналогичный характер зависимости в отношении активации ТГ и ХТГ протеиназой из Aspergillus oryzae описывается в работе [3], хотя сами значения K^ и Km разнятся для этих ферментов.
Табл. 5. Кинетические константы активации трипсиногена и химотрипсиногена некоторыми грибными протеиназами
Источник протеиназы Трипсиноген Химотрипсиноген Откуда данные
pH ^ о Km, мМ c-1 pH о Km, мМ Кка^ c-1
Trichoderma viride 3.25 37 0.014 0.10 3.8 37 0.02 0.019 Наши
Aspergillus oryzae 3.2- 3.6 35 0.10 11.3 3.2- 3.6 35 0.18 1.14 [3]
Penicillium 3.4 0 0.0076 1.10* — — — — [4]
janthinellum 35 11.0* — — — —
Aspergillus 3.5 30 0.0125 0.14 [7]
saitoi 3.0 1 0.023 — — — — [„]
4.4 1 0.015 0.085 4.4 1 0.4 0.00037 5?
Примечание. * — расчет по активности, равной 64 и 660 мкМ трипсиногена/мин/мкМ, фермента для 0 и 35 оС соответственно. На основании нескольких измерений при 20 и 30 оС предполагается, что зависимость Кт от температуры незначительна.
Табл. 6. Сравнительные характеристики протеиназы и пепсина в отношении гидролиза отдельных связей при 37 оС
Фермент рН Субстрат Связь Km, мкМ Kкaт, с-1 Kкaт / Km, (М-с)-1
Протеиназа 2.9 Мелиттин Leu-Thr 15 4.2 280 000
Trich. viride 3.25 ТГ Lys-Ile 14 0.102 7300
3.8 ХТГ Arg-Ile 20 0.019 950
Пепсин А 2.9* Мелиттин Leu-Ile 215 18.1 84 000
В табл. 6 суммированы имеющиеся данные (Ккат и Кт) по гидролизу протеиназой из Trichoderma viride отдельных связей для ряда субстратов, за исключением 8РК (данные по гидролизу отдельных связей в 8РК пепсином и Гу-протеиназой приведены ранее в подразделе 1). Для некоторых из этих субстратов приведены также результаты их гидролиза пепсином. Прежде всего отметим, что с наибольшей эффективностью Гу-протеиназой, а также и пепсином гидролизуются связи, в Р-1-положении которых стоят алифатические аминокислоты, что продемонстрировано на примере мелиттина. Область оптимальных значений гидролиза для протеиназы в этом случае совпадает с рН-оптимумом (~ рН 3) гидролиза традиционного белкового субстрата, такого как гемоглобин. Для гидролиза связей вблизи основных аминокислот значения оптимума рН сдвинуты в область менее кислых значений. При этом сами значения рН оптимума отличаются для разных субстратов. Сравнение эффективностей гидролиза (Ккат / Кт) связи А^-11е в ХТГ и сурфагоне позволяет лишь констатировать тот факт, что они сопоставимы по величине как для белка, так и для нанопептида.
ВЫВОДЫ
В результате проведенных экспериментов получены новые данные об энзиматических свойствах Гу-протеиназы, из которых особо следует отметить:
• явно выраженную зависимость местополо -жения сайтов расщепления от рН даже в одном и том же пептидном субстрате;
• выбор характера гидролиза белковых субстратов (ограниченный протеолиз или деструктивный) для Гу-протеиназы зависит от первоначального сайта расщепления, т. к. в дальнейшем происходит изменение конформации в пептидной цепи и она оказывается устойчивой к последующему гидролизу.
Несомненна перспективность использования масс-спектрометрии не только для идентификации, но и для оценки активности, а следовательно, и количества ферментов. Полученные результаты указывают на возможность в процессе одного масс-спектрометрического измерения определить компонентный состав протеиназ в биологических средах, что невозможно сделать никакими другими методами.
Приложение. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе были использованы следующие ферменты и белки: протеиназа из гриба Trichoderma
viride, выделенная согласно [1], трипсин ("Spofa"), химотрипсин, трипсиноген и химотрипсиноген из поджелудочной железы быка ("Sigma", США). В качестве низкомолекулярных субстратов для определения активности трипсина и химотрипси-ногена использовали Na-тозил-Ь-аргинин-метиловый эфир ("TAME") и N-ацетил-Ь-тирозин-этиловый эфир ("АТЕЕ") соответственно.
В работе использовали дитиотреит, ацетонитрил и трифторуксусную кислоту ("Merk", Германия). Остальные реактивы имели квалификацию
ч.д.а. и "для спектрального анализа".
Определение ферментативной активности
Активность грибной протеиназы тестировали по ее способности активировать трипсиноген или химотрипсиноген до трипсина или химотрипсина соответственно и характеризовали количеством трипсина или химотрипсина в мкМ/мин, образовавшимся в условиях эксперимента.
Трипсинолитическую и химотрипсинолитиче-скую активности определяли титрометрически на спектрофотометре СЕ 2020 (CECIL, Англия). Исследования выполняли при 25 оС в 0.025 М ТрисНСІ буфере с рН 8.1, используя "ТАМЕ" (0.0005 М) в качестве субстрата для трипсина и "АТЕЕ" (0.00056 М) для химотрипсина. Измеряли изменение оптической плотности на длине волны 247 нм и 237 нм за одну минуту соответственно при гидролизе "ТАМЕ" и "АТЕЕ". В качестве раствора сравнения использовали аналогичный раствор субстрата в буфере без фермента. Одну единицу активности приравнивали к гидролизу
1 мкМ субстрата в мин.
Концентрации по белку трипсиногена, химо-трипсиногена и протеиназы из Trich. viride определяли по поглощению на 280 нм с использованием коэффициентов экстинкции Е1% 14.3, 20.4 и 16.0 соответственно. Для расчета молярных концентраций зимогенов брали значения молекулярных масс, равные 24 000, 25 700 и 34 500 соответственно.
Активацию трипсиногена и химотрипсиногена протеиназой из Trich. viride осуществляли при 37 оС в широком интервале концентраций субстрата и фермента в 0.01-0.1 М ацетат-аммоний-ном буфере с рН 3.25 и 3.8 соответственно.
рН-зависимость реакции активации протеиназой трипсиногена и химотрипсиногена осуществляли в интервале рН 2.2-5.2 при исходных концентрациях субстрата и фермента 37 мкМ и 0.07 мкМ в случае трипсиногена и 33 мкМ и 2.3 мкМ в случае химотрипсиногена. Реакцию осуществляли в 0.05 М ацетат-аммонийном (рН 2.2-4.9) и 0.05 М натрий-ацетатном (рН 5.0 и 5.2) буферах при 37 оС. Время активации трипсиногена 2 ч, химотрипсиногена 30 мин.
рН-зависимость реакции гидролиза SPN грибной протеиназой исследовали при исходной концентрации субстрата S50 мкM и мольном соотношении фермент/субстрат 1:60 в 0.0S M уксусной кислоте (рН 3.0), в 0.02 M ацетат-аммонийном буфере (рН 4.0-5.6), в 0.0S M натрий-фосфатном буфере (рН 6.0 и 6.5), в трис'НО (рН 7.0-9.1). Через определенные промежутки времени из реакционной смеси отбирали пробы, реакцию останавливали и полученные смеси анализировали с помощью ВЭЖК и масс-спектрометрически.
Изучение стабильности протеиназы
Протеиназу из Trich. viride инкубировали в концентрации 0.44 мкM в воде и 0.09 M ацетат-аммонийном буфере разных значений рН при 4 °С. Через определенные промежутки времени отбирали пробы и активность протеиназы определяли по способности активировать трипсиноген, при этом в реакционной смеси концентрации трипсиногена и протеиназы составляли 7.0 и 0.044 мкM соответственно. Pеакцию активации осуществляли в 0.1 M ацетат-аммонийном буфере при рН 3.25 и 37 °С. Количество образовавшегося трипсина определяли через 13.5 мин, внося 50 мкл реакционной смеси в раствор "TАMЕ" (см. выше).
Определение кинетических параметров реакции активации протеиназой трипсиногена и химотрипсиногена
Tрипсиноген (1.6-51.2 мкM) или химотрипсиноген (3.3-33.0 мкM) инкубировали в течение 30 мин при 37 oC в 0.045 M ацетат-аммонийном буфере при рН 3.25 или 3.S с протеиназой из Trich. viride, присутствующей в концентрации 0.034 или 0.23 мкM соответственно. Количество образовавшегося трипсина или химотрипсина незамедлительно определяли по гидролизу "TАMЕ" или "АTЕЕ" при рН S.1, что также останавливало реакцию активации. Значения K^ и Km для активации зимогенов протеиназой вычисляли из графика в координатах Лайнуивера—Берка.
ВЭЖК проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе "Mилихром" (ПО "Научпри-бор") в колонке из нержавеющей стали (2 х 62 мм) с сорбентом Proteins C4 (VydacTM, США). Элюцию осуществляли градиентом концентрации ацетонитрила от 10 до 50 % (по объему) в растворе 0.1 % трифторуксусной кислоты со скоростью
0.1 мл/мин. Концентрации исходного субстрата и продуктов его гидролиза оценивали по площадям хроматографических пиков с учетом молярных коэффициентов поглощения, рассчитанных по аддитивной схеме [S].
MALDI масс-спектры снимали на время-пролетном масс-спектрометре Vision 2000 (Thermo Bioanalysis Corp, Англия) в виде положительно за-
ряженных ионов в рефлектомоде. Пробы в объеме 0.3 мкл помещали на мишень с предварительно нанесенной в таком же объеме матрицей. В качестве матрицы использовали 2,5-дигидрокси-бензойную кислоту (DHB, Aldrich).
ESI-MS масс-спектры снимали в виде положительных ионов на приборах Finnigan MAT95 с магнитным секторным масс-анализатором и двойной фокусировкой и на ESI-TOF, изготовленном в лаборатории экологической и биомедицинской масс-спектрометрии, оборудованном электрорас -пылительным источником ионизации (electrospray ionization, ESI) и времяпролетным масс-анализатором (TOF). Скорость подачи пробы
1 мкл/мин. Объем вводимой пробы составлял 20 или 10 мкл соответственно. Реакционные смеси перед измерением разбавляли ацетонитрилом 1:1.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Симанкова А.Н. и др. Грибная аспартатная протеиназа из Trichoderma viride. Специфичность при гидролизе олигопептидов // Биоорган. химия. 1998. Т. 24. С. 822-830.
2. Миргородская О.А. и др. Расщепление желудочным соком человека аналогов люлиберина, содержащих остаток D-аланина // Биоорган. химия. 1997. Т. 23. С. 611-615.
3. Нейроэндокринология / Под ред. чл.-корр. РАН А.Л. Поленова. СПб., 1994. Ч. 2. С. 89106.
4. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука, 1983.
5. Mirgorodskaya O.A. et al. Quantitation of peptides and proteins by matrix-assisted laser 1d8esorption/ionisation mass spectrometry using 18O-labeled internal standards // Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000. V. 14. P. 1226-1232.
6. Новиков А.В. и др. Использование ESI-MS и изотопно меченных аминокислотных стандартов для определения концентрации белков // Научное приборостроение. 2002. T. 12, № 4. C. 70-80.
7. Ichishima E. // Meth. Enzym. 1970. V. 19. P. 397406.
8. Гайда А.В., Остерман А.П., Руденская Г.Н., Степанов В.М. // Биохимия. 1981. Т. 46. С.181-189.
Институт аналитического приборостроения РАН, Санкт-Петербург (Новиков А.В., Краснов Н.В.)
Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург
(Савельева Н.В., Симанкова А.Н., Миргородская О.А.)
Материал поступил в редакцию 8.12.2003.
DETERMINATION OF SPECIFICITY OF PROTEINASE FROM TRICHODERMA VIRIDE BY MASS SPECTROMETRY
A. V. Novikov, N. V. Savelieva*, A. N. Simankova*, N. V. Krasnov, O. A. Mirgorodskaya*
Institute for Analytical Instrumentation RAS, Saint-Petersburg Institute of Cytology RAS, Saint-Petersburg
The possibility of using mass spectrometry to determine specific sites of hydrolysis of peptide and protein sequence was demonstrated. The types of digested bonds, scheme of hydrolysis, kinetic parameters for most easily hydrolyzable bonds were determined. The effect of pH on the initial rates of SPN hydrolysis was appreciated. The agreement of data from mass spectrometry and HPLC was demonstrated.
