Маркёр-ориентированная селекция и примеры ее использования в мировом картофелеводстве Текст научной статьи по специальности «Сельское хозяйство, лесное хозяйство, рыбное хозяйство»

УДК635.21:575.1:575.2

МАРКЁР-ОРИЕНТИРОВАННАЯ СЕЛЕКЦИЯ И ПРИМЕРЫ ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В МИРОВОМ КАРТОФЕЛЕВОДСТВЕ*

Е.К. ХЛЕСТКИНА, доктор биологических наук, профессор РАН, зав. сектором1; главный научный сотрудник Исследовательского центра2 (e-mail:khlest@ bionet.nsc.ru)

В.К. ШУМНЫЙ, доктор биологических наук, академик РАН, советник РАН1; профессор2

Н.А. КОЛЧАНОВ, доктор биологических наук, академик РАН, директор1; зав. кафедрой2

Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук(ИЦиГСО РАН), просп. Лаврентьева, 10, Новосибирск, 630090, Российская Федерация 2Новосибирский национальный исследовательский государственный университет (НГУ), ул. Пирогова, 2, Новосибирск, 630090, Российская Федерация

Резюме. Цель работы - определить с помощью анализа литературных источников, какое место занимают методы маркёр-ориентированной селекции (МОС) в современной селекции растений в нашей стране и за рубежом, а также оценить возможности МОС в картофелеводстве. Изложена краткая история появления маркёр-ориентированной селекции, предшествующие события, способствовавшие ее появлению, и ключевые отличия от предыдущих подходов, обусловившие интенсивное освоение МОС в селекционной практике. Проведенный анализ публикационной активности в рецензируемых журналах, индексируемых в базе данных Scopus, позволил выявить страны-лидеры, а также определить место России в рейтинге публикаций по использованию ДНК-маркёров как в целом в растениеводстве, так и отдельно в картофелеводстве. Страны-лидеры по внедрению МОС в картофелеводстве - США, Нидерланды, Великобритания и Германия. Россия в этом рейтинге на 23-м месте, что выше, чем по использованию МОС в растениеводстве в целом, но ниже, чем в рейтинге по пшенице, в котором Россия занимает 12-е место. Оценена востребованность МОС по разным направлениям селекции картофеля: устойчивость к фитопатогенам и вредителям (на мировом уровне МОС в этой области наиболее востребована), урожайность (на 2-м месте), устойчивость к факторам абиотического стресса (на 3-м месте). Описаны и проиллюстрированы примерами такие достоинства маркёр-ориентированной селекции, как экономическая эффективность, ускорение отбора и возможность направленного создания форм с уникальными комбинациями генов. По оценкам, приведенным в литературе, при селекции картофеля на нематодоустойчиовсть затраты на полевую оценку и ДНК-анализ одного образца соотносятся как 3:1. Использование МОС позволило почти на порядок повысить устойчивость к бледной нематоде в результате направленного объединения в одном генотипе двух генов устойчивости. Также в статье указаны современные направления для разработки новых диагностических ДНК-маркёров, важные для развития отечественной селекции картофеля. Ключевые слова: селекция картофеля, генетика картофеля, устойчивостьк заболеваниям, диагностические ДНК-маркеры, пирамидирование генов

Для цитирования: Хлесткина Е.К., Шумный В.К., Колчанов Н.А. Маркёр-ориентированная селекция и примеры ее использования в мировом картофелеводстве // Достижения науки и техники АПК. 2016. Т.30. №10. С. 5-8.

Классическая (комбинационная) селекция ведет свою историю с XIX века, однако широкое применение ее методов (целенаправленные скрещивания и отбор

лучших форм в полученном потомстве) началось около 100 лет назад. Тогда же стали предпринимать первые попытки облегчить трудоемкий анализ хозяйственно значимых количественных признаков с помощью косе-грегирующих с ними простых свойств [1]. У растений это, например, наследуемые моногенно признаки окраски. Подобные удобные для наблюдений моногенные признаки называют морфологическими маркёрами или классическими генетическими маркёрами [2]. Но таких признаков немного, поэтому широкого распространения метод использования вспомогательных морфологических маркёров не получил.

В конце XX века исследования в области генетики перешли на новый уровень - началось широкое изучение генов и некодирующих локусов геномов на уровне ДНК. Изучаемые локусы были нанесены на карты сцепления, на которых хозяйственно значимые гены оказались плотно окружены некодирующими геномными локусами, полиморфными на уровне ДНК - ДНК-маркерами. Первая молекулярно-генетическая карта картофеля была сконструирована в 1991 г. [3].

С появлением молекулярно-генетических карт растений идея об использовании вспомогательных маркёров в селекции возникла вновь, но на этот раз был предложен их новый тип - ДНК-маркёры. Была обоснована экономическая выгода от использования тесно сцепленных с генами ДНК-маркёров для косвенной оценки (прогнозирования) будущего фенотипа полученных от скрещивания потомков. Обоснованной оказалась и точность предложенного метода [4, 5]. После этого началось активное использование диагностических ДНК-маркёров в селекционных программах - маркёр-ориентированная селекция, МОС (marker-assisted selection). Успешное распространение такого подхода в селекции связано с двумя преимуществами ДНК-маркёров, по сравнению с предыдущими поколениями маркёров (класси ческими/«морфологическими» и белковыми): частая встречаемость ДНК-маркёрных локусов в геноме (а, следовательно, возможность подобрать диагностический маркёр к любому хозяйственно значимому гену) и универсальность методов анализа полиморфизма ДНК (а, значит, возможность использовать в селекции быстро развивающиеся и дешевеющие методы анализа ДНК, разрабатываемые для нужд таких передовых социально значимых областей как медицинская генодиагностика, ДНК-диагностика патогенов человека и др.). Наиболее популярны ПЦР-маркеры - широкий спектр классов ДНК-маркеров, основанных на использовании доступного, надежного и недорого метода -полимеразной цепной реакции [2].

Цель нашей статьи - определить с помощью анализа литературных данных, какое место занимают методы маркёр-ориентированной селекции (МОС) в современной селекции растений в нашей стране и за рубежом, а также оценить возможности МОС в картофелеводстве.

*Статья подготовлена в рамках КЦП РФ «Научное обеспечение деятельности по созданию отечественного посевного фонда, средств защиты растений в целях производства российскими производителями конкурентоспособной сельскохозяйственной продукции...на 2016-2025 гг.» по приоритетному направлению «Картофелеводство» и при поддержке бюджетного проекта 0324-2015-0005.

В последние десятилетия наблюдается бурный рост числа научных публикаций (от единичных статей в год в середине 1980-х гг. до сотен статей в год сегодня [6]), описывающих использование ДНК-маркеров в растениеводстве. Лидеры в этом направлении - США, Китай и Индия. Россия в таком рейтинге (www.scopus.com) занимает лишь 31-е место, однако в изучении отдельных культур, отечественные исследователи достигли гораздо более высоких результатов (например 12-е и 23-е место в рейтингах по использованию ДНК-маркеров на пшенице и картофеле соответственно). Лидеры мирового рейтинга по использованию ДНК-маркёров в картофелеводстве - США, Нидерланды, Великобритания, Германия (см. рисунок, а).

Причина популярности маркёр-ориентированной селекции кроется в ряде преимуществ этого метода. Использование диагностических ДНК-маркёров позволяет сократить срок создания сорта, снизить финансовые затраты, экономить на трудовых и энергетических ресурсах, уменьшить занимаемые в селекционном процессе посевные площади [2]. Например, при проведении маркер-контролируемого беккроссирования пшеницы можно вдвое сократить время создания новой формы и в 70 раз уменьшить занимаемые селекционным материалом площади [7]. Сравнение экономических расходов на анализ диагностических ДНК-маркёров и анализ признаков показывает, что соотношение затрат может сильно разниться (например, при селекции злаков на устойчивость к стеблевой ржав-

400

350

300

250

200

150

100

50

I I I I I I I I I............

<

3

о

-О I

со ^

а

ф

СЕ СЕ СЕ СЕ >s со со и СЕ > СЕ СЕ

S S S со ч 3 s S р S

I I ZS I н со ^ ф I ZS

СО со I о S I со с со ф

н S р ю о 5 р Ф |_ со р © с ее со о 1= S н S с о S m 3

со со а

LO

л

со

I

СЕ ^

I

а)

ф со

СЕ СЕ СЕ

ф S

^ р ^

I о со

со р

^ н

ф со I * о

со СЕ m <

со m Q

о

л

1 1 1

со СЕ СЕ

I S S

S р о

н 1_ о

I I о

ф ф о.

р со

<

>

о

X ф

т

устойчивость к

АБИОТИЧЕСКОМУ СТРЕССУ

Мягкая гниль

7%

УРОЖАЙНОСТЬ

Бледная нематода

9%

Y-вирус 18

222

Золотистая нематода 19%

Галловая нематода

2%

б)

УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОПАТОГЕНАМ И ВРЕДИТЕЛЯМ

X-вирус

7%

S-вирус 4%

PLRV-вирус

2%

Рак 1%

в)

Фитофтороз 31%

0

Рисунок. Маркёр-ориентированная селекция картофеля - мировые лидеры и основные направления: а) вклад исследователей из разных стран в направление использования ДНК-маркеров в картофелеводстве - составлено на основе поиска публикаций в базе данных Scopus (http://scopus.com, дата обращения: 08.08.2016 г.); б) число публикаций, связанных с применением ДНК-маркёров по основным направлениям селекции картофеля - составлено на основе поиска публикаций в базе данных Scopus (http://scopus.com, дата обращения: 08.08.2016 г.); в) наличие ДНК-маркёров для селекции картофеля на устойчивость к болезням и вредителям, доля (%) маркёров к отдельным болезням и вредителям от общего числа разработанных маркёров (составлено по данным [12]).

чине и нематоде отбор по генотипу соответственно в 2 и в 63 раза дешевле, чем отбор по фенотипу [8]), но для подавляющего большинства признаков дешевле вести селекцию с помощью ДНК-маркёров, а не фено-типической оценки (например, у злаков только 1 из 8 показателей дешевле оценить в поле, чем с помощью ДНК-диагностики [8]). Для селекции картофеля на нематодоустойчиовсть затраты на полевую оценку и ДНК-анализ одного образца соотносятся как 3:1, еще больше выигрывает ДНК-диагностика, по сравнению с дорогостоящими экспериментами в теплице, основанными на искусственном заражении растений [9].

Особое значение имеет возможность проведения с помощью ДНК-маркёров целенаправленного отбор, но основе точного знания того, какие именно гены и в каком состоянии (гомо- или гетерозиготном) наследуются в отбираемых селекционных формах. При этом на оценку генотипа не могут повлиять факторы окружающей среды, вклада которых не избежать если отбор ведется в полевых условиях по фенотипу. И, наконец, с помощью ДНК-маркёров можно отбирать потомство с заданными комбинациями определённых генов. Это особенно важно, если гены контролируют один и тот же признак, например, устойчивость к тому или иному патогену. В таких случаях отбор по фенотипу не позволит точно оценить, какая комбинация генов унаследована тем или иным индивидуумом в потомстве. Маркёр-ориентированная селекция дает возможность спрогнозировать генотип с высокой точностью и осуществить так называемое «пирамидирование» генов. Этот подход позволяет добиваться создания генотипов с высокой устойчивостью к фитопатогенам. У картофеля примером может служить пирамидировние генов устойчивости к фитофторе [10] и бледной нематоде [11]. В первом случае в генотип удалось ввести гены Rpi-mcd1 и Rpi-ber. В одиночку ген Rpi-berповышает устойчивость к фитофторе более чем вдвое, а при объединении с Rpi-mcd1, который самостоятельно бесполезен, удается увеличить устойчивость почти в 5 раз, по сравнению с генотипом, где оба гена рецессивны [10]. Создать такой генотип с помощью одной лишь оценки устойчивости без использования диагностических маркеров было бы невозможно. В работе Dalton а1. удалось повысить устойчивость к бледной нематоде почти на порядок в результате объединения в одном генотипе генов Gpa5 и GpaIVsadg [11]. Таким образом, пирамидирование генов с помощью отбора гибридных форм с использованием диагностических ДНК-маркёров - эффективный способ направленного создания генотипов картофеля с заданными свойствами.

Преимущества селекции растений с использованием ДНК-маркёров были в первую очередь по достоинству оценены и распространены в программах, нацеленных на повышение устойчивости к фитопатогенам и вредителям (см. рисунок, б). На сегодняшний день больше всего диагностических ДНК-маркёров разработано для генов устойчивости к фитофторозу, поражению Y-вирусом и золотистой картофельной нематоде (см. рисунок, в). Из числа известных диагностических ДНК-маркёров для селекции картофеля на устойчивость к болезням и вредителям примерно треть - это маркёры для селекции на устойчивость к различным вирусным заболеваниям, еще одна треть - к разным типам нематод и оставшаяся треть - к фитофторозу (см. рисунок, в).

Для признаков, не связанных с устойчивостью к факторам биотического стресса, имеется информа-

ция по маркированным локусам, связанным с урожайностью, различными характеристиками продуктивности (число, формирование и масса клубней, удельная масса), скороспелостью, лежкостью, свойствами крахмала, морфологическими характеристиками (форма и цвет клубней, глубина глазков, цвет мякоти), свойствами в вареном и жареном виде (потемнение в вареном виде, цвет в жареном виде, цвет чипсов) [12]. Это количественные признаки. Разработка диагностических ДНК-маркёров для селекции по ним -непростая задача.

Достижением стала успешная валидация трех ДНК-маркёров, которые теперь можно использовать в качестве диагностических для селекции картофеля на технологические качества [13]. Авторы предлагают использовать при отборе на увеличение среднего содержания крахмала в клубнях картофеля и качество изготавливаемых чипсов маркёр Stp23-8b, а для повышения качества чипсов после хранения при пониженных температурах - маркёры Рат1-8с или Рат1ргот^. Перечисленные маркёры подходят для первого этапа МОС, для того чтобы отбросить растения с негативными характеристиками по отмеченным признакам. На следующих этапах можно использовать маркёры для отбора растений с положительными характеристиками, а подтверждение на уровне фенотипа возможно уже только на завершающих этапах селекционного процесса. Это позволит экономить время и ресурсы, затрачиваемые на создание новых сортов.

Следует отметить, что маркёры, разработанные на основе одной группы сортов, могут не обладать диагностическими свойствами при исследовании сортов, созданных в других регионах [14]. Более того, прямой перенос в Россию новых технологий селекции картофеля, разработанных в других странах, зачастую невозможен в связи с их высокой стоимостью и ограничениями, накладываемыми зарубежными компаниями - владельцами этих технологий на их передачу в другие страны. Поэтому в национальных программах по селекции крайне важна разработка новых диагностических маркёров, пригодных для программ маркёр-ориентированной селекции, осуществляемой на основе использования собственных национальных генофондов растений. В связи с этим необходимы исследования, направленные на выявление, картирование и маркирование целевых генов или участков генома картофеля, контролирующих целевые хозяйственно-значимые признаки.

Идентификация новых селекционно значимых вариантов генов и ассоциированных с ними диагностических ДНК-маркеров возможна на основе полногеномного генотипирования картирующих популяций [15] или коллекций [16] картофеля, а также сравнительного транскриптомного анализа (RNAseq) контрастных образцов и гибридов [17]. В России в Федеральном исследовательском центре Институте цитологии и генетики СО РАН есть успешный опыт подобных работ на зерновых [18, 19].

Использование этого опыта для анализа отечественного генофонда картофеля и потенциальных доноров полезных признаков с проведением их учёта в различных эколого-географических условиях позволит не только выявить новые гены и создать маркеры для маркёр-ориентированной и геномной селекции, но и разработать стратегию целенаправленной селекции групп сортов для разных регионов Российской Федерации, возделывание которых в формате сортовой

мозаики позволит получать стабильно высокие урожаи в меняющихся условиях окружающей среды.

Таким образом, методы маркёр-ориентированной селекции (МОС) представляют собой модифицированный вариант традиционного подхода - комбинационной селекции, усиливая его потенциал, благодаря исполь-

зованию методов точной ДНК-диагностики. Они нашли широкое применение в мировом растениеводстве, в том числе в картофелеводстве, особенно в селекции на устойчивость к фитопатогенам и вредителям, и служат основой для инновационного развития отечественного картофелеводства.

Литература.

1. Серебровский А.С. Генетический анализ. М.: Наука, 1970. 342 с.

2. Хлесткина Е.К. Молекулярные маркеры в генетических исследованиях и в селекции // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2013. Т. 17. С. 1044-1054.

3. RFLP maps of potato and their alignment with the homoeologous tomato genome / C. Gebhardt, E. Ritter, A. Barone, T. Debener, B. Walkemeier, U. Schachtschabel, H. Kaufmann, R.D. Thompson, M.W. Bonierbale, M.W. Ganal, S.D. Tanksley, F. Salamini// Theor. Appl. Genet. 1991. V. 83. Pp. 49-57.

4. Beckmann J.S., SollerM. Restriction fragment length polymorphisms in genetic improvement: methodologies, mappingandcosts //Theor. Appl. Genet. 1983. V. 67. Pp. 35-43.

5. Tanksley S.D. Molecular markers in plant breeding // Plant Mol. Biol. Rep. 1983. V. 1. Pp. 3-8.

6. Хлесткина Е.К., Шумный В.К. Перспективы использования прорывных технологий в селекции: система CRISPR/Cas9 для редактирования генома растений//Генетика. 2016. Том 52. №7. С. 774-787.

7. Gordeeva E.I., Shoeva O.Y., Khlestkina E.K. Marker-assisted development of bread wheat near-isogenic lines carrying various combinations of Pp (purple pericarp) alleles//Euphytica. 2015. V. 203. Pp. 469-476.

8. Brennan J.P., Martin P.J. Returns to investment in new breeding technologies // Euphytica. 2007. V. 157. Pp. 337-349.

9. Slater A.T., Cogan N.O.I., Forster J.W. Cost analysis of the application of marker-assisted selectionin potato breeding // Molecular Breeding. 2013. V. 32. Pp. 299-310.

10. The effect of pyramiding Phytophthora infestans resistance genes R Pi-mcd1 and R Pi-ber in potato / M.Y. Tan, R.C. Hutten, R.G. Visser, H.J. van Eck// Theor Appl Genet. 2010. V. 121(1). Pp. 117-125.

11. The effect of pyramiding two potato cyst nematode resistance loci to Globodera pallida Pa2/3 in potato / E. Dalton, D. Griffin, T.F. Gallagher, N. de Vetten, D. Milbourne //Molecular Breeding. 2013. V. 3. Pp. 921-930.

12. Review of potato molecular markers to enhance trait selection / A.P. Ramakrishnan, C.E. Ritland, R.H.B. Sevillano, A. Riseman //American Journal of Potato Research. 2015.V. 92. Pp. 455-472.

13. Validation of candidate gene markers for marker-assisted selection of potato cultivars with improved tuber quality / L. Li, E. Tacke, H.R. Hofferbert, J. Lübeck, J. Strahwald, A.M. Draffehn, B. Walkemeier, C. Gebhardt // Theor Appl Genet. 2013. V. 126(4). Pp. 1039-1052.

14. Milczarek D., Flis B., Przetakiewicz A. Suitability of molecular markers for selection of potatoes resistant to Globodera spp. // American Journal of Potato Research. 2011. V.88. Pp. 245-255.

15. Genetic linkage mapping of economically important traits in cultivated tetraploid potato (Solanum tuberosum L.) / A.N. Massa, N.C. Manrique-Carpintero, J.J. Coombs, D.G. Zarka, A.E. Boone, W.W. Kirk, C.A. Hackett, G.J. Bryan, D.S. Douches//G3: Genes\Genomes\Genetics. 2015. V. 5(11). Pp. 2357-2364.

16. Targeted and untargeted approaches unravel novel candidate genes and diagnostic SNPs for quantitative resistance of the potato (Solanum tuberosum L.) to Phytophthora infestans causing the late blight disease / T. Mosquera, M.F. Alvarez, J.M. Jiménez-Gómez, M.S. Muktar, M.J. Paulo, S. Steinemann, J. Li, A. Draffehn, A. Hofmann, J. Lübeck, J. Strahwald, E. Tacke, H.R. Hofferbert, B. Walkemeier, C. Gebhardt//PLoS ONE. 2016.V. 11(6). e0156254.

17. A novel workflow correlating RNA-seq data to Phythophthora infestans resistance levels in wild Solanum species and potato clones /1. Frades, K.B. Abreha, E. Proux-Wéra, A. L.ankinen, E. Andreasson, E. Alexandersson// Frontiers in Plant Science. 2015. V. 6. P. 718.

18. Identification of new heading date determinants in wheat 5B chromosome / A.A. Kiseleva, A.B. Shcherban, I.N. Leonova, Z. Frenkel, E.A. Salina // BMC Plant Biol. 2016. V. 16 Suppl 1. P. 8.

19. Identification of nuclear genes controlling chlorophyll synthesis in barley by RNA-seq / N.A. Shmakov, G.V. Vasiliev, N.V. Shatskaya, A.V. Doroshkov, E.I. Gordeeva, D.A. Afonnikov, E.K. Khlestkina // BMC Plant Biol. 2016. In press.

MARKER-ASSISTED SELECTION AND EXAMPLES OF ITS APPLICATION IN WORLD POTATO

GROWING

E.K. Khlestkina12, V.K. Shumny12, N.A. Kolchanov12

'Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, prosp. Lavrent'eva, 10, Novosibirsk, 630090, Russian Federation

2Novosibirsk State University, ul. Pirogova, 2, Novosibirsk, 630090, Russian Federation

Summary. The goal of the article was to determine the role of marker-assisted selection (MAS) in modern plant breeding in our country and abroad by analysis of the literature data and to evaluate prospects of MAS application in potato growing. A brief history of MAS development and preceding findings underlying establishing of the MAS approach as well as the key differences between MAS and previous approaches, which determined intensive introduction of MAS in breeding practice, are described. The analysis of publication activity in peer-reviewed journals indexed in the Scopus database revealed leading countries and the place of Russia in the ranking of publications describing the implementation of DNA markers in plant research, including potato research. The leading countries in MAS-based potato research are the USA, the Netherlands, Great Britain and Germany. Russia occupies the 23rd place, that is higher than in the whole plant research ranking, but lower than in wheat ranking, in which Russia occupies the 12th place. MAS application for different breeding tasks in potato research was assessed. It is more often used for breeding for resistance to pathogens and pests (in this field MAS is in the greatest demand in the world), then for yield (the 2nd place) and abiotic stress resistance (the 3rd place). Advantages of marker-assisted selection such as economic efficiency, shortening time spent for breeding and possibility to create genotypes with unique combinations of genes are described and illustrated by examples. According to estimates given in the literature, costs for field assessment are 3 times higher than for DNA analysis in potato breeding for nematode resistance. The use of MAS allowed increasing the resistance to the pale potato cyst nematode almost an order of magnitude as a result of the pyramiding of two resistance genes. The article also outlined current directions for the development of new diagnostic DNA markers that are important for the development of the national potato breeding programs.

Key words: potato breeding, potato genetics, disease resistance, diagnostic DNA-markers, gene pyramiding. Author Details: E.K. Khlestkina, D.Sc. (Biol.), professor of the RAS, head of division1; chief research fellow of research center2 (e-mail: [email protected]); V.K. Shumny, D.Sc. (Biol.), member of the RAS, adviser of the RAS1, prof.2; N.A. Kolchanov, D.Sc. (Biol.), member of the RAS, director1, head of department2

For citation: Khlestkina E.K., Shumny V.K., Kolchanov N.A. Marker-Assisted Selection and Examples of Its Application in World Potato Growing. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2016. V.30. No. 10. Pp. 5-8 (in Russ.).