CC BY
40
© А. А. Беленко 1, С. А. Васильев 2, И. Н. Лебедев 1 2
1 ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет»;
2 ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской генетики» РАН, Томск
Генотоксическое действие ионизирующего излучения в ранний период эмбрионального развития может привести к фатальным последствиям. В то же время проблема радиочувствительности эмбриональных и экстраэмбриональных дифференцированных клеток зародышей человека остается слабо исследованной. В настоящей работе проведен анализ эффективности системы репарации двуните-вых разрывов ДНК экстраэмбриональных фибробластов зародышей человека. Показано, что в экстраэмбриональных фибробластах способность к репарации радиа-ционно-индуцированных повреждений ДНК, вероятно, отражает потенциал репарации спонтанных двунитевых разрывов ДНК.
С Ключевые слова: фокусы уН2АХ; микроядра; двунитевые разрывы ДНК; репарация ДНК; экстраэмбриональные фибробласты; индивидуальная радиочувствительность.
УДК 577.2.04, 539.1.04
маркеры индивидуальной радиочувствительности экстраэмбриональных клеток зародышей человека в условиях IN VITRO
ВВЕДЕНИЕ
Способность к репарации повреждений ДНК является специфичной для каждого типа клеток и определяет их индивидуальную чувствительность к действию различных мутагенов, в том числе ионизирующему излучению. Процесс репарации ДНК во время внутриутробного развития остается мало изученным вопросом (Pachkowski et al., 2011). В связи с этим целью настоящего исследования явилась оценка эффективности репарации двуни-тевых разрывов ДНК и анализ особенностей чувствительности первичных экстраэмбриональных фибробластов человека к действию ионизирующего излучения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования послужили 18 первичных линий экстраэмбриональных фибробластов человека, выделенных из плодного мешка медицинских абортусов. Забор материала осуществляли на основе информированного согласия женщин. Культивирование клеток проводили по стандартной методике (Rooney, Czepulkowski, 1992) с небольшими изменениями. Облучение материала в дозе 1 Гр проводили с использованием гамма-терапевтического аппарата Theratron Equinox на базе клиники НИИ онкологии (г. Томск). Оценку уровня двунитевых разрывов ДНК проводили путем анализа числа фокусов гистона yH2AX. Для иммуноокраши-вания были использованы первичные моноклональные мышиные антитела к белку yH2AX и вторичные кроличьи антитела с родамином (Novus, США), разведенные в 3 % FBS в концентрации 1 : 500. Окрашивание ядер проводили DAPI (0,3 мкМ) (Sigma, США), для защиты от выцветания на окрашенный препарат наносили среду Vectashield (Vector Labs, США). Частоту образования центромеронегативных микроядер, возникающих из хромосомного материала с нерепарированными двунитевыми разрывами ДНК, оценивали с помощью микроядерного теста в комбинации с флуоресцентной гибридизацией in situ (FISH) с панцентромерными ДНК-зондами по стандартной методике (Fenech, 2007). Анализ всех препаратов осуществляли на микроскопе Axio Imager Z2 (Zeiss, Германия) с применением системы Metafer (Metasystems, Германия). Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Манна—Уитни в программном пакете Statistica 6.0 (Statsoft).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Частота фокусов уН2АХ в контроле варьировала от 0,56 до 1,93 фокуса на клетку и в среднем составляла 1,01 ± 1,42 фокус/клетку. Через 30 минут после облучения частота фокусов уН2АХ значимо воз-Поступила в редакцию 19.04.2015 растала до 10,21 ± 5,17 фокуса/клетку (р = 0,0006) с последующим
Принята к публикации 07.12.2015 снижением через 24 часа после облучения до уровня, не отличающегося
значимо от контрольного (0,77 + 0,36 фокуса/клетку). Эффективность репарации радиационно-инду-цированных двунитевых разрывов ДНК в среднем составляла 97 %. Эффективность репарации была оценена в части линий (п=9) как доля радиацион-но-индуцированных фокусов уН2АХ, исчезнувших с 30 мин до 24 часов после облучения. Частота цен-тромеронегативных микроядер значимо повышалась с 3,86 ± 2,12 % в контроле до 45,33 ± 19,23 % после облучения (р = 0,000 002).
Важным вопросом является поиск маркеров индивидуальной радиочувствительности клеток человека, в качестве одного из которых рассматривается эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК. Однако в настоящей работе не было выявлено значимой корреляции между уровнем фокусов уН2ДХ через 24 часа после облучения, являющихся маркером нерепарированных двунитевых разрывов ДНК, и частотой радиационно-индуцированных микроядер. Ранее мы обнаружили, что в лимфоцитах периферической крови взрослых индивидов маркером индивидуальной радиочувствительности может являться спонтанный уровень фокусов уН2АХ (Melnikov et а1., 2013). Однако в настоящей работе не было выявлено значимой корреляции между фоновым и ра-диационно-индуцированным уровнем фокусов уН2АХ и радиационно-индуцированной частотой центроме-ронегативных микроядер. Возможно, это свидетельствует о специфичности клеточного ответа лимфоцитов и экстраэмбриональных фибробластов на действие радиации. С другой стороны, частота центромеронега-тивных микроядер, индуцированных радиацией, зависит от спонтанной частоты центромеронегативных микроядер до облучения (Н = 0,52, р = 0,038). Вероятно, в экстраэмбриональных фибробластах человека способность к репарации радиационно-индуцирован-ных повреждений ДНК отражает также потенциал репарации двунитевых разрывов ДНК, вызванных действием фоновых факторов. В соматических клетках взрослого организма эффективность репарации ДНК и радиочувствительность зависят от различных параметров, включая возраст индивида. Однако в экстраэмбриональных фибробластах человека не было обнаружено влияния срока беременности женщин, на котором было проведено прерывание беременности, на уровень фокусов уН2АХ и микроядер, что указывает на отсутствие вклада данного фактора в изучаемый феномен.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В работе впервые исследована связь между спонтанным уровнем фокусов уН2АХ и частотой радиаци-онно-индуцированных цитогенетических повреждений в экстраэмбриональных фибробластах человека. Срав-
нительный анализ зависимости реализации негативных эффектов излучения от активности системы репарации ДНК показал, что способность к репарации спонтанных двунитевых разрывов ДНК в фибробластах отражает также потенциал репарации радиационно-индуцированных повреждений.
Работа проведена при поддержке гранта РФФИ № 14-04-31867 и стипендии Президента № СП-364.2015.4.
ЛИТЕРАТУРА
1. Fenech M. (2007) Cytokinesis-block micronucleus cy-tome assay. Nature Protocols. V. 2. P. 1084-1104.
2. Human Cytogenetics: A Practical Approach (1992) edited by D. E. Rooney, B. H. Czepulkowski. Oxford; New York: IRL Press, 320 p.
3. Melnikov A. A., Vasilyev S. A., Musabaeva L. I., Veli-kaya V. V., Gribova O. V., Urazova L. N., Lebedev I. N., Choynzonov E. L. (2013) Frequency and spectrum of chromosome aberrations and micronuclei in peripheral blood lymphocytes of patients with head and neck tumors and relapse of breast cancer during the course of neutron therapy. European Journal of Human Genetics. V. 21, Suppl. 2. P. 300.
4. Pachkowski B. F., Guyton K. Z., Sonawane B. (2011) DNA repair during in utero development: A review of the current state of knowledge, research needs, and potential application in risk assessment. Mutation Research. V. 728. P. 35-46.
MARKERS of HuMAN EXTRAEMBRYoNAL
cells individual radiosensitivity
IN VITRO
Belenko A. A., Vasilyev S. A., Lebedev I. N.
C SuMMARY: Background: Genotoxic effects of ionizing radiation in early stages of human embryonic development can lead to fatal consequences. At the same time, the radiosensitivity of human embryonic and extraembryonic cells is still poorly studied. In this study, the analysis of DNA double-strand break repair effectiveness in human extraembryonal fibroblasts was carried out. Materials and methods. Extraembryonic human fibroblasts was irradiated by 1 Gy gamma-rays using Theratron Equinox (Cancer Research Institute, Tomsk). The level of DNA double strand breaks was assessed using yH2AX foci. Frequency of cytogenetic damage was assessed using micronucleus test conducted with FISH as a frequency of centromere-negative micronuclei. Results. No significant correlation was observed between both endogenous and residual levels of radiation-induced yH2AX foci and frequency of micronuclei after irradiation. It is suggested to be a result of the specificity of extraembryonal fibroblast radiation-induced response. The spontaneous frequency of centromere-negative micronuclei correlated with radiation-induced frequency of centromere-negative micronuclei. Conclusion. It was shown that human extraembryonal fibroblasts ability to repair radiation-induced DNA
damage is likely to be reflected by the repair of spontaneous DNA double C KEYWORDS: yH2AX foci; micronuclei; DNA double-strand breaks; strand breaks. DNA repair; extraembryonic fibroblasts; individual radiosensitivity.
C Информация об авторах
Беленко Андрей Александрович — аспирант, кафедра физиологии человека и животных. ФГАОУ ВО «Национальный исследовательский Томский государственный университет». 634050, Томск, пр. Ленина, д. 36. E-mail: [email protected].
Васильев Станислав Анатольевич — научный сотрудник, лаборатория цитогенетики. ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской генетики» РАН. 634050, Томск, набережная реки Ушайки, д. 10. E-mail: [email protected].
Belenko Andrey Alexandrovich — PhD Student, Department of Human and Animal Physiology. National Research Tomsk State University. 634050, Tomsk, prospekt Lenina, 35, Russia. E-mail: [email protected].
Vasilyev Stanislav Anatolyevich — Research Fellow, Laboratory of cytogenetics. Research Institute of Medical Genetics, RAS. 634050, Tomsk, naberezhnaya reki Ushayki, 10, Russia. E-mail: [email protected].
Лебедев Игорь Николаевич — руководитель лаборатории цитогенетики. ФГБНУ «Научно-исследовательский институт медицинской генетики» РАН. 634050, Томск, набережная реки Ушайки, д. 10. E-mail: [email protected].
Vasilyev Stanislav Anatolyevich — Head of Laboratory, Laboratory of cytogenetics. Research Institute of Medical Genetics, RAS. 634050, Tomsk, naberezhnaya reki Ushayki, 10, Russia. E-mail: [email protected].
