CC BY
93
УДК 577:574.24:612.019:591.1:351.777.61 ББК 28.672:52.84
Плотникова Ольга Михайловна
кандидат химических наук, доцент г. Курган Корепин Антон Михайлович научный сотрудник г. Курган Матвеев Николай Николаевич научный сотрудник г. Курган Лунева Светлана Николаевна доктор биологических наук г. Курган Plotnikova Olga Mikhailovna Candidate of Chemistry Assistant Professor Kurgan
Korepin Anton Mikhailovich
Research Officer Kurgan
Matveev Nikolay Nikolaevich
Research Officer Kurgan
Luneva Svetlana Nikolaevna
Doctor of Biology Kurgan
Маркеры эндогенной интоксикации в крови лабораторных мышей при интоксикации различными дозами метилфосфоната Endogenous Intoxication Markers in Laboratory Mice’s Blood Under the Influence of Various Methylphosphonate Doses
Представлены данные исследования биохимических показателей белкового обмена лабораторных мышей с целью изучения функционирования детоксикационных систем. Описана динамика изменения содержания
продуктов перекисного окисления белков и липидов, веществ низкой и средней молекулярной массы при интоксикации метилфосфоновой кислотой (МФК) в различных дозах. Показано, что МФК оказывает обратимое влияние на антиоксидантную и детоксикационную системы мышей.
The article presents the research data of biochemical indicators of protein metabolism of laboratory mice for the purpose of studying the detoxication system functioning. The time history of the peroxidation products content of protein and lipids, substances with small and average molecular weight while methylphosphonic
acid intoxication in various doses is described. It is shown that methylphosphonic acid has reversible influence on antioxidant and detoxification systems of the mice.
Ключевые слова: метилфосфоновая кислота, перекисное окисление белков и липидов, детоксикационная система, интоксикация.
Key words: methylphosphonic acid, protein and lipids peroxidation, detoxication system, intoxication.
В настоящее время изучение возможностей детоксикационных систем теплокровных организмов является весьма актуальным в связи с возрастающим загрязнением окружающей среды специфическими поллютантами. Широкое использование алкилфосфонатов в промышленности (комплексоны, экстрагенты), сельском хозяйстве (гербициды, инсектициды) и быту (поверхностно-активные вещества) началось в 70-80 годы прошлого века. Считалось, что вещества этой группы малотоксичны для человека, однако со временем начали появляться данные о их токсическом влиянии на растения и животных [1, 2]. Кроме того, интерес к этой проблеме вызван начавшимся в России уничтожением химического оружия, в том числе с фосфорорганическими соединениями, продуктами деструкции которых являются алкилметилфосфонаты [3] и метилфосфоновая кислота (МФК). МФК и ее эфиры, являясь достаточно устойчивыми соединениями, были обнаружены в почве на полигоне Дагуэй (США) спустя 10 лет после загрязнения [4].
МФК - ксенобиотик антропогенного происхождения, содержит малополярную фосфор-углеродную связь и может выступать посредником свободных радикалов, разрушая нативную структуру биополимеров, оказывая влияние на антиоксидантную систему (АОС) живых организмов. В научной литературе информации о таком влиянии крайне мало [5]. Мишенью свободных радикалов в клетке являются, прежде всего, белки-рецепторы и липиды плазматических мембран, которые конформационно закрепляются липидным окружением мембранного бислоя [6]. В результате окислительной модификации белков (ОМБ) и перекисного окисления липидов (ПОЛ) под воздействием активных форм кислорода (АФК) и других радикалов образуются различные карбонильные метаболиты, в т.ч. карбонильные производные (КП) белков и липидов, которые являются ранними маркерами окисления и
показателями степени деструкции молекул. Эти процессы сопровождаются эндогенной интоксикацией (ЭИ) адаптивного или патологического характера. Для диагностики ЭИ используют такие показатели как вещества низкой и средней молекулярной массы (ВНСММ), олигопептиды (ОП) в плазме и в эритроцитах, уровень альбуминов и фракций глобулинов в крови [7].
Целью исследования было изучение содержания карбонильных производных белков и липидов, маркеров ЭИ в крови лабораторных мышей при интоксикации различными дозами МФК.
Объекты и методы исследования
В работе исследовалась плазма и эритроцитарная масса 130 особей самцов лабораторных белых мышей линии СВА массой 25-30 г в возрасте 2-х месяцев. Животные содержались в стандартных условиях вивария аккредитованной на техническую компетентность в проведении биохимических исследований лаборатории экотоксикологии в центре по обеспечению экологического мониторинга объект по уничтожению химического оружия по Курганской области. В каждой серии эксперимента животных делили на контрольную и опытную группы по 10-12 особей в каждой. Животным контрольных групп подкожно вводили физиологический раствор, опытных групп - нейтрализованные изотонические растворы МФК в объеме 0,04 мл из расчета МФК на массу животного в дозах: 2; 10-3; 10-6, 10-9; 10-12; 10-15 и 10-18 мг/кг. Все работы с лабораторными мышами проводили согласно принципам гуманного отношения к животным и правилами лабораторной практики [8].
Предварительное исследование влияния подкожного введения МФК в дозе 2 мг/кг через 12, 24, 48, 72, 96, 120 часов на показатели белкового, липидного и углеводного обменов показали, что оптимальным сроком для дальнейшего изучения влияния токсиканта является 72 часа после интоксикации [9]. Поэтому через 72 часа после окончания каждой серии эксперимента животных декапитировали, брали цельную кровь и по адаптированным методикам в плазме крови лабораторных мышей определяли общий белок биуретовым методом, ОП в плазме крови и эритроцитах по
методу Лоури [4], белковые фракции альбумин, а1-, а2-, в- и у-глобулины методом электрофореза и денситометрии (Beckman Paragon Electronic System), продукты перекисного окисления белков (ПОБ) по концентрации карбонильных производных белков в виде альдегидо- (АФГ) и кето- (КФГ) 2,4-динитрофенилгидразонов [10], малоновый диальдегид (МДА) по реакции с тиобарбитуровой кислотой [11], ВНСММ в плазме и эритроцитах [12].
При статистической обработке данных использовали критерии непараметрической статистики Титьена-Мура при исключении выбросов, Вилкоксона-Манна-Уитни для оценки достоверности различия между независимыми выборками. Результаты анализов представляли в виде медианы, 25-75-процентилей и в процентах (%) опытных и контрольных групп [13].
Результаты и их обсуждение
Анализ результатов по изучению биохимических показателей крови лабораторных мышей показал, что показатели ПОБ в виде КФГ, ПОЛ в виде МДА, ВНСММ в плазме и ОП в плазме и эритроцитах имели высокий уровень информативности ввиду большого числа достоверных отличий. Относительный уровень АФГ, КФГ и МДА в плазме крови, также содержание ВНСММ в плазме и эритроцитах крови лабораторных мышей при интоксикации МФК в различных дозах представлены на рисунке 1.
180
160
140
Ц 120
S 100
о 80 ^ 60 40 20
Ж
59
133
128,
135
ГЮ
I
58
□ т
93
2 10-3 10-6 10-9 10-12 10-15 10-18 □ АФГ □ КФГ В МДА
1 а
1 б
Рис. 1. Содержание в крови мышей-самцов линии СВА относительно контрольных групп при интоксикации различными дозами МФК:
1а - АФГ, КФГ и МДА в плазме; 1б - ВНСММ в плазме и эритроцитах.
При действии высокой дозы МФК (в нашем исследовании - 2 мг/кг) для мышей-самцов характерно значительное понижение уровня КФГ (на 41%) и МДА (на 30%) относительно контрольных групп при отсутствии изменений в содержании АФГ (рис. 1а). Уменьшение уровня карбонильных производных белков и липидов, возможно, происходило из-за активации детоксикационной системы за счет функционирования МФК как ловушки радикалов. Под влиянием МФК в дозах 10-3 и 10-6 мг/кг достоверно понижался только содержание КФГ (до 28%) и ВНСММ в плазме (до 66%), соответственно.
Влияние МФК в низкой дозе 10-15 мг/кг на окислительную модификацию белков имело противоположный характер: происходила интенсификация образования как первичных, так и вторичных продуктов ПОБ (АФГ и КФГ) на 35 и 77%, соответственно. Это характерно для глубокого разрушения белковых структур при ослаблении компенсационных возможностей организма. Повышение ОМБ скорее связано не столько с повышением уровня АФК, как с изменением конформационной структуры белков, что приводило к большей доступности аминокислотных остатков для окисления. Уровень основного маркера ПОЛ МДА при этом понижался на 42%. Т.е. в состоянии окислительного стресса атаке радикалов подверглись не столько липиды, сколько белки, в том числе плазматических мембран.
Данные по распределению пула ВНСММ в плазме и эритроцитах соответствовали данным по уровню образования КП белков и подтверждали тенденцию в процессах окислительного распада белков под действием МФК в высоких и низких дозах (рис. 1б). Повышение содержания ВНСММ в эритроцитарной массе на 20%, а в плазме на 47% относительно контрольных групп после введения мышам МФК в дозе 10-15 мг/кг можно объяснить тем, что МФК в низких дозах, взаимодействуя с рецепторами (не исключено связывание с ферментом холинэстеразой), активирует механизмы свободно-радикального окисления биосубстратов. МФК в высоких дозах, присутствуя в достаточном количестве, видимо, выступала в роли субстрата при окислении (например, в виде акцептора образующихся радикалов), что приводило к понижению на 17%
уровня ВНСММ. Повышение уровня ВНСММ (продуктов небелковой природы - креатинина, мочевины, мочевой кислоты, олигосахаридов, альдегидов, билирубина, аминокислот и других), служит критерием эндотоксикоза. Развитие ЭИ характеризуется различным распределением ВНСММ в системе плазма/эритроциты. Значительное повышение ВНСММ в плазме при низком их содержании в эритроцитах свидетельствует об усилении процессов интоксикации организма при недостаточной детоксицирующей функции.
В работе были определены концентрации ОП в плазме и эритроцитах, большая часть которых - нерегулярные пептиды патологической деградации белков, а также проанализированы белковые фракции во всем диапазоне доз МФК. Полученные данные по содержанию ОП говорят о специфическом
Рис. 2. Содержание в крови мышей-самцов линии СВА относительно контрольных групп при интоксикации различными дозами МФК:
2а - ОП в плазме и эритроцитах; 2б - Белковых фракций при МФК
в дозе 10-15 мг/кг.
При интоксикации МФК в дозе 10- мг/кг происходило сопровождаемое ростом фракции а1 на 39% повышение содержания ОП в плазме и эритроцитах крови мышей-самцов на 36 и 27%, соответственно. После введения МФК в дозе 10-15 мг/кг наблюдался рост концентрации ОП в плазме на 90% при одновременном увеличении глобулиновых фракций - а1 на 44% и а2, в на 25%.
Полученные в работе данные по изменению показателей ОМБ, ПОЛ и ЭИ показали, что МФК в различных дозах оказывала воздействие на
антиоксидантную и детоксицирующую системы организма лабораторных мышей. Влияние, скорее всего, заключалось в свободно-радикальном воздействии на плазматические мембраны, что приводило к накоплению веществ ПОБ и ПОЛ как эндотоксинов, дальнейшей интоксикации организма и появлению вторичных признаков ЭИ (ВНСММ и ОП). Распределение белковых фракций подтверждало наличие острофазовых реакций организмов мышей. Отсутствие изменений в содержании КП белков, ОП в плазме по сравнению с контрольной группой, а также понижение уровня МДА и ВНСММ эритроцитах
по сравнению с предыдущей экспериментальной группой мышей после
18
введения мышам МФК в дозе 10 мг/кг говорит о незначительных патологических изменениях при модификации белков.
Таким образом, МФК при интоксикации лабораторных мышей выступала в качестве инициатора появления различных эндотоксинов, образующихся в результате патологической деградации белков и липидов, о чем говорят данные по содержанию карбонильных производных белков и липидов, ВНСММ и ОП. Токсическое действие МФК в зависимости от дозы вызывает различный уровень эндогенной нагрузки. В дозе МФК 10-15 мг/кг у самцов наблюдается эндотоксикоз, сопровождающийся достоверным увеличением фракций ВНСММ, ОП и продуктов ПОБ и ПОЛ, как маркеров окислительного стресса.
Можно предполагать, что появление метилфосфонатов в природных средах в низких дозах приведет к дополнительной нагрузке на АОС теплокровных организмов. Экспериментально доказана и обратимость влияния разовой интоксикации МФК лабораторных мышей.
Библиографический список
1. Огородникова С.Ю. Реакция растений на действие метилфосфоновой кислоты / С.Ю. Огородникова, Т.К. Головко // Теоретическая и прикладная экология. - 2007. № 1. - С. 78-93.
2. Раундап - экологический пестицид массового поражения // Дождевые черви и сельское хозяйство [сайт]. ИКЬ: http://www.green-pik.ru.
3. Шкодич П.Е. Эколого-гигиенические аспекты проблемы уничтожения химического оружия / П.Е. Шкодич, В.Ф. Желтобрюхов, В.В. Клаучек. - Волгоград: ВолГУ, 2004. С. 236.
4. Савельева Е.И. Исследование продуктов превращений фосфорорганических отравляющих веществ методом газовой хроматоргафии-масс-спектроскопии / Е.И. Савельева, И.Г. Зенкевич, Т. А. Кузнецова // Рос. хим. журн. - 2002. Т. ХЬУТ. № 6. - С. 83-91.
5. Кравцов И.С. Выделение из окружающей среды микроорганизмов, способных разлагать фосфонаты / И.С. Кравцов, С.Н. Янов, И.В. Дармов, А.Л. Кавтун // Хим. и биол. безопасность. - 2006. №6. - С. 3-9.
6. Dean R.T. Biochemistry and pathology of radical-mediated protein oxidation / R.T. Dean, S. Fu, R. Stocker, M.J. Davies // Biochem J. - 1997.V. 324. - P. 1-18.
7. Маржохова М.Ю., Желихажева Ж.М. Оценка синдрома эндогенной интоксикации при пищевых токсикоинфекциях / М.Ю. Маржохова, Ж.М. Желихажева // Клиническая лабораторная диагностика. - 2009. № 1. - С. 15-18.
8. Правила лабораторной практики в Российской Федерации. Приказ МЗ № 267. -М.: 2003.
9. Плотникова О.М.. Биохимические показатели лабораторных мышей в зависимости от времени интоксикации метилфосфонатом / О.М. Плотникова, Н.Н. Матвеев, А.М. Корепин, И.В. Дуплякина // Теоретическая и прикладная экология. - 2010. № 1. - С. 81-86.
10. Вьюшина А.В. Различия в процессах перекисного окисления белков у крыс, селектированных по порогу возбудимости нервной системы / А.В. Вьюшина, И. А. Вайдо, И.Г. Герасимова, Н.П. Ширяева, М. А. Флеров // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. № 3. - С. 292-296.
11. Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 62-68.
12. Малахова М.Я. Методы биохимической регистрации эндогенной интоксикации. Сообщение второе / М.Я. Малахова // Эфферентная терапия. - 1995. Т. 1. № 2. - С. 61-64.
13. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. - М.: Практика, 1998. - 459 с.
Bibliography
1. Dean R.T. Biochemistry and Pathology of Radical-Mediated Protein Oxidation / R.T. Dean, S. Fu, R. Stocker, M.J. Davies // Biochem J. - 1997. - V. 324. - P. 1-18.
2. Glantz, S. Medico-Biological Statistics / S. Glantz. - M.: Practika, 1998. - 459 p.
3. Kravtsov, I.S. Microorganisms Allocation from the Environment, Capable to Decompose Phosphonate / I.S. Kravtsov, S.N. Yanov, I.V. Darmov, A.L. Kavtun // Chemical and Biological Safety. - 2006. №6. - P. 3-9.
4. Malakhova, M.Ya. Biochemical Registration Methods of Endogenous Intoxication. The Second Message / M.Ya. Malakhova // Efferent Therapy. - 1995. - V. 1. - № 2. - P. 61-64.
5. Marzhokhova, M. Yu., Zhelikhazheva, Zh.M. Estimation of Endogenous Intoxications Syndrome at Food Toxinfections / M.Yu. Marzhokhova, Zh.M. Zhelikhazheva // Clinical Laboratory Diagnostics. - 2009. - № 1. - P. 15-18.
6. Modern Methods in Biochemistry / Ed. by V.N. Orekhovich. - M.: Meditsina, 1977. - P.
62-68.
7. Ogorodnikova, S.Yu. Plants Reaction on the Action of Methylphosphonic Acids / S.Yu. Ogorodnikova, Т.К. Golovko // Theoretical and Applied Ecology. - 2007. - № 1. - P. 78-93.
8. Plotnikova, O.M. Biochemical Indicators of Laboratory Mice Depending on the Time of Intoxication by Methylphosphonates / O.M. Plotnikova, N.N. Matveev, A.M. Korepin, I.V. Duplyakina // Theoretical and Applied Ecology. - 2010. - № 1. - P. 81-86.
9. Roundup Is Ecological Pesticide of Mass Destruction// Earthworms and Agriculture [site]. - Access Mode: http://www.green-pik.ru.
10. Saveliev, E.I. Product Research of Transformations of Phosphororganic Poisonous Substances by Means of Gas Chromatographic-Mass-Spectroscopy Method / E.I. Saveliev, I.G. Zenkevich, T.A. Kuznetsova // Russian Chemical Journal. - 2002. - V. XLVI. - № 6. - P. 83-91.
11. Shkodich, P.E. Ecological-and-Hygienic Aspects of Chemical Weapon Destruction / P.E. Shkodich, V.F. Zheltobryukhov, V.V. Klauchek. - Volgograd: VSU, 2004. - P. 236.
12. The Rules of the Laboratory Practice in the Russian Federation: Ministry of Health Order № 267. - М.: 2003.
13. Viyushina, A.V. Differences of the Processes of Albumin Peroxidation at Rats, Selected on Excitability Threshold of the Nervous System / A.V. Viyushina, I.A. Vaydo, I.G. Gerasimov, N.P. Shiryaev, M.A. Flerov // The Herald of Experimental Biology and Medicine. - 2002. - № 3. -P. 292-296.
