Люминесцентный сенсор для определения экотоксикантов в биологических средах Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 577.345; 681.785.453

Е.В. Наумова, Г.В. Мельников

ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ СЕНСОР ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭКОТОКСИКАНТОВ

В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ

Предложен люминесцентный сенсор на основе молекул сывороточного альбумина человека для определения ионов тяжелых металлов в различных биологиче-

ских объектах. Исследованы фотофизические свойства люминесцентного сенсора с помощью разработанного портативного импульсного фосфориметра.

Люминесцентный сенсор, фосфориметр, сывороточный альбумин человека (САЧ), красители

E.V. Naumova, G.V. Melnikov

LUMINESCENT SENSOR FOR DETERMINING ECOTOXICANTS IN BIOLOGICAL

ENVIRONMENTS

The article deals with the proposed luminescent sensor molecules based on human serum albumin to determine heavy metal ions in various biological systems. Photophysical properties of the luminescent sensor are investigated by means of the developed portable pulse phosphorimeter.

Luminescent sensor, phosphorimeter, human serum albumin (HSA), dyes

Техногенная деятельность человека оказывает негативное влияние на состояние объектов окружающей среды. Основными источниками поступления экотоксикантов, в том числе и ионов тяжелых металлов являются промышленные предприятия и предприятия теплоэнергетики, а в крупных городах также сжигаемое топливо в автомобилях. В связи с этим необходим своевременный мониторинг состояния окружающей среды на содержание экотоксикантов.

Нами разработан люминесцентный биосенсор на основе молекул полярного красителя ксантенового ряда эозина, нековалентно связанного с сывороточным альбумином человека. Выбор этого красителя в качестве зонда обусловлен его значительным квантовым выходом люминесценции, а также способностью эффективно связываться с белками. Нами изучено влияние присутствующих в исследуемом растворе солей тяжелых металлов таллия и свинца на люминесцентно-кинетические характеристики эозина.

Для регистрации временной зависимости интенсивности фософоресценции люминесцентного сенсора нами был разработан портативный импульсный фосфориметр. Регистрация и обработка временной зависимости интенсивности фосфоресценции осуществлялась посредством электрической схемы (рис. 1) на основе микроконтроллера. Параметры усилительного каскада схемы подобраны для регистрации длительных послесвечений с учетом минимального влияния переходных процессов схемы на качество регистрации выходного сигнала. Под действием возбуждающих импульсов светодиода VD1 оптической ячейки молекулы люминесцентного зонда-эозина переходят в возбужденное состояние с заселением триплетного состояния. При излучательном переходе из этого состояния происходит испускание кванта фосфоресценции, который регистрируется с помощью фотодиода VD2 оптической ячейки, при этом кювета с раствором расположена под острым углом к оптической оси, проходящей через источник света, а фотодетектор расположен с обеспечением минимального влияния засветки от импульсного источника возбуждающего света и отраженного от стенок кюветы света на регистрируемое излучение (Патент РФ № 118755, опубл. 27.07.2012, бюл. № 21).

Чтобы минимизировать влияние переходных процессов в усилительном каскаде схемы на полезный сигнал при обеспечении максимального усиления фосфоресценции люминесцентного сенсора, осуществлялось моделирование импульсного сигнала светодиода без исследуемого образца (рис. 2, а - вид сигнала, поступающего на вход усилительного каскада схемы, б - вид сигнала на выходе усилительного каскада схемы) и производился подбор параметров R2/R3 усилительного каскада фотодиода.

Светодиод VD1 марки LB-P200G3C-H5 оптической ячейки работает в импульсном режиме с частотой 250 Гц на длине волны 515-530 нм и величиной светового потока 120-130 Lm, что эквивалентно напряжению 0,8 В (рис. 2 а) на выходе фотодиода SD 5421-002, длительность импульса составляла 10-6 с (рис. 2 б).

Из рис. 2б видно, что время переходного процесса при регистрации импульса светодиода длительностью 10-6 с. составляет около 20 мкс. В эксперименте получены зависимости величины выходного напряжения от времени, незначительно отличающиеся от результатов моделирования. Поскольку время жизни фосфоресценции порядка 3 мс, то схема регистрации вполне приемлема для изучения кинетики затухания фосфоресценции зонда, Если регистрацию фосфоресценции 156

осуществлять после 20-50 мкс, когда закончатся переходные процессы, результаты не будут искажены переходными процессами в цепи.

Рис. 1. Электрическая схема усилительного каскада электрической схемы портативного импульсного фосфориметра

Рис. 2. Результаты моделирования сигнала светодиода без образца, зависимость величины выходного напряжения схемы от времени а - вид сигнала, поступающего на вход усилительного каскада схемы, б - вид сигнала на выходе усилительного каскада схемы

Нами составлены уравнения, описывающие процессы дезактивации триплетных состояний люминесцентного зонда, находящегося в водной фазе и в глобуле белка. Системы

дифференциальных уравнений составлены на основании формализма химической кинетики с учетом неоднородного распределения люминесцентных зондов в микрогетерогенной белковой среде.

Уравнения дезактивации люминесцентного зонда - эозина в растворе сывороточного альбумина человека без тяжелых металлов в глобулярной микрофазе:

ё(мАт )/Л = - к_ [мАт] + к+ [Ат] [М] - кмон [мАт] (1)

и водной макрофазе:

ё(Ат)/Л = - к+[Ат] [М]+ к_[мЛт] - кдезв[Ат] (2)

где [мАт] концентрация молекул зонда - эозина в триплетном состоянии в глобуле белка (10 мкМ), [Ат] - в водной макрофазе (0.1 мкМ), к_, к+ константа скорости выхода (400 с-1) и входа (6,9*109 М-1с-1) молекул зонда в глобулу белка соответственно, [М] - концентрация глобул белка (3.8 мкМ), кмон - константа мономолекулярных процессов дезактивации энергии электронного возбуждения акцептора - эозина в триплетном состоянии в глобулярной микрофазе, кдезв - константа дезактивации триплетных состояний в воде (1300 с-1).

Интенсивность фосфоресценции зонда пропорциональна концентрации триплетных состояний молекул зонда, поэтому решение кинетических уравнений позволяет получить в итоге временную зависимость интенсивности фосфоресценции зондов. Моделирование кинетики затухания фосфоресценции люминесцентного сенсора осуществлялось в среде МайаЬ. Анализ временных зависимостей интенсивности фосфоресценции эозина (рис. 3) позволил установить, что на характер дезактивации наибольшее влияние оказывают увеличение концентрации эозина в глобуле белка [мАт] и уменьшение концентрации эозина в водной макрофазе [Ат]. Изменяя константу скорости мономолекулярных процессов кмон в интервале (200 - 320) с-1, получено семейство зависимостей, по форме близких к экспоненциальным.

concentration of eosin in the protein

0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

1|те хКГ3

Рис. 3. Моделирование кинетики затухания фосфоресценции молекул зондов, находящихся в глобулярной фазе

1.4 1.2 1 0.8 S? 0.6 со- 1 0.4 0.2 0 -0.2 eosin in the protein

!

j

;

0 0.5 1 1.5 2 2.5 time х 10*

Рис. 4. Погрешность определения константы скорости мономолекулярных процессов

Экспериментально полученные временные зависимости интенсивности фосфоресценции водных растворов биосенсора на основе САЧ + эозин (на рис. 3 выделено «*») максимально приближены (с наибольшей погрешностью 1,2% рис. 4) к результатам моделирования при кмон = 300 с-1. Следовательно, принимаем значение константы скорости дезактивации триплетных состояний равной 300 с-1.

Рис. 5. Моделирование кинетики затухания фосфоресценции молекул зондов, находящихся в глобулярной фазе, в присутствии ионов тяжелых металлов

Рис. 6. Погрешность определения константы скорости тушения тяжелыми металлами триплетных состояний эозина в глобулах белка

Нами исследованы процессы тушения триплетных состояний зондов в белках в присутствии ионов тяжелых металлов. Скорость затухания фосфоресценции молекул зондов, находящихся в глобулярной и водной фазах, в присутствии ионов тяжелых металлов, а также процесс входа тяжелых металлов в глобулу белка и выхода из глобулы можно представить следующими уравнениями:

-[ё(мАт)]/Л=к_[мАт] -к+[Ат] [М]+кмон[мАт]+кт1м[мАт] [мт1+]+кдм[мАт] Ю] (3)

-[ёАт]/Л = к+[Ат] [М] - к_[мАт]+ кт1в[Ат][т1+] + к^А^Ю] (4)

(№т1+)]/Л) = квХ [М] [т1+] - квых[мт1+] (5)

где [мАт] концентрация молекул зонда - эозина в триплетном состоянии в глобуле белка(10 мкМ), [Ат] - в водной макрофазе (0.1 мкМ), [мТГ] - концентрация молекул тушителя в глобуле белка (0,01 М), k_, k+ - константа скорости выхода( 400 с-1) и входа (6,9*109 М-1с-1) молекул зонда в глобулу белка соответственно, [M] - концентрация глобул белка (3.8 мкМ), кТ1м- константы скорости тушения триплетных состояний молекул зонда таллием (6^103 М-1с-1), кТ1в - константа скорости тушения триплетных состояний эозина в водной среде, k^Q] - псевдомономолекулярная константа скорости тушение примесями, преимущественно это концентрация остаточного кислорода в белковой микрофазе, kQtQ] -псевдомономолекулярная константа скорости тушение примесями в водной микрофазе, [Q] - концентрация кислорода, [ТГ] - концентрация молекул тушителя в водной среде 0,01 М, kx, km - константа входа (~109 М-1с-1) ионов таллия в глобулярную микрофазу и выхода (~103с-1) в водную макрофазу.

Используя скорректированное ранее значение k^H = 300 с-1, а также изменяя константу скорости тушения триплетных состояний эозина в kj^ получено семейство зависимостей, по форме близких к экспоненциальным. Экспериментальные данные для водных растворов САЧ + эозин + ТМ (на рис. 5 выделено «*») максимально приближены к результатам моделирования при ^"=3,2* 106 М-1с-1 с наибольшей погрешностью 4,3% рис. 6.

Скорректированное таким образом значение константы скорости тушения триплетных состояний эозина к® позволяет получить более достоверное значение концентрации тяжелых металлов в исследуемых растворах при учете неоднородности распределения молекул тушителя в исследуемом растворе САЧ.

Погрешность при определении наличия ионов тяжелых металлов с помощью предложенного люминесцентного сенсора складывалась из суммы неисключенных остатков систематической и случайной погрешностей. Неисключенная систематическая погрешность обусловливается: погрешностью приготовления растворов (взятие навески, ее растворение, разбавление растворов) погрешностью определения констант скорости затухания фосфоресценции методами математического моделирования, погрешностью прибора - импульсного фосфориметра; погрешностью построения градуировочных графиков, погрешностью измерения. Случайная погрешность обусловливается погрешностями, случайно изменяющимися при повторных измерениях одной и той же величины. Таким образом, результирующая погрешность не превышает ±25 %, что соответствует требованиям ГОСТ 17.1.3.07-82.

Наумова Екатерина Викторовна -

аспирант кафедры «Приборостроение»

Саратовского государственного технического университета имени Гагарина Ю.А.

Мельников Геннадий Васильевич -

доктор физико-математических наук, профессор кафедры «Прикладная физика» Саратовского государственного технического университета имени Гагарина Ю.А.

Статья поступила 17.09.12, принята к опубликованию 20.02.13

Ekaterina V. Naumova -

Postgraduate

Department of Instrument Making Gagarin Saratov State Technical University

Gennadii V. Melnikov -

Dr. Sc., Professor

Department of Applied Physics

Gagarin Saratov State Technical University