CC BY
102
ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ В ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ - СРАВНЕНИЕ С
КОЛЛОИДАМИ ЗОЛОТА
С.П. Ярков, С.Н. Скопинская, И.В. Шиленко, В.Н. Злобин
Государственный научный центр - Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения, Москва, [email protected]
Экспериментально изучен люминесцентный иммунохроматографический анализ (ИХА) для выявления антигенов и клеток микроорганизмов, токсинов. В качестве меток для получения коньюгатов с антителами использовали люминесцентные латексные (ЛЛ) наночастицы и квантовые метки. Разработаны приборы для регистрации люминесцентного ИХА. Показаны преимущества ЛЛ при проведении ИХА по сравнению с квантовыми метками и коллоидным золотом (КЗ). Чувствительность ИХА на основе люминесцентных латексов, в 3 - 30 раз превышала чувствительность ИХА на основе КЗ для тех же антигенов.
Для целей медицинской диагностики и санитарно гигиенического контроля все шире применяется ИХА, основанный на латеральной диффузии компонентов иммунохимической реакции в полимерной мембране [1]. Типичная длительность ИХА составляет 15 - 20 мин, он характеризуется высокой чувствительностью, специфичностью, простотой процедуры, что делает его привлекательным аналитическим инструментом для выявления токсинов, антигенов или клеток микроорганизмов в пробах, взятых из организма человека, окружающей среды, как в полевых условиях, так и в лабораториях различной степени оснащенности [2 - 5].
Ключевым моментом при разработке ИХА является получение иммунохмимчески реакционноспособных коньюгатов наночастиц с иммуноглобулинами или другими рецепторными молекулами. Наночастицы коньюгатов являются в данном случае маркерными молекулами ИХА. Регистрация оптических свойств коньюгатов позволяет судить о результатах ИХА.
Нами разработан ИХА патогенных микроорганизмов, антигенов и токсинов с использованием в качестве маркеров люминесцентных ноночастиц (табл. 1), проведено сравнение с ИХА, в качестве маркера в котором применялось КЗ. При этом остальные факторы, влияющие на чувствительность ИХА: природа антител, тип иммунохроматографических (ИХ) мембран, были идентичны для каждой аналитической системы.
Таблица 1. Основные физические характеристики наночастиц, использованных для получения
коньюгатов с иммуноглобулинами
Характер наночастиц Средний диаметр частиц, нм Длина волны возбуждения люминесценции, нм Длина волны эмиссии люминесценц ии, нм Способ конъюгации с иммуноглобулинами
Коллоидное золото 35 520 - 523 в максимуме поглощения - Гидрофобное взаимодейст.
Карбоксилированные латексы с введенным в массу полимера люминесцентным красителем 332 430 520 Химическая сшивка Бифункцион. реагентом
Карбоксилированные квантовые метки из CdSe покрытые слоем ZnS 25 < 400 нм 595 То же
При проведении ИХА с КЗ аналитическая и контрольная линии на ИХ мембране имеют видимую глазом окраску (красные линии). Для регистрации ИХА с люминесцентными наночастицами необходимы специализированные приборы, имеющие источник возбуждения и светофильтры в тракте возбуждения и эмиссии.
Нами сконструированы экспериментальные образцы приборов: регистратора люминесценции видеоцифрового «РЛВ-1» и устройства для визуализации люминесцентных иммунохроматограмм «УВ-1». В обоих приборах осуществляется освещение поля иммунохроматограммы светом светодиодов высокой яркости с максимумом длины волны 380 нм, более длинноволновая компонента излучения светодиода отсекается светофильтром УФС-5. На рис. 1 представлено графическое представление ИХА полученное с помощью прибора «РЛВ-1» и компьютерной программы Lum Vis.
LUMINESCENCE VISUALIZATION v.0.3
Люминесцентный иммунохроматографический анализ
Наименование БПА
Yersinia ревпв Г7
Номер измерения
3
Параметры измерения
Яркость: (5137 -5176) Контраст: (1254-1293) Экспозиция: 1/16 сек. Вычисление значений: Ручное Число усредненных кадров: 1С Дата: 20.01.2008 время: 17:52:25
Результаты измерения Контроль: 1450 Тест: 566
Отношение: 6=0,390
Оператор: ________ I_/
Рис. 1 Графическое представление результатов люминесцентного ИХА вакцинного штамма возбудителя чумы, полученное с помощью прибора «РЛВ-1»
Результаты определения аналитов с помощью ИХА с люминесцентными наночастицами и КЗ представлены в табл. 2. Видно, что ИХА с ЛЛ позволяет выявлять различный антигенный материал с высокой чувствительностью, в ряде случаев превышающей возможности аналогичного ИХА на основе частиц КЗ. Это, в первую очередь, касается растворимых антигенов - ЛПС возбудителя туляремии и Ф1 возбудителя чумы, а также токсинов - стафилококкового энтеротоксина В (SEB) и рицина. Чувствительность выявления антигена Ф1 возбудителя чумы и J111С возбудителя туляремии, а также спор сибирской язвы для ИХА с использованием ЛЛ была в 5 - 10 раз выше, чем аналогичный ИХА с КЗ. По возможностям выявления SEB и рицина ИХА с ЛЛ превосходил ИХА с КЗ в 3-8 раз.
1
1450, £0,390 1 566
Контроль Тест
Таблица 2. Сравнение чувствительности ИХА в котором применялись коньюгаты иммуноглобулинов и наночастиц различной химической природы
Чувствительность ИХА
АНАЛИТ Люминесцентныела Квантовые Коллоидное
тексы метки золото
Вакцинный штамм возбудителя туляремии, м.к./мл 1х106 Н.д. 5х105
ЛПС антиген туляремии, нг/мл 0,5 Н.д. 10 - 15
Вакцинный штамм возбудителя сибирской язвы,споры/мл 1х105 Н.д. 1х106
Вакцинный штамм возбудителя чумы, м.к./мл 5х104 5х105 5х105
Чумной Ф1-антиген, нг/мл 0,5 5 5 - 10
Вирус осповакцины, ООЕ/мл 1х104 Н.д. 5х104
Рекомбинантный антиген VP40 вируса Эбола, нг/мл 50 Н.д. 100
Ботулинический анатоксин типа А, нг/мл 150 Н.д. 300
SEB, нг/мл 10 Н.д. 30
Холерный экзотоксин, нг/мл 500 2000 1000
Рицин, нг/мл 30 Н.д. 250
Примечание. Н.д.- нет данных.
Данные эксперимента свидетельствуют о том, что ИХА с использованием квантовых меток при выявлении холерного экзотоксина, Ф1-антигена и клеток чумного микроба по своей чувствительности близок к анализу на основе КЗ, но уступает варианту с ЛЛ. Сравнение свойств ИИХЭ, построенных с применением квантовых меток и ЛЛ, свидетельствует в пользу латексов. К основным недостаткам использования квантовых меток в ИХА можно отнести: относительно низкие величины люминесценции контрольной и аналитической линий в сравнении с фоновой люминесценцией ИХ мембраны, их быстрое выцветание, что затрудняет как визуальную, так и видеоцифровую регистрацию результатов анализа. Из экспериментальных данных, полученных в этой работе, следует, что ИХА с использованием люминесцентных латексных наночастиц является чувствительным и удобным методом анализа, превосходя ИХА на основе КЗ.
1. Lim D.V., Simpson J.M., Kearns E.A. et al. Current and developing technologies for monitoring agents of bioterrorism and biowarfare. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18 (4): 583607.
2. Grunow R., Splettstoesser W., McDonald S. et al. Detection of Francisella tularensis in biological specimens using a capture enzyme-linked immunosorbent assay, an immunochromatographic handheld assay, and a PCR. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2000; 7(1):86-90.
3. Chanteau S., Rahalison L., Ratsitorahina M. et al. Early diagnosis of bubonic plague using F1 antigen capture ELISA assay and rapid immunogold dipstick. J. Med. Microbiol. 2000; 290: 279-283.
4. Shin H. S., Kim C. K., Shin K. S. et al. Pretreatment of whole blood for use in immunochromatographic assays for hepatitis B virus surface antigen. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2001; 8(1):9-13.
5. Dominguez J., Gali N., Matas L. Evaluation of a rapid immunochromatographic assay for the detection of Legionella antigen in urine samples. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1999; 18: 896 - 898.
