CC BY
81
Раздел III
МЕДИЦИНСКАЯ БИОФИЗИКА И РАЗРАБОТКА ЛЕЧЕБНО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ АППАРАТУРЫ
УДК 612.014.462.2
ЛАЗЕРНАЯ КРИОСКОПИЧЕСКАЯ ВИДЕОМИЛЛИОСМОМЕТРИЯ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ МЕДИКО-БИОХИМИЧЕСКИХ И МЕДИКОБИОФИЗИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИЙ
О.В. ГРАДОВ
Институт Химической Физики РАН, г. Москва Группа по биологическим наукам ("наукам о жизни”)
при Обществе индустриальной и прикладной математики, США; Группа по научной обработке и визуализации изображений при
Обществе индустриальной и прикладной математики, США
Аннотмация: в настоящей статье описывается конструкция модернизированного исследовательского прибора на базе криоскопиче-ского термоэлектрического миллиосмометра. Данный прибор позволяет осуществлять динамический / кинетический мониторинг при регистрации депрессии точки кристаллизации. Реализация данной модернизации доступна для любых медицинских исследовательских и клинических лабораторий, обладающих технически грамотным инженерным персоналом. Конфигурация и ресурсоемкость модернизации являются гибкими и зависят от целей предполагаемых биомедицинских исследований. Создаваемый при этом инструмент может рассматриваться как доступная альтернатива дорогостоящим иностранным осмометрам, описываемым во введении настоящей статьи.
Ключевые слова: осмометр-криоскоп, нанолитровый осмометр, лазерная спеклография.
LASER FREEZING POINT DEPRESSION OSMOMETER FOR MEDICAL BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL MEASUREMENTS &
MONITORING
O. V.GRADOV
Institute of Chemical Physics RAS, Moscow SIAM Activity Group on Life Sciences SIAM Activity Group of Imaging
Abstract: This paper describes a design of a new instrument based on a freezing point depression osmometer, which is capable of supporting dynamic monitoring and automatic recording of physico-chemical dynamics/kinetics in osmometry & cryoscopy. The implementation of this upgrade is available for medical and clinical laboratories with regular engineering staff. The configuration and cost of the instrument are flexible and depend on the customer's objectives and the aims of the biomedical research. The proposed instrument is an alternative to costly foreign osmometers (nanoliter osmometers), described in the introduction.
Key words: freezing point depression osmometers, nanoliter osmometer, Laser Speckle Contrast Imaging (LSCI).
Современная криоскопическая осмометрия, базирующаяся на измерении депрессии температуры кристаллизации растворов и биологических жидкостей в миллиосмометрах, позволяющих определять точку замерзания (в ЕС и США подобные приборы называются "freezing point depression osmometers"), представляет собой высокоточный аддитивный метод измерения концентрации осмотически активных веществ в микрообъемах. Методы криоскопиче-ской осмометрии широко используются в медицине, медицинской биохимии и биофизике, а также в соответствующих областях ветеринарии. Так, их используют для: исследования кислотно-
основного и водно-электролитного баланса и оперативного биохимического мониторинга в медицине критических состояний в интенсивной терапии и при реанимации, в анестезиологических измерениях, в глазной фармакохимии и клинической офтальмологии, в экологической физиологии, диагностике бесплодия, иммунологии, надмолекулярной биомеханике, спортивной медицине и допинг-контроле, биомедицинской инженерии при получении структур с программируемыми (заданными) свойствами, клеточной сепарации в лабораторном клиническом анализе и других лабораторноклинических приложениях, а также является весомым диагностическим методом в радиологии, нейротоксикологии и молекулярной кардиологии животных и человека [1-14].
Квинтэссенцией этого подхода является технология нано-литровой осмометрии, при которой измерения производятся в чрезвычайно малых объёмах жидкости и могут быть проведены под микроскопом (рис. 1). Широко распространенными, но устаревающими на данный момент приборами являются Clifton Nanoliter Osmometer и подобные ему приборы с криостатируемыми выносными камерами, что даёт возможность называть их не просто нанолитровыми осмометрами, а биологическими криостатами
- наноосмометрами, как это сделано на корпусе прибора, конст-
руктивно тождественного "Clifton Nanoliter Osmometer" на рис. 2. Конструктивно их камеры представляют собой криогенные микрореакторы или увеличенные аналоги микрофлюидных лабораторий на чипе. Недостаток этих приборов состоит в том, что без микроскопа наблюдение процессов, происходящих в препарате на них невозможно. Это противоречит кинетическому исследованию многих биохимических и криобиофизических процессов при осмометрии-криоскопии in vitro.
Рис. 1. Clifton Nanoliter Osmometer под объективом бинокулярного микроскопа (Environmental Institute of Houston)
Рис. 2. Биологический криостат / нанолитровый осмометр. Наверху - охлаждающая камера для микроскопа
За рубежом решение данной проблемы было найдено с использованием приборов с зарядовой связью, выводящих изображение на видеомонитор, фирмой "Otago Osmometers" (рис. 3). Данная установка позволяет визуализировать процессы, происходящие в образце и микроструктуры морфологии биологических жидкостей, однако она представляет собой завершенный прибор, не пригодный для компактного встраивания в предметные столы на микроскопах. Более того, отсутствуют реальные механизмы сопряжения осмометрических и оптических измерений на таких аппаратах при использовании конфокальной лазерной сканирующей микроскопии или лазерной допплеровской велосимет-рии. Для преодоления этого требуется конструктивная переработка камеры и создание программно-аппаратного комплекса (на базе нанолитрового криостата), работа измерительных средств и механики которого синхронизируется с помощью компьютера и специализированных контроллеров при записи данных измерений в память с аналого-цифровых преобразователей.
В России приборы такого класса не выпускались в принципе, причем как с видео, так и без видеоприставки, однако существовал и сохранился на складах во многих институтах РАН и РАМН такой высокоточный прибор, как миллиосмометр МТ-2, трансформируемый в вышеописанный тип приборов достаточно легко в силу конструктивных особенностей. Данный прибор состоит из погружной измерительной головки, устройства управления ею, позволяющего точно позиционировать её по высоте, малообъёмного термостата, модуля преобразователя, микропроцессорного контроллера и цифрового индикатора. В качестве датчика температур кристаллизации пробы используется полупроводниковый термистор. Кристаллизация индуцируется вибратором, встроенным в управляемую рабочую головку вместе с датчиком температуры. Измерение депрессии температуры кристаллизации МТ-2 производит по отношению к чистому растворителю. Высокий уровень автоматизации на стадиях обработки, пробоподачи и самодиагностики позволяет сравнивать данный прибор с зарубежными аналогами, выпускавшимися в одно с ним время (прибор производился на НПП «Буревестник» до середины 1990-х гг.1), что даёт возможность использовать его как базу для построения экспериментальных установок высокого качества. Микропроцессор, стоящий на борту изделия, позволяет реализовывать несколько режимов работы прибора и визуализации точных данных, полученных при преобразовании напряжения в частоту, что позволяет однозначно сопоставлять картину, визуализируемую на видеомониторе (как на рис. 3) известным значениям результатов осмометрии.
Конструкция установки и принципы работы. Нами была произведена конструктивная доработка головки, заключавшаяся в том, что в неё дополнительно к вышеозначенному наполнению была введена и зафиксирована короткофокусная микровидеокамера, расположенная под углом к погружной конструкции так, чтобы сделать доступной визуализацию наполнения криостати-руемого объёма. Также в головку был введен маломощный (с целью не влиять на охлаждение) лазерный модуль, перемещавшийся по аппликате вместе с камерой. Модуль запитан от стаби-
1 Прибор был удостоен золотой медали Лейпцигской ярмарки и в количестве более 300 штук использовался в Министерстве здравоохранения и лечебных учреждениях Министерства обороны.
лизированного относительно низковольтного источника питания, подводка которого введена через щель, прорезанную в задней стенке короба, прикрывающего головку. Из аналогичной щели был выведен кабель сигнала и кабель блока питания микровидеокамеры. Сигнал камеры подан на выносную плату видеозахвата, коммутированную к компьютеру. Установленное на нем программное обеспечение, помимо утилит захвата, позволяет визуализировать сложные паттерны, регистрирующиеся камерой при взаимодействии лазерного пучка с жидкостью, кристаллизуемой в аппарате. Факультативно в состав установки может быть введен также видеомонитор для наблюдения, как это показано на рис 4. Позитивной стороной, с точки зрения оптики, в этом случае будет дополнительное увеличение массы установки, то есть её оптической стабильности, что, впрочем, и так достигается массой миллиосмометра МТ-2, составляющей примерно 20 кг. Общий вид установки показан схематично на рис. 5. Введение в её состав аналогоцифрового преобразователя позволяет сделать её полностью автоматизированной по отношению к съёму / регистрации сигнала, однако усложняет вид схемы, поэтому он здесь не изображен.
Рис. 3. Осмометр в видеовизуализацией - разработка фирмы "Otago Osmometers"
Рис. 4. Лазерный криоскопический видеомиллиосмометр на базе МТ-2. Конструкция и исполнение автора
Данная схема позволяет реализовать динамические измерения и мониторинг явлений кристаллизации во времени. Проблемным моментом является поверхностный характер её визуализации, связанный с тем, что минимальный объём вливаемого в стандартной форме термостата прибора составляет 200 мкл, однако эта проблема решается путем разработки и изготовления под заказ в мастерских специализированных лунок-кювет под конкретные задачи пользователя. При этом, однако, прибор будет требовать внеочередной калибровки в соответствии с используемыми стандартами, так как заявленные производителем нормы
(предел допустимой систематической составляющей основной приведенной погрешности не более ±0,5% при пределе допустимого среднего квадратичного отклонения случайной составляющей основной приведенной погрешности не более 0,3%) не будут выполняться с достаточной точностью. Либо придется использовать многократные измерения с целью последующего усреднения данных выборки, что сделать также не представляет труда, так как продолжительность измерения (на сохранившихся приборах) составляет порядка двух минут при сравнительно небольшой потребляемой мощности (до 200 Вт за счет установки элемента Пельтье в качестве охладителя).
Рис. 5. Общая схема установки для лазерной криостатной милливидеоосмометрии
Теоретически возможно (это имеет смысл лишь на дефектных или исчерпавших срок эксплуатации миллиосмометрах) развязать механику опускания головки с измерительной системой, заменив исходную конструкцию применением шаговых двигателей с числовым программным управлением с коммутацией на ЬРТ-порт управляющей рабочей станции. В таком случае можно избежать полного погружения головки в лунку, допустив тем самым использование произвольных по размерам резервуаров для анализа. Впрочем, способность достижения требуемого результата зависит от их конфигурации и подгонки под размеры элемента Пельтье. При любых изменениях конструкции прибора, а не установки в целом, следует опираться на работы автора линейки приборов МТ, чтобы не ухудшить в ходе изменений доступное качество измерений. При работе с биологическими объектами и средами в ходе биомедицинских изысканий по криоскопии необходимо придерживаться международных стандартов-протоколов [15,16,17].
Заключение. Таким образом, становится возможным создание на известной высококачественной платформе прибора, способного поддерживать динамические наблюдения и регистрацию динамики / кинетики физико-химических процессов при криоскопии в автоматическом режиме. Реализация подобной модернизации доступна для медицинских и лабораторных клинических структур, обладающих штатным инженерным персоналом. Конфигурация и, следовательно, стоимость данной модернизации являются гибкими и зависящими от задач заказчика или целей биомедицинского исследования. Конструктивно прибор представляет собой альтернативу дорогостоящим зарубежным осмометрам, описанным во введении.
Автор выражает благодарность разработчику отечественных осмометров линеек МТ и ОСКР В.И. Кирсанову за телефонную консультацию по техническим вопросам во время работы над
установкой (в 2010 году), а также зарубежным коллегам, давшим возможность работы с современной зарубежной литературой в ходе подготовки настоящей статьи.
Литература
1. DiBartola, S.P. Fluid, Electrolyte, and Acid-Base Disorders in Small Animal Practice / S.P. DiBartola - St. Louis: Elsevier Saunders, 2011. - 1520 p.
2. Kurtz, I. Acid-Base Case Studies / I. Kurtz - Victoria: Traf-ford Publishing, 2004. - 158 p.
3. Kirby, R.R. Handbook of Critical Care / R.R. Kirby, R.W. Taylor, J.M. Civetta - Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins, 1997-960 p.
4. Magee, P. Fundamentals of Anaesthesia for the FRCA: Physics, Clinical Measurement and Equipment / P. Magee, M. Tooley -Oxford: Oxford University Press, 2011. - 404 p.
5. Elliot, D.B. Clinical Procedures in Primary Eye Care / D.B. Elliot - Edinburg, London, New York, Oxford, Philadelphia, St. Louis, Sydney, Toronto: Butterworth-Heinemann, 2003. - 328 p.
6. Bradshaw, D. Vertebrate Ecophysiology: An Introduction to its Principles and Applications / D. Bradshaw - Cambridge: Cambridge University Press, 2003. - 300 p.
7. Keel, B.A. Handbook of the Laboratory Diagnosis and Treatment of Infertility / B.A. Keel, B.W. Webster - Boca Raton: CRC-Press, 1990. - 448 p.
8. McCullough, K.C. Monoclonal Antibodies in Biotechnology: Theoretical and Practical Aspects / K.C. McCullough, R.E. Spier -Cambridge: Cambridge University Press, 2009. - 400 p.
9. Fung, Y.C. Selected Works on Biomechanics and Aeroelas-ticity / Y.C. Fung - Singapore, London: World Scientific Pub., 1997. - 2008 p.
10. Brouns, F.E. Essentials of Sport Nutrition / F.E. Brouns -Chichester: Wiley, 2002. - 242 p.
11. Ritter, A.B. Biomedical Engineering Principles, Second Edition / A.B. Ritter, V. Hazelwood, A. Valdevit, A.N. Ascione -Boca Raton: CRC Press, 2011. - 540 p.
12. Patel, D. Separating Cells: The Basics / D. Patel - Oxford: BIOS Scientific Publishers, 2000. - 184 p.
13. Hubbard, J.D. A Concise Review of Clinical Laboratory Science / J.D. Hubbard - Baltimore: Lippincott Williams & Wilkins, 1997. - 545 p.
14. Arneson, W. Clinical Chemistry: A Laboratory Perspective / W. Arneson, J. Brickell - Philadelphia: F.A. Davis Company, 2007.
- 582 p.
15. Кирсанов, В. И. Разработка и исследование технических средств измерения концентраций осмотически активных веществ в биологических жидкостях и водных растворах: Автореф. дисс. к. т. н. / В.И. Кирсанов - М., 1986. - 14 с.
16. Кирсанов, В. И. Установка для определения концентрации осмотически активных веществ в биологических жидкостях. / Кирсанов В.И., Монин Ю.Г., Соколова М.М. // Физиологический журнал СССР. 1976. - T.XII, № 10. - С. 1546-1548.
17. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols. - Humana Press, 2010. - 360 p.
УДК 616.12 - 008.331.1 - 073.7
ВОЗМОЖНОСТИ МЕТОДА ГРВ-БИОЭЛЕКТРОГРАФИИ В ДИАГНОСТИКЕ АКТИВНОСТИ ПРАВОГО ПОЛУШАРИЯ МОЗГА У БОЛЬНЫХ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТОНИЕЙ
И.Е. КОРОБКА*, Е.Г. ЯКОВЛЕВА*, К.Г. КОРОТКОВ**,
С.С. БЕЛОНОСОВ*, Т.В. ЗАРУБИНА*
* Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова, ул. Островитянова д. 1, г. Москва Санкт-Петербургский государственный университет информационных технологий механики и оптики, пр. Кронверкский, д. 49, г. Санкт-
Петербург
Аннотация: обследовано 138 пациентов (32 практически здоровых и 106 больных артериальной гипертонией) в возрасте от 20 до 70 лет с помощью методов газоразрядной визуализации (ГРВ) и кардиоинтервалографии. Проведенный анализ данных выявил статистически значимо различающиеся параметры ГРВ у больных артериальной гипертонией и здоровых испытуемых, при этом у больных артериальной гипертонией обнаружено преобладание количества значимо различающихся ГРВ-параметров на левой руке. Значения медиан полученных
