Лабораторная медицина как основа персонализированной медицины. Применение биочипов в медицине

Щербо Сергей Николаевич; Щербо Д.С.

Биохимия

Щербо С.Н., Щербо Д.С.

лабораторная медицина как основа персонализированной медицины. применение Биочипов в медицине

ГБОУ ВПО Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Институт биоорганической химии РАН, Москва

Разработка и применение биочипов дают возможность радикально трансформировать лабораторную медицину, проводить исследования массивов биомаркеров, реализуя подходы и представления персонализированной медицины. Рассмотрены основные области применения микробиочипов в лабораторной медицине: лабораторная диагностика, классификация и прогноз течения заболеваний, анализ механизмов биологических процессов. Перспективным направлением в использовании биочипов является идентификация наследственных мутаций в геноме человека, вызывающих различные заболевания, прежде всего онкологические и ответственных за биотрансформацию лекарственных средств, в частности применяемых в химиотерапии опухолей, а также одновременное выявление различных инфекционных агентов (вирусы, микроорганизмы, грибы и т.д.) и их антибиотикорезистентных форм. Показана роль биочипов как инструмента в генетических исследованиях, технологии генотипирования, широкомасштабных международных проектах исследований полногеномного скрининга ассоциаций (GWAS).

Ключевые слова: биочипы; персонализированная медицина; генотипирование; фармакогенетика. S.N. Scherbo1, D.S. Scherbo2

the laboratory medicine as a foundation for personalized medicine. the application of biochips in medicine

1The N.I. Pirogov Russian national research medical university Minzdrav of Russia, 117997 Moscow, Russia; 2The institute of bio-organic chemistry of the Russian academy of sciences, Moscow, Russia

The development and application of biochips provide possibility to drastically transform laboratory medicine and to implement studies of arrays of biomarkers realizing approaches and concepts of personalized medicine. The main areas of application of microbiochips in laboratory medicine such as laboratory diagnostic, classification and prognosis of course of diseases, analysis of mechanisms of biologic processes are considered. The identification of inherent mutations in human genome is considered as perspective direction. These mutations cause various pathology and first of all oncologic diseases responsible for biotransformation of pharmaceuticals applied in chemotherapy of tumors in particular and also simultaneous identification of various infection agents (viruses, microorganisms, fungi, etc.) and their antibiotic-resistant forms. The role of biochips as a tool is demonstrated in genetic studies, technologies of genetic typing, large-scale international projects of studies of genome-wide screening of associations (GWAS).

Keywords: biochip, personalized medicine, genetic typing, pharmacogenetics

В лабораторной медицине можно выделить три основные области применения микробиочипов: лабораторная диагностика, классификация и прогноз течения заболеваний, анализ механизмов биологических процессов и патогенез заболеваний.

1. Лабораторная диагностика и классификация заболеваний. Биочипы в лабораторной диагностике применяются в акушерстве и гинекологии [2], вирусной неона-тологии [7], онкогематологии [8], онкологии: при раке яичников [10], лимфопролиферативных заболеваниях [9] и др. Наиболее доступными для клинического применения являются Genechip (Affymetrix) и Amplichip cyp450 (Roche), которые были одобрены регулирующими органами для продажи в США и ЕС, испытаны в диагностических лабораториях в 2004 г. На микробио-

Для корреспонденции:

Щербо Сергей Николаевич, д-р биол. наук, проф., зав. каф. клин. лаб.

диагностики

E-mail: [email protected]

чипах реализуется высокое покрытие известных на сегодняшний день аннотированных генов человека (база данных генов Refseq) до 10 млн отдельных зондов, связанных с однонуклеотидными полиморфизмами (ОНП). Кардиочип, разработанный в Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта (ИМБ РАН), способен определять одновременно восемь ОНП семи генов (REN, AGT, AGTn, AGTR2, BKR2, MTHFR, ADRB2), что значительно сокращает время процедуры и снижает себестоимость анализа для выявления степени риска развития сердечно-сосудистых патологий. С помощью микрочипа с использованием капиллярного электрофореза разработан метод очень быстрого анализа (несколько секунд) для диагностики онкологических, сердечнососудистых, инфекционных заболеваний [32]. Для анализа с белковыми чипами в качестве образцов могут использоваться сыворотка, плазма, моча, экстракты ткани или клеточные лизаты; достигнута высокая чувствительность анализа, составляющая пикограммы в 1 мл: метод используется для диагностики онкологических и других заболеваний [46]. Созданы биочипы для обна-

ружения предрасположенности пациентов к некоторым онкологическим заболеваниям, выявления чувствительности к лекарственным препаратам.

Перспективным направлением в использовании биочипов является идентификация наследственных мутаций в геноме человека, вызывающих различные заболевания, прежде всего онкологические и ответственных за биотрансформацию лекарственных средств, применяемых главным образом в химиотерапии опухолей. К первой категории микрочипов можно отнести микрочипы для идентификации хромосомных перестроек, вызывающих острый лимфобластный или миелобластный лейкоз у детей, а также микрочип для выявления пяти наиболее распространенных мутаций в гене ВЯСА1, увеличивающих риск рака молочной железы и некоторых других онкологических заболеваний [5]. Соматические мутации в гене KRАS являются важными маркерами некоторых видов опухолей, например рака поджелудочной железы, и могут применяться для ранней диагностики этого заболевания. Разработан биологический микро-чип, позволяющий выявить 13 наиболее частых мутаций [5]. Метод с использованием биочипов позволяет с высокой достоверностью обнаруживать мутации в гене, если доля клеток, несущих мутацию, составляет не менее 1%. Генетическая субквалификация онкологических заболеваний и отдаленных клинических последствий проводились для меланомы [63], детской лейкемии [61] и рака яичников [49].

В последние годы биочипы активно разрабатываются и применяются в вирусологии и микробиологии [36, 66]. В ИМБ РАН проведена разработка диагностических олигонуклеотидных микрочипов: для диагностики М. tuberculesis и устойчивых к антибиотикам рифампицину и изониазиду форм патогена [1], возбудителей сибирской язвы и чумы, видовой принадлежности вирусов оспы и их отличия от возбудителей других заболеваний, сходных по клинической картине [6], для идентификации вирусов СПИДа [45] и гепатитов В и С в плазме крови, для обнаружения вируса птичьего гриппа Н5Ш и других субтипов вируса гриппа типа А. В настоящее время предложены новые молекулярно-биологические тесты, предназначенные для определения активности ВПЧ и оценки ближайших перспектив течения инфекционного заболевания, которые подразделяются на две группы: с помощью одних изучают компоненты продукции вируса папилломы, с помощью других - компоненты клетки-хозяина. Примером первых служит РгеТей ВПЧ-Proofer (ПогСЫр), разработанный для определения полноразмерной мРНК генов Е6 и Е7 ВПЧ, присутствие которой в клиническом материале, как полагают, ассоциировано с повышенным риском неопластической прогрессии. Технология основана на том, что клетки с интегрированной ДНК онкогенных типов ВПЧ производят онкоген-ные белки и экспрессируют соответствующую мРНК, что подтверждается многочисленными исследованиями, в которых участвовало около 60 000 женщин. РгеТей-детекция основана на использовании двух ключевых технологий: амплификационной технологии NАSВА и амплификации в режиме реального времени. Вместе эти технологии позволяют быстро и специфично определить носительство ВПЧ 16, 18, 31, 33 и 45 (перекрывающие, по данным разработчиков, 97-99% случаев возникновения рака в Европе, Северной Америке и Австралии). РгеТей НPV-Proofer детектирует РНК, экспрессирую-щиеся с областей Е6 и Е7 вирусного генома, причем Е6/ Е7 мРНК присутствует, если вирус активно продуцирует онкогенные белки. При применении РгеТей НР^

Proofer достигнута специфичность 90%. Результаты клинических исследований показали, что совместно с цитологическими исследованиями PreTect HPV-Proofer дает чувствительность 100% и специфичность 97%. Согласно данным норвежских ученых, у 35% женщин, заболевших раком, результаты цитологического исследования за 2 года до заболевания были в норме, а PreTect HpV-proofer, по-видимому, дает возможность обнаруживать изменения за 5-15 лет до злокачественного перерождения клеток. Проведена детекция Е6/Е7 мРНК экспрессия с использованием набора PreTect HPV-Proofer для ВПЧ высокого онкогенного риска и сравнение полученных результатов с вирусной нагрузкой, определяемой количественной ПЦР в режиме реального времени, для 80 клинических образцов; полученные обоими методами результаты оказались близкими. [15]. Разработан биочип ВПЧ EasyChip HPV блот, который применен для идентификации 39 типов папилломавирусов при анализе 89 цервикальных образцов [33]. Чувствительность метода составляла 1-50 копий геном/эквивалент.

В последние годы проводятся интенсивные разработки молекулярно-генетических диагностических технологий на основе биочипов в микологии, например для идентификации клинически значимых грибов [26]. Проводили амплификацию с использованием универсальных праймеров, а затем продукт ПЦР гибриди-зовался с биочипом. Исследовано 122 образца, в том числе стандартные культуры и клинические изоляты с олиго-нуклеотидными зондами, принадлежащими восьми видам грибов. Биочип успешно определял грибные патогены с высокой специфичностью и чувствительностью (15 пг/мл). Микрочип, основанный на технологии Arrayed-primer extension (APEX) [18] использован для анализа 24 штаммов 10 видов патогенных грибов, включая кандиды, трихофитон и др., а олигонуклеотидные зонды выбраны на область ITS1 и ITS2. Указанная технология дает возможность дифференцированной диагностики таких близкородственных штаммов кандиды, как c. parapsilosis, C. orthopsilosis и C. metapsilosis. Группой немецких авторов разработан метод, основанный на комбинации мультипраймерной ПЦР и гибридизации на биочипах, для анализа 14 грибных патогенов в крови, бронхоальвиальном лаваже и образцах ткани от пациентов с высоким риском иммунодефицитных состояний [56].

Разработаны и используются биочипы для диагностики урогенитальных инфекций [64], исследована экспрессия генов цитомегаловируса (ЦМВ), который имеет больший геном, чем другие герпес-вирусы. Известно 52 серотипа аденовируса, которые ответственны за гастроэнтерологические, глазные и респираторные (серотипы 1-7, 14, 17) заболевания. С использованием олигонуклео-тидного биочипа исследованы респираторные аденовирусы человека и астровирусы [15, 30]. В ГНЦ дерматологии и косметологии разработаны и запатентованы ДНК-чипы для одновременной идентификации облигат-ных патогенов (N. gonorrhoeae, C. trachomatis, T. vaginalis, M. genitalium, Human herpes virus 1, 2, T. рallidum), а также условно-патогенных возбудителей ИППП [6]. Микробиочипы дали возможность идентификации микроорганизмов без предварительного культивирования и некультивируемых форм, проводить одновременную идентификацию широкого набора возбудителей ИППП. Созданы белковые биочипы для идентификации: гепатитов В и С [11], ЦМВ, вируса простого герпеса и ВИЧ. Создан микробиочип для одновременного определения реагиновых и трепонемоспецифических антител к

T. pallidum на альдегидных слайдах с флюоресцентной детекцией [6].

2. Прогноз течения заболеваний. Прогноз эффективности и безопасности применения лекарственной терапии, особенно при наличии рисков (химиотерапия), является проблемой в фармакологии. Кроме того факторы предсказания прогноза течения заболевания, такие как размер опухоли, статус узла лимфы и статус рецептора эстрогена, для онкологических пациентов нельзя считать совершенными. Микрочипы дают возможность радикально изменить медицину: от традиционного подхода перейти к индивидуализированному. Проведено несколько экспериментов с биочипами и различными типами онкологических заболеваний, которые показали, что транскриптом может служить перспективный биомаркер с учетом того, что небольшие изменения профиля экспрессии генов могут приводить к драматическим биологическим изменениям и наоборот. К тому же профиль генетической экспрессии не постоянен и зависит от многих, в частности, физиологических факторов и потребляемых продуктов. Анализ экспрессии генов с применением биочипов требует валидации с использованием нозерн-блоттинга или ПЦР с детекцией в режиме реального времени (ПЦР РВ). РНК после выделения неустойчива, поэтому разработана технология, препятствующая деградации РНК DASL (cDNA-mediated, annealing, selection, extension and ligation) [20].

Сравнение гибридизации образцов зондов из здоровых и раковых клеток с одинаковыми копиями микрочипов позволяет идентифицировать по-разному экспресси-рующиеся гены. Более четкие результаты получаются, если метить два указанных образца из печени разными флюорофорами (красным и зеленым). Соотношение сигналов, полученных от каждого из флюорофоров, дает возможность провести сравнительный анализ уровней экспрессии одних и тех же генов в разных образцах. Если микрочип сканировать при двух длинах волн излучения, а затем с помощью компьютера накладывать два полученных изображения, то ячейки, соответствующие различным образом экспрессирующимся генам, будут иметь либо зеленый, либо красный цвет, при одинаковом уровне экспрессии генов - желтый цвет. С помощью экспрессионных биочипов можно изучать молекулярные механизмы и проверять действие различных лекарств [19], при этом показания и противопоказания к применению препаратов можно выявить на индивидуальном уровне. Применяя микрочипы, можно исследовать отклик организма на различные воздействия, вести подбор антисмысловой ДНК для целей генной терапии.

Наибольшие успехи в применении микробиочипов для классификации и прогноза течения заболеваний достигнуты в области онкологии: идентификация наследственных мутаций, которые вызывают онкологические заболевания. Национальный институт рака провел работу по типированию 60 видов различных раковых клеток с использованием чипа, содержащего 9703 кДНК. Характер генетической экспрессии менялся в соответствии с происхождением ткани. Общий подход должен идентифицировать профиль транскрипции, который может классифицировать тип опухоли и затем найти корреляции между этим субтипом и прогнозом течения заболевания [44].

Клиническое применение профилей транскрипции, получаемых с помощью биочипов, наиболее детально разработано для рака молочной железы [44] и представлено в обзоре [52]. Сообщалось о молекулярной классификации, основанной на характере экспрессии 65

образцов аденокарциномы молочной железы от 42 пациентов, с использованием кДНК микробиочипа [39]. В зависимости от характера экспрессии генов образцы раковых клеток были разделены на четыре субтипа. Первый клинически важный субтип (Erb-B2 Her2/neu) был уже известен до проведения исследования, а три других неизвестны: эстроген-рецептор генетически позитивный, базальный и нормальный рак молочной железы. В дополнение к предложенной классификации авторы показали важную роль происхождения клеток при оценке характера экспрессии генов, что было проиллюстрировано изменением характера экспрессии раковых клеток до и после химиотерапии.

М Van't и соавт. [60] использовали олигонуклеотид-ные биочипы для анализа первичных опухолей от 117 пациентов с начальной стадией рака, не затрагивающего лимфатические узлы, и оценивали профиль экспрессии 70 генов, которые предсказывают образование метастазов. В дальнейшем при обследовании 295 пациентов профиль генетической транскрипции превосходил используемые клинические предикторы и давал возможность более точно классифицировать пациентов по опасности отдаленных метастазов. Например, в соответствии с профилем большее количество пациентов попало в группу с низким риском метастазов (40%) по сравнению с таковыми при использовании традиционных клинических критериев (15%), что в последующем подтверждено на независимой группе пациентов из пяти европейских центров [17]. Таким образом, было определено 70 генов-предикторов идентификации возможности образования метастазов с 80% чувствительностью и специфичностью.

Результаты работ были проверены с помощью чипа Mammaprint для возможного клинического использования, что послужило основой для клинического испытания MINDAcT (Microarray In Node negative Disease may Avoid chemoTherapy), целью которого является определение возможности использовать профиль транскрипции для принятия клинического решения [40]. В будущем анализы изменения экспрессии совместно с гистопатологическими исследованиями будут внедрены в клиническую практику, что даст возможность минимизировать ошибки при выборе терапии. Метод TAILoRx (Trial Assigning Individualized options for Treatment) испытан в Северной Америке и недавно включен американским обществом клинических рекомендаций по онкологии для использования в качестве инструмента для анализа маркеров опухоли [55]. Появляется возможность идентифицировать (рецептор эстрогена положительный) рак молочной железы и возможность применения тамоксифена, спасая пациентов от потенциально токсичной химиотерапии. Результаты испытания метода TAILoRx будут ключевыми для определения, каким образом можно эффективно включить полученную информацию в лечение рака молочной железы на ранней стадии. В группе из 55 пациентов с различными субтипами рака молочной железы исследован профиль экспрессии около 1000 генов и проведено популяцион-ное исследование отдаленных аспектов протекания рака молочной железы и прогноза на основе генетического анализа [53].

Нередко формы рака трудно различить, используя традиционные диагностические методы, например, острая миелоидная лейкемия и острая лимфобластоидная лейкемия, которые по-разному реагируют на лекарственную терапию. Одиночные маркеры, используемые в традиционных тестах, не дают 100% надежности диагноза. Ме-

тод микробиочипов включает анализ около 50 профилей генной экспрессии и обеспечивает существенно большую степень дифференцировки указанных заболеваний. Хотя различия для типов лейкемий гистологически мало заметны, показаны изменения в профиле генетической экспрессии при исследовании профиля экспрессии 6817 генов от 72 пациентов с лейкемией [21].

Была проведена работа по прогнозу течения В-клеточной лимфомы (DLBCL) с использованием специально сконструированного Лимфочипа. На чип наносилась кДНК генов как преимущественно экспресси-рующихся в лимфоидных клетках, так и с известной ролью в иммунологических и онкологических процессах [12]. Известно, что только 40% пациентов с неходжкин-ской лимфомой отвечают на современную терапию. С помощью ДНК микрочипов обнаружено два ранее нераспознаваемых подтипа болезни, которые соответствуют различным клиническим исходам и ответам на лекарственную терапию и не различаются при анализе с использованием традиционных гистологических или иммуногистохимических подходов. Для рака простаты показано изменение профиля экспрессии биопсийного материала нормальных и раковых клеток и установлено, что 1,5% измеренных генов меняют характер экспрессии после хирургического вмешательства (биопсия и ткани из удаленных простат) в сторону возрастания производства белков и регуляторов клеточной пролиферации, установлены ассоциации вариантов генома с раком простаты [22]. Определена экспрессия генов и при гепато-циркулярной карциноме [25]. В целом наблюдается тенденция к переходу от чипов с тысячами генов к чипам с сотнями генов, отобранных специально для решения конкретной задачи. В последние годы достигнуты большие технологические успехи в экспрессионных чипах, подход, известный как «РНК-seq» [63].

Часть транскриптома включает небольшие (порядка 22 нуклеотидов) не кодирующие микро-РНК (микРНК), которые играют важную роль в регуляции экспрессии генов при деградации мРНК и ингибировании их трансляции. При раке показано, что профиль микРНК в нормальных и раковых клетках в значительной степени различается, причем возможна дифференцировка онкологических заболеваний, невозможная обычными методами [34]. Микрочипы на основе кДНК использовались и в диагностике различных заболеваний, таких как шизофрения [37], множественный склероз [29], и в дифференцировке ишемической и неишемической кар-диомиопатии [28], ревматоидного артрита и болезни Крона [24], старения [35].

3. Выбор и мониторинг лекарственной терапии. Чипы активно используются в фармакологии, что отражено в ряде обзоров [16, 42]: опубликован протокол применения биочипов GenenChip для фармакологических исследований [16]. Биочип AmpliChip CYP450 содержит более 15 000 различных олигонуклеотидпых зондов, чтобы анализировать как смысловые, так и антисмысловые последовательности образца амплифицированной целевой ДНК. Практически все известные полиморфизмы и аллели CYP2D6 и два наиболее часто встречающихся для CYP2C19 могут быть обнаружены одновременно. AmpliChip CYP450 обеспечивает всесторонний охват вариаций генов, которые играют роль в метаболизме примерно 25% всех лекарственных препаратов. Набор Affymetrix® DMET™ Plus Premier (DMET - Drug Metabolizingnzymes and Transporters) позволяет выявить полиморфизмы генов с помощью биочипа, который включает маркеры 225 генов, документирующих функ-

циональное значение первой и второй фаз метаболизма и транспорта лекарств, в частности варфарина и хлор-гидрогеля. Предлагаемый ИМБ РАН фармакогенетиче-ский биочип анализирует 14 полиморфизмов известных генов детоксикации, открывается возможность подбора оптимальных лекарственных препаратов и их доз для лечения широкого круга больных. Разработан биологический микрочип для обнаружения 16 точечных мутаций гена NAT2, сочетания которых определяют 36 аллелей и 660 генотипов, которые делятся на 4 группы по фенотипу ацетилирования: быстрого, промежуточного и медленного ацетилирования [4]. Активность фермента тиопурин^-метилтрансферазы определяет чувствительность больных к некоторым химиотерапевтическим и иммуномодулирующим средствам; создан микрочип, который выявляет семь распространенных мутантных аллелей этого гена.

Исследовано изменение профиля генетической экспрессии более чем 1500 генов при применении девяти наиболее часто используемых противораковых препаратов: авторы идентифицировали набор генов, которые ассоциируются с чувствительностью к химиотерапии ряда раков (молочной железы, легких и колоректального) [65]. Эффективность предсказания ответа на терапию показана для 20 образцов от онкологических больных и при исследовании лейкемии. Алгоритм исследования ответа пациента на химиотерапию включает белковый и генетический анализ профиля фосфорилированных белков, а также экспрессию генов с использованием биочипов. Национальным институтом здоровья исследовано 60 раковых клеточных линий (NCI60) и воздействие на них более 70 000 различных веществ с помощью транскрипционных биочипов [48]. Применение биочипов, содержащих трехмерные культуры клеток различных тканей, позволяет избежать тестирования лекарственных и косметических препаратов на животных. В 2007 г. в научном журнале PNAS были опубликованы данные о DataChip, состоящем более чем из 1080 трехмерных культур клеток человека. MetaChip моделирует реакции, происходящие в человеческом организме. При комбинировании двух чипов можно подобрать не только сам препарат, но и его максимально эффективную концентрацию.

4. Биочипы как инструмент в широкомасштабных генетических исследованиях и технологии генотипиро-вания. Использование биочипов в постгеномный период развития медицины связано с участием ведущих фирм-производителей в крупных международных проектах исследований полногеномных ассоциаций (GWAS). Основной задачей становится определение изменений в геноме, которые связаны с фенотипом или характерны для определенного заболевания. Необходим доступ к базам данных, в которых собраны достаточные массивы информации, и учет популяционных особенностей геномов различных групп [43]. Дизайн современных проектов персонализированной медицины с использованием биочипов можно проиллюстрировать на примере проекта поиска вариаций числа генетических копий (CNV) у больных аутизмом и психозами с ранним началом (предполагается провести на большой выборке, численность которой составит не менее 4000 больных и 30 000 человек контрольной группы). Возможность эффективного поиска редких вариабельных последовательностей появилась после разработки фирмой deCODE genetics, являющейся координатором проекта, микрочипа Human CNV370, который позволит выявлять десятки тысяч последовательностей ДНК. Эта уникальная разработка, включающая в себя

высокотехнологичное программное обеспечение, является одной из наиболее эффективных в мире для анализа вариабельных последовательностей ДНК. Исследование позволит выявить 40 000 редких вариантов CNVs, потенциально представляющих высокий риск для развития исследуемых патологий, а также 5000 распространенных CNVs и 320 000 ОНП, связанных с умеренным риском. Далее будет отобран 1% от всех изученных вариабельных последовательностей для более подробного исследования с применением самых современных молекулярно- и цитогенетических методов. Будет сделана попытка установить причинно-следственную связь между вариантами повышенного риска и фенотипическими проявлениями. Затем предполагается изучение экспрессии выявленных генов, а также проведение исследований на животных с выключенной функцией этих генов [3]. Для исследования аутизма и других нейропсихиатрических заболеваний применяли метод сравнительной геномной гибридизации с использованием микробиочипа.

Участие Affymetrix в проекте Parsis в Индии приведет к лучшему пониманию генетических причин долголетия и старения. Использование технологии Affymetrix позволит исследователям связать генетические полиморфизмы и старение, так же как нейродегенеративные изменения, возникновение рака молочной железы, диабета и других сложных мультифакторных заболеваний. В 2008 г. scripps Translational Science Institute (STSI), Navigenics, Affymetrix и Microsoft предприняли исследование продолжительностью в десятилетие, чтобы определить долгосрочные поведенческие эффекты личного генетического тестирования для 10 000 служащих системы здравоохранения scripps. В конечном счете исследователи надеются определить, побуждает ли участие в личном геномном тестировании людей соответствующим образом изменять их диету, образ жизни и т. п. Были проведены масштабные исследования по изучению геномов пациентов с различными заболеваниями: диабет 1-го и 2-го типов [23, 54], колоректальный рак [59] и рак простаты [57], рак легких [13], астма [38], ожирение [58], хронические обструктивные заболевания легких [62], атеросклероз [47], сердечно-сосудистые заболевания [27], тромбозы [41], болезнь Паркинсона [51] и Альцгеймера [31]. В последние годы активно применяются нанотехнологии при создании микробиочипов. Разработана новая запатентованная микрочиповая нано-технология ClearRead корпорации Nanosphere с применением наночастиц золота для исследования ОНП, которая обладает более чем 99% достоверностью и может использоваться для ДНК человека, полученной из образцов размером с каплю крови. Было проведено генотипирование трех генов: фактора V, фактора II и MTHFR. Технология от Nanosphere позволяет быстро, просто и точно геноти-пировать любые последовательности ДНК на наличие ОНП для выявления генетических заболеваний, предрасположенности к мультифакторным болезням, а также для прогнозирования метаболического ответа на фармакологические препараты [50].

ЛИТЕРАТУРА

1. Антонова О.В., Грядунов Д.А., Лапа С.А. и др. Выявление мутаций в геноме Mycobacterium tuberculosis, приводящих к устойчивости к фторхинолонам, методом гибридизации на биологических микрочипах. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2008; 145(1): 115-20.

2. Глотов О.С. Биочипы как новый метод ДНК диагностики в акушерстве и гинекологии. Медицинская генетика- 2007; 6(4): 30-4.

3. Голимбет В.Е., Корень Е.В. Вариации числа копий в геноме -новая страница в генетических исследованиях в области психиа-

трии: международный проект PsychCNVs. Клиническая психиатрия. 2010; 110(1): 107-9.

4. Гра О.А., Глотов А.С., Кожекбаева Ж.М. и др. Генетический полиморфизм GST, NAT2 и MTRR и предрасположенность к развитию острого лейкоза у детей. Молекулярная биология. 2007; 42(2): 1-13.

5. Емельянова М.А., Амосенко Ф.А., Чудинов А.В. и др. Детекция KRAS мутаций в раковых клетках с использованием биочипов. Молекулярная биология. 2011; 45(5): 863-70.

6. Кубанова А.А., Кубанов А.А., Лесная И.Н. и др. Заявки на патенты: № 2010113247/10(0186280), № 21010113246/10(018627); 2009140661. Патент RU № 2394496 С1.

7. Мызникова А.И., Файзуллин Л.З., Захарова Н.В. и др. Олиго-нуклеотидные биочипы в диагностике неонатальных вирусных инфекций. Вопросы практической педиатрии. 2006; 1: 61-4.

8. Наседкина Т.В. Использование биологических микрочипов в он-когематологии. Онкогематология. 2006; 1-2: 25-37.

9. Наседкина Т.В., Гусева Н.А., Митяева О.Н. и др. Микрочипы в диагностике лимфопролиферативных заболеваний. Молекулярная медицина. 2007; 3: 54-60.

10. Федорова О.Е., Любченко Л.Н. и др. Использование биочипов при изучении распространенных мутаций в генах BRCA1/2 и CHEK2 у больных органоспецифическим раком яичников и первично-множественным злокачественными новообразованиями с поражением яичников (российская популяция). Молекулярная биология. 2007; 41(1): 37-42.

11. Чеканова Т. А., Маркелов М.Л., Манзенюк И.Н. и др. Разработка иммуночипа для раздельной детекции антител к вирусу гепатита С. Клиническая лабораторная диагностика. 2008; 6: 25-30.

12. Alizadeh A.A., Eisen M.B., Davis R.T. et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 2000; 403(6769): 503-11.

13. Amos C.I., Wu X., Broderick P. et al. Genome-wide association scan of tag SNPs identifies a susceptibility locus for lung cancer at 15q25.1. Nat. Genet. 2008; 40(5): 616-22.

14. Andersson S., Hansson B., Norman I. et al. Expression of E6/E7 mR-NA from 'high risk' human papillomavirus in relation to CIN grade, viral load and p16INK4a. Int. J. Oncol. 2006; 29(3): 705-11.

15. Brown D.W., Gunning K.B., Henry D.M. et al. A DNA oligonucleotide microarray for detecting human astrovirus serotypes. J. Virol. Methods. 2008; 147(1): 86-92.

16. Burmster J.K., Srdova M., Shapero M.H., Mansfield E. DMET mi-croarray technology for pharmacogenomics-based personalized medicine. MethMol. Biol. 2006; 632(1): 99-124.

17. Buyse M., Loi S., van't Veer L. et al. Validation and clinical utility of a 70-gene prognostic signature for women with node-negative breast cancer. J. Natl. Cancer Inst. 2006; 98(17): 1183-92.

18. Campa D., Tavanti A., Gemignani F. et al. DNA microarray based on arrayed-primer extension technique for identification of pathogenic fungi responsible for invasive and superficial mycoses. J. Clin. Microbiol. 2008; 46(3): 909-15.

19. Evertsz E., Starink P., Gupta R., Watson D. Technology and applications of gene expression microarrays. In: Schena M., ed. Microarray Biochip Technology. Natick, MA: Eaton Publ.; 2000: 149-66.

20. Fan J.B., Yeakley J.M., Bibikova M. A versatile assay for high-throughput gene expression profiling on universal array matrices. Genome Res. 2004; 14(5): 878-85.

21. Golub T. R., Slonim D. K., Tamayo P., et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science. 1999; 286(5439): 531-7.

22. Gudmundsson J., Sulem P., Rafnar T. et al. Common sequence variants on 2p15 and Xp11.22 confer susceptibility to prostate cancer. Nat. Genet. 2008; 40(3): 281-3.

23. Hakonarson H., Grant S. F., Bradfield J. P. A genome-wide association study identifies KIAA0350 as a type 1 diabetes gene. Nature. 2007; 448: 591-4.

24. Heller R. A., Schena M., Chai A., et al. Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997; 94: 2150-5.

25. Hoshida Y., Villanueva A., Kobayashi M. et al. Gene expression in fixed tissues and outcome in hepatocellular carcinoma. N. Engl. J. Med 2008; 359(19): 1995-2004.

26. Huang A., Li J.-W., Shen Z.-Q., Wang X.-W., Jin M. High-throughput

identification of clinical pathogenic fungi by hybridization to an oligonucleotide microarray. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(9): 3299-305.

27. Kaynak B., von Heydebreck A., Mebus S. et al. Genome-wide array analysis of normal and malformed human hearts. Circulation. 2003; 107: 2467-74.

28. Kittleson M.M., Ye S.Q., Irizarry R.A. et al. Identification of a gene expression profile that differentiates between ischemic and nonischemic cardiomyopathy. Circulation. 2004; 110(22): 3444-51.

29. Lock C., Hermans G., Pedotti R. et al. Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions yields new targets validated in autoimmune encephalomyelitis. Nat. Med. 2002; 8(5): 500-8.

30. Lopes-Campos G., Coiras M., Sanches-Merino J. P. et al. Oligonucleotide microarray design for detection and serotyping of human respiratory adenoviruses by using a virtual amplicon retrieval software. J. Virol. Methods. 2007; 145(2): 127-36.

31. Li H., Wetten S., Li L. et al. Candidate single-nucleotide polymorphisms from a genomewide association study of Alzheimer disease. Arch. Neurol. 2008; 65(1): 45-53.

32. Li S.F.Y., Kricka L.J. Clinical analysis by microchip capillary electrophoresis. Clin. Chem. 2006; 52(1): 37-45.

33. Lin C.-Y., Chen H.-C., Lin R.-W. Quality assurance of genotyping array for detection and typing of human papillomavirus. J. Virol. Methods. 2007; 140(1-2): 1-9.

34. Lu J. Getz G., Miska E. A. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 2005; 435(7043): 834-8.

35. Ly D. H., Lockhart D. J., Lerner R. A.et al. Mitotic misregulation and human aging. Science. 2000; 287(5462): 2486-92.

36. Miller M. D., Tang Y-W. Basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology. Clin. Microbiol. Rev. 2009; 22(4): 611-33.

37. Mirnics K., Middleton F. A., Marquez A. et al. Molecular characterization of schizophrenia viewed by microarray analysis of gene expression in prefrontal cortex. Neuron. 2000; 28(1): 53-67.

38. Moffatt M.F., Kabesch M., Liang L. et al. Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma. Nature. 2007; 448(7152): 470-3.

39. Perou C. M., Sorlie T., Eisen M. B. et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2000; 406(6797): 747-52.

40. Novak K. N. Where the chips fall. Nat. Med. 2006; 12(2): 158-9.

41. Potti A., Bild A., Dressman H.K. et al. Gene-expression patterns predict phenotypes of immune-mediated thrombosis. Blood. 2006; 107(4): 1391-6.

42. Potti A., Dressman H. K., Bild A. et al. Genomic signatures to guide the use of chemotherapeutics. Nat. Med. 2006; 12(11): 1294-300.

43. Price A.L., Pattersoon N.J., Plenge R.M. et al. Principal components analysis corrects for stratification in genome-wide association studies. Nat. Genet. 2006; 38(8): 904-9.

44. Quackenbush J. Microarray analysis and tumor classification. N. Engl. J. Med. 2006; 354(23): 2463-72.

45. Rudinskii N.I., Mikhailovich V.M., Donnikov M.I. et al. Development of microchips for the detection of mutations of HIV-1 variability to protease inhibitors and the usage results. Vopr. Virusol. 2004, 49(6): 10-5.

46. Sanchez-Carbayo M. Antibody array-based technologies for cancer protein profiling and functional proteomic analyses using serum and tissue specimens. Tumour Biol. 2010; 31(2): 103-12.

47. Seo D., Wang T., Dressman H. et al. Gene expression phenotypes of atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2004; 24(10): 1922-7.

48. Scherf U., Ross D. T., Waltham M. et al. A gene expression database for the molecular pharmacology of cancer. Nat. Genet. 2000; 24: 236-44.

49. Schwartz D.R., Kardia S.L., Shedden K.A. et al. Gene expression in ovarian cancer reflects both morphology and biological behavior, distinguishing clear cell from other poor-prognosis ovarian carcinomas. Cancer Res. 2002; 62(16): 4722-9.

50. Shen Y., Irons M., Miller D. T., Cheung S. W. et al. Development of a focused oligonucleotide-array comparative genomic hybridization chip for clinical diagnosis of genomic imbalance. Clin. Chem. 2007; 53(12): 2051-9.

51. Soreq L., Israel Z., Bergman H., Soreq H. Advanced microarray analysis highlights modified neuro-immune signaling in nucleated blood cells from Parkinson's disease patients. J. Neuroimmunol. 2008; 201-202:227-36.

52. Sotiriou C., Piccart M. Taking gene-expression profiling to the clinic: when will molecular signatures become relevant to patient care? J. Nat. Rev. Cancer. 2007; 7: 545-53.

53. Sotiriou C., Neo S.Y., McShane L.M. et al. Breast cancer classification and prognosis based on gene expression profiles from a population-based study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100(18): 10393-8.

54. Sladek R., Rocheleau G., Rung J. A genome-wide association study identifies novel risk loci for type 2 diabetes. Nature. 2007; 445(7130): 881-5.

55. Sparano J.A. TAILORx: trial assigning individualized options for treatment (Rx). Clin. Breast Cancer. 2006; 7(4): 347-50.

56. Spiess B., Seifarth W., Hummel M. et al. DNA microarray-based detection and identification of fungal pathogens in clinical samples from neutropenic patients. J. Clin. Microbiol. 2007; 45(11): 3743-53.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

57. Thomas G., Jacobs K.B., Yeager M. et al. Multiple loci identified in a genome-wide association study of prostate cancer. Nat. Genet. 2008; 40(3): 310-5.

58. Thorleifsson G., Walters G.B., Gudbiartsson D.F. et al. Genome-wide association yields new sequence variants at seven loci that associate with measures of obesity. Nat. Genet. 2009; 41(1): 18-24.

59. Tomlinson I., Webb E., Carvajal-Carmona L. A genome-wide association scan of tag SNPs identifies a susceptibility variant for colorectal cancer at 8q24.21. Nat. Genet. 2007; 39(8): 984-8.

60. van de Vijver M.J., He Y.D., vant Veer L.J. et al. A gene-expression signature as a predictor of survival in breast cancer. N. Engl. J. Med. 2002; 347(25): 1999-2009.

61. Vihinen P.P., Pyrhonen S.O., Kahari V.M. New prognostic factors and developing therapy of cutaneous melanoma. Ann. Med. 2003; 35(2): 66-78.

62. Wang I.M., Stepaniants S., Boie Y. et al. Gene expression profiling in patients with chronic obstructive pulmonary disease and lung cancer. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2008; 177(4): 402-11.

63. Wang Z., Gerstein M., Snyder M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 2009; 10(1): 57-63.

64. Yang S., Ghanny S., Wang W. Using DNA microarray to study human cytomegalovirus gene expression. J. Virol. Methods. 2006; 121(12): 202-8.

65. Zembutsu H., Ohnishi Y., Tsunoda T. et al. Genome-wide cDNA microarray screening to correlate gene expression profiles with sensitivity of 85 human cancer xenografts to anticancer drugs. Cancer Res. 2002; 62(2): 518-27.

66. Zimmermann K., Eiter Th., Scheiflinger F. Consecutive analysis of bacterial PCR samples on a single electronic microarray. J. Micro-biol. Methods. 2003; 55(2): 471-4.

REFERENCES

1. Antonova O.V., Grjadunov D.A., Lapa S.A. Detection of mutations in Mycobacterium tuberculosis genome determining resistance to fluoroquinolones by hybridization on biological microchips. Bul-leten' experimental'noy biologii i meditsiny. 2008; 145 (1): 115-20. (in Russian)

2. Glotov O.S. Biochips as a novel method of DNA-diagnostics in obstetrics and gynecology. Meditsinskaya genetika. 2007; 4: 30-4. (in Russian)

3. Golimbet V.E., Koren E.V. Copy number variations in the human genome - a new page in psychiatric genetics: the collaborative project PsychC-NVs. Klinicheskayapsichiatriya 2010; 110 (1): 107-9. (in Russian)

4. Gra O.A., Glotov A.S., Kozhekbaeva Zh. M. Genetic polymorphism in GST, NAT2, and MTRR and susceptibility to childhood acute leukemia. Molekulyarnaya biologiya. 2007; 42(2): 1-13. (in Russian)

5. Emelyanova M.A., Amosenko F.A., Chudinov A.V. Detection of KRAS mutations in tumor cells using biochips. Molekulyarnaya bi-ologiya. 2011; 45(5): 863-70. (in Russian)

6. Kubanova A.A., Kubanov A., Lesnaya I.N. et al. Zajavki na patent: № 2010113247/10(0186280), № 21010113246/10(018627); 2009140661. Patent RU № 2394496 C1. (in Russian)

7. Myznikova F.I., Faizulin L.Z. Zaharova N.B. et al. Oligonucleotide biochips in diagnostics of neonatal viral infections. Voprosy praktic-neskoypediatrii. 2006; 1: 61-4. (in Russian)

8. Nasedkina T.V. Use of biological microarrays in oncogematology. Onkogematologiya. 2006; 1-2: 25-37. (in Russian)

9. Nasedkina T.V., Guseva N.A., Mitjeva O.N. et al. Microchips in diagnostics of limphoproliferative diseases. Molekulyarnaya medit-sina. 2007; 3: 54-60. (in Russian)

10. Fedorova O.E., Lubcenko L.N. L.N. et al. Analysis of BRCAl/2 and CHEK2 mutations in ovarian cancer and primary multiple tumor involving the ovaries. Molekulyarnaya biologiya. 2007; 1: 37-42. (in Russian)

11. Chekanova T.A., Markelov M.L., Manzenyuk I.N. et al. Design of an immunochip for separate detection of hepatitis C virus antibodies. Klin-icneskaya laboratornaya diagnostika. 2008; 6: 25-30. (in Russian)

12. Alizadeh A.A., Eisen M.B., Davis R.T. et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature. 2000; 403(6769): 503-11.

13. Amos C.I., Wu X., Broderick P. et al. Genome-wide association scan of tag SNPs identifies a susceptibility locus for lung cancer at 15q25.1. Nat. Genet. 2008; 40(5): 616-22.

14. Andersson S., Hansson B., Norman I. et al. Expression of E6/E7 mR-NA from 'high risk' human papillomavirus in relation to CIN grade, viral load and p16INK4a. Int. J. Oncol. 2006; 29(3): 705-11.

15. Brown D.W., Gunning K.B., Henry D.M. et al. A DNA oligonucleotide microarray for detecting human astrovirus serotypes. J. Virol. Methods. 2008; 147(1): 86-92.

16. Burmster J.K., Srdova M., Shapero M.H., Mansfield E. DMET mi-croarray technology for pharmacogenomics-based personalized medicine. MethMol. Biol. 2006; 632(1): 99-124.

17. Buyse M., Loi S., van't Veer L. et al. Validation and clinical utility of a 70-gene prognostic signature for women with node-negative breast cancer. J. Natl. Cancer Inst. 2006; 98(17): 1183-92.

18. Campa D., Tavanti A., Gemignani F. et al. DNA microarray based on arrayed-primer extension technique for identification of pathogenic fungi responsible for invasive and superficial mycoses. J. Clin. Mi-crobiol. 2008; 46(3): 909-15.

19. Evertsz E., Starink P., Gupta R., Watson D. Technology and applications of gene expression microarrays. In: Schena M., ed. Microarray Biochip Technology. Natick, MA: Eaton Publ.; 2000: 149-66.

20. Fan J.B., Yeakley J.M., Bibikova M. A versatile assay for high-throughput gene expression profiling on universal array matrices. Genome Res. 2004; 14(5): 878-85.

21. Golub T. R., Slonim D. K., Tamayo P., et al. Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science. 1999; 286(5439): 531-7.

22. Gudmundsson J., Sulem P., Rafnar T. et al. Common sequence variants on 2p15 and Xp11.22 confer susceptibility to prostate cancer. Nat. Genet. 2008; 40(3): 281-3.

23. Hakonarson H., Grant S. F., Bradfield J. P. A genome-wide association study identifies KIAA0350 as a type 1 diabetes gene. Nature. 2007; 448: 591-4.

24. Heller R. A., Schena M., Chai A., et al. Discovery and analysis of inflammatory disease-related genes using cDNA microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997; 94: 2150-5.

25. Hoshida Y., Villanueva A., Kobayashi M. et al. Gene expression in fixed tissues and outcome in hepatocellular carcinoma. N. Engl. J. Med. 2008; 359(19): 1995-2004.

26. Huang A., Li J.-W., Shen Z.-Q., Wang X.-W., Jin M. High-throughput identification of clinical pathogenic fungi by hybridization to an oli-gonucleotide microarray. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(9): 3299-305.

27. Kaynak В., von Heydebreck A., Mebus S. et al. Genome-wide array analysis of normal and malformed human hearts. Circulation. 2003; 107: 2467-74.

28. Kittleson M.M., Ye S.Q., Irizarry R.A. et al. Identification of a gene expression profile that differentiates between ischemic and nonisch-emic cardiomyopathy. Circulation. 2004; 110(22): 3444-51.

29. Lock C., Hermans G., Pedotti R. et al. Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions yields new targets validated in autoimmune encephalomyelitis. Nat. Med. 2002; 8(5): 500-8.

30. Lopes-Campos G., Coiras M., Sanches-Merino J. P. et al. Oligonucleotide microarray design for detection and serotyping of human respiratory adenoviruses by using a virtual amplicon retrieval software. J. Virol. Methods. 2007; 145(2): 127-36.

31. Li H., Wetten S., Li L. et al. Candidate single-nucleotide polymorphisms from a genomewide association study of Alzheimer disease. Arch. Neurol. 2008; 65(1): 45-53.

32. Li S.F.Y., Kricka L.J. Clinical analysis by microchip capillary electrophoresis. Clin. Chem. 2006; 52(1): 37-45.

33. Lin C.-Y., Chen H.-C., Lin R.-W. Quality assurance of genotyping array for detection and typing of human papillomavirus. J. Virol. Me-hods. 2007; 140(1-2): 1-9.

34. Lu J. Getz G., Miska E. A. MicroRNA expression profiles classify human cancers.Nature. 2005; 435(7043): 834-8.

35. Ly D. H., Lockhart D. J., Lerner R. A.et al. Mitotic misregulation and human aging. Science. 2000; 287(5462): 2486-92.

36. Miller M. D., Tang Y-W. Basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology. Clin. Microbiol. Rev. 2009; 22(4): 611-33.

37. Mirnics K., Middleton F. A., Marquez A. et al. Molecular characterization of schizophrenia viewed by microarray analysis of gene expression in prefrontal cortex. Neuron. 2000; 28(1): 53-67.

38. Moffatt M.F., Kabesch M., Liang L. et al. Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma. Nature. 2007; 448(7152): 470-3.

39. Perou С. М., Sorlie Т., Eisen M. B. et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2000; 406(6797): 747-52.