CC BY
8
ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
УДК 579, 262:57.083.13
КУЛЬТУРЫ МИКРООРГАНИЗМОВ КАК ПРИМЕР
ИНФОРМАЦИОННОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ
Р.Р. Асланян, А.Ф. Лебедева, Е.С. Бабусенко*, С.Ю. Королева, Ю.Н. Королев
(кафедра физиологии микроорганизмов; e-mail: [email protected]; [email protected])
На меняющиеся условия окружающей среды живой организм отвечает определенной реакцией, по которой можно судить об "открытости" системы. Методом неинвазивного анализа получены сведения о меняющихся в процессе роста биохимическом составе и пространственной организации важнейших биополимеров, клеток и культуральной жидкости одноклеточных зеленых водорослей.
Ключевые слова: водоросли, неинвазивный метод, спектры поглощения.
Фундаментальную основу существования популяции в среде обитания, в том числе искусственной, составляют процессы потребления энергии и превращения экзогенных веществ, содержащихся в этой среде, участвующие в увеличении биомассы популяции. Обеспеченность популяции важнейшими жизненными ресурсами определяется не только их количеством, но и доступностью, возможностями утилизации, а также необходимыми абиотическими условиями (например, температура), которые влияют на использование популяцией энергии и экзогенных веществ (Гусев и др., 2003).
Единая пространственно-временная организация является одним из важных условий функционирования биологической системы. Пространственная организация выполняет ее структурно-функциональную стабилизацию и сохранение даже в условиях действия экстремальных факторов. Одно из ее проявлений — гетерогенность биологической системы, выражающаяся в форме градиентов. Степень выраженности градиентов и их связь с временной динамикой процессов изменяется при любых воздействиях на систему. Временная организация, обладая широкими рамками лабильности, участвует в процессах изменчивости биологической системы, подвергающейся различным воздействиям, обеспечивая ее адаптацию (Гусев, Королев, 2004).
Организм представляет собой систему лабильных взаимодействий во внутреннем информационном поле, находящуюся в постоянно меняющемся внешнем информационном поле, что подразумевает обмен информацией со средой обитания. Это возможно, если система является "открытой", когда в ней происходят постоянные притоки и оттоки вещества и энергии из среды обитания. "Открытость" можно охарактеризовать как возможность
*РХТУ им. Д.И. Менделеева, г. Москва.
организма производить обмен информацией со средой обитания, а уровень "открытости" — интенсивностью этого обмена. На меняющиеся условия окружающей среды организм отвечает соответствующей реакцией. В количественном варианте — изменением концентрации биохимических компонентов в определенных структурах клетки и степени их пространственной ориентации (дихроичные отношения). В качественном варианте — изменением векторов градиентов концентраций биохимических компонентов и векторов градиентов степени их пространственной ориентации (Гусев, Королев, 2004).
Для наблюдения за средой обитания перспективно использовать живые организмы (в частности, микроорганизмы) быстро реагирующие на изменения окружающей среды. Экскреция микроорганизмами метаболитов, в состав которых входит ряд ценных химических соединений, в том числе с высокой биологической активностью, зависит от многих факторов, главным из которых является физиологическое состояние клеток культуры.
Многие виды одноклеточных зеленых водорослей являются важным объектом в современной биотехнологии и используются в качестве ценных лекарственных препаратов в медицине и в виде высокоактивных кормовых добавок в сельском хозяйстве. Микроводоросли применяются для биологической очистки сточных вод, бытовых и производственных отходов. Важная роль отведена микроводорослям в создании экологических циклов в замкнутом пространстве для обеспечения внеземной жизни человека.
В процессе культивирования одноклеточных зеленых водорослей происходят возрастные изменения клеток, связанные с переходом одной фазы
10 ВМУ, биология, № 2
в другую. При этом меняются биохимический состав и структурная организация клеток. Внешние структуры клеток претерпевают глубокие изменения в процессе роста культуры. Свойства клетки тесно связаны с ее мембранной организацией, поскольку именно в мембранах наблюдаются интенсивные молекулярные взаимодействия. Модификация клеточных мембран наблюдается также при изменении физиологического состояния клеток, вызванного меняющимися факторами внешней среды. Структурные перестройки мембран являются тригерными механизмами дифференциации и служат начальным звеном в сложной цепи изменений, переводящих клетку в новое функциональное состояние. Для изучения этих процессов необходимо проведение анализа многокомпонентных гетерогенных систем клеток без их разрушения, получение информации об изменении химического состава клеток и получение сведений о структурных изменениях биополимеров во времени и в пространстве.
Интерес представляет и культуральная жидкость (КЖ), которая богата ценными продуктами метаболизма и является неотъемлемой частью культуры микроводорослей. Она является средой обитания, источником питания, аккумулятором продуктов метаболизма и лизиса клеток, в связи с чем состав и свойства ее в процессе культивирования постоянно меняются. Культуральная жидкость непосредственно контактирует с внешними структурами клетки, которые первыми реагируют структурной и биохимической перестройкой на изменения окружающей среды. Основное внимание исследователей направлено на углубление знаний о биологической специфичности и значимости продуктов биосинтеза микроводорослей, когда решающую роль играет не биомасса, а накопление определенных веществ в среде.
Как правило, общепринятые методы исследований биологических объектов лишь с большими ограничениями могут быть применены для изучения состояния целых клеток, так как подготовка их к исследованию приводит к резким изменениям их функционального состояния. Существующий метод химических моделей позволяет охарактеризовать КЖ только по ее "реакционной способности", которая меняется в зависимости от фазы роста культуры и влияния на нее факторов внешней среды (Гусев и др., 1984; Асланян, 2004).
Целью работы являлось получение сведений о процессах, происходящих во внешних структурах клетки, и о гетерогенности структурной организации целой клетки. Важным было получение сведений об изменениях, происходящих в составе куль-туральной жидкости на всех стадиях развития одноклеточных зеленых водорослей.
Объекты и методы
В работе исследовали морские одноклеточные зеленые водоросли Б. tertiolecta. Микроводоросли культивировали при температуре +(19—20)°, освещенности 3 тыс. лк, на питательной среде Гольд-берга в периодическом режиме. В качестве посевного материала использовали клетки культуры, находящейся в стационарной фазе роста (30 сут). Объем инокулята составлял 5%; начальная плотность клеток 0,5 х 105 кл./мл; длительность эксперимента 50 сут. Исследовали неразрушенные клетки сразу же после внесения инокулята, после 5, 15, 30 и 50 сут культивирования. Физиологическое состояние микроводорослей и количество клеток в среде контролировали микроскопическими методами.
Неинвазивный метод многократно нарушенного полного внутреннего отражения (МНПВО) основан на анализе живых неразрушенных клеток в ИК диапазоне (область 1800—1200 см-1). Ранее этот метод был использован в основном в работах с прокариотами (Гусев и др., 1984; Королев и др., 1986; Гусев, Королев, 2004). Нами этот метод был применен для исследования процессов, происходящих в клетках одноклеточных зеленых водорослей только на отдельных стадиях роста культуры (Асланян, Королев, 2007). Метод МНПВО дает возможность получить информацию об изменениях биохимического состава, концентрации и пространственной организации важнейших биохимических компонентов клетки и решить поставленные задачи. Используемый для анализа материал, содержащий клетки, готовили в виде водной пасты, наносили на измерительный элемент и подсушивали при комнатной температуре в токе воздуха. Время от нанесения объекта на элемент до начала записи характеристик и время регистрации не превышало 1—2 мин. Подробнее метод рассмотрен в работе Ю.Н. Королева с сотр. (2002).
В неполяризованном свете метод МНПВО обеспечивает нативное исследование объектов и их послойные характеристики, а также может дать информацию о наличии биохимических компонентов, идентифицируемых по их спектральным характеристикам в заранее определенном, измеряемом слое клетки.
В поляризованном свете спектральные характеристики дают информацию о тех процессах, которые связаны с пространственной переориентацией отдельных (например, белковых) макромолекул, что, по-видимому, может служить характеристикой прижизненной организованности системы в определенный момент времени. В исследовании применяли пленочные поляризаторы из фторопласта и полиэтилена со степенью поляризации 96—98%. В качестве измерительных элементов были использованы пластины, изготовленные из германия
(Ое), который обеспечивает глубину проникновения светового потока в клетку на 0,2 мкм и получение спектральной информации из внешнего слоя. Измерительный элемент — из сульфида цинка (2п8) марки КО-2, обеспечивающий проникновение на 3 мкм и получение спектрального анализа всей клетки. Угол падения светового потока 0 = 45° позволяет упростить расчет дихро-ичных отношений С, получаемых из соотношения параллельной и перпендикулярной компонент плоско поляризованного света (С = Б=/Б1). Дихроичное отношение равное 2 свидетельствует об изотропном состоянии объекта; отклонение С от этого значения в любую сторону характеризует степень анизотропии. При исследовании клеток было выбрано 0 >> 0кр, что дает возможность вести анализ даже сильных амидных полос.
Анализ КЖ проводили в неполяризованном свете в области 1800—1200 см-1 инфракрасного диапазона в связи с тем, что в этой области находятся как спектры основных компонентов питательной среды, так и спектры продуктов метаболизма растущей культуры. Интенсивность полос поглощения спектров определяли соотношением присутствующих в ней компонентов. Контролем служили спектры питательной среды в области 1370 см-1, где отсутствовали продукты метаболизма. Материал для анализа наносили на измерительный элемент и подсушивали при комнатной температуре в токе воздуха. Время от нанесения объекта на элемент до начала записи характеристик и время регистрации не превышало 1—2 мин. Подробнее методика рассмотрена в работе Ю.Н. Королева с сотр. (2002). Культуральную жидкость исследовали сразу после внесения в питательную среду инокулята (нулевая точка) после 5, 15, 30 и 50 сут культивирования. Анализ проводили, предварительно осаждая клетки водорослей при 3000 об/мин, 30 мин, 20°.
Результаты и обсуждение
Интенсивность поглощения полос спектра различных микроорганизмов определяется соотношением основных биохимических компонентов клетки: белков, нуклеиновых кислот, углеводов и липи-дов. Интенсивности полос 2930, 1740 и 1460 см-1 связаны с липидными компонентами микроорганизмов, полосы поглощения в области 1100 см-1 говорят о наличии в клетке углеводов, две силь-
Рис. 1. Спектры клеток культуры Б. tertiolecta после 5 сут культивирования. а. Неполяризованный свет: 1 — КО-2; 2 — Ое. б. Поляризованный свет: 1 — Ко-2 (| |); 2 — КО-2 (±)
ные полосы с частотами максимумов около 1240 и 1080 см-1 обусловлены присутствием нуклеиновых кислот, полоса поглощения 1660 см-1 соответствует в основном белкам, полипептидам и солям аминокислот.
Спектры 5-суточной культуры целых клеток, их внешних структур в неполяризованном и поляризованном свете представлены на рис. 1, а, б. Ввиду того что в качестве посевного материала нами использовались клетки, находящиеся в стационарной фазе роста, их спектры сходны со спектрами клеток 30-суточной культуры. Однако наблюдаются и характерные различия основных биохимических компонентов для целых клеток и их внешних структур, что, по-видимому, является следствием адаптации клеток к питательной среде, отличающейся составом от 30-суточной. Для целых клеток также появляется полоса 1450 см-1, ее нет во внешних структурах, что свидетельствует о происходящем накоплении информации. Расчет дихро-ичных отношений для 5-суточной культуры показывает, что этот показатель для внешних структур приближается к 2, а для целых клеток — значительно отличается от 2. Такие отношения должны быть характерны в те моменты культивирования, когда идет адаптация клеток к среде обитания. Отметим также, что дихроичные отношения для а1 и а2 для целых клеток имеют прямо противоположное направление.
Спектры КЖ в нулевой точке культивирования в области 1600 см-1 по сравнению с питательной средой, которую принимали за контроль, имеют характерный "размытый" вид, по-видимому, за счет незначительного количества лизированных клеток, присутствующих в инокуляте из 30-суточной культуры (см. методику).
структур следует, что культура закрыта , дихроич-ные отношения для целых клеток близки к 2. Кроме того, для а1 дихроичные отношения для внешних структур больше 2, а для а2 — меньше 2, т.е. направления векторов прямо противоположны.
К 15-м сут культивирования "размытые" полосы, присутствующие на ранних стадиях в КЖ, сменяются четко выраженными спектрами поглощения в области 1600 см-1, что связано с накоплением продуктов метаболизма (рис. 4). Полоса поглощения в области 1300 см-1 продолжает уменьшаться в связи с истощением питательной среды.
Рис. 2. Спектр КЖ культуры Б. (егйокМа после 5 сут культивирования
К 5-м сут культивирования в спектрах КЖ полоса поглощения в области 1600 см-1 несколько увеличивается и появляется ее раздвоение. Одновременно снижается интенсивность полосы поглощения в области 1300 см-1 (рис. 2). Эти изменения могут быть связаны с процессом адаптации клеток, началом потребления компонентов питательной среды и появлением продуктов метаболизма.
Спектры целых клеток и их внешних структур 15-суточной культуры в неполяризованном свете (рис. 3, а) свидетельствуют о нормальном состоянии культуры. Во внешних структурах на этом этапе культивирования появляется полоса в области 1600 см-1, которая ранее не наблюдалась. В целых клетках она отсутствует. Однако у 5-суточной культуры эта полоса в клетках просматривается и полностью отсутствует во внешних структурах. Возможно, это связано с тем, что происходит синтез и накопление в клетках метаболитов, а затем их выход в среду через внешние структуры. В поляризованном свете (рис. 3, б) из дихроизма для внешних
Рис. 3. Спектры клеток культуры Б. (вгИокШ после 15 сут культивирования. а. Неполяризованный свет: 1 — КО-2; 2 — Ое. б. Поляризованный свет: 1 — Ко-2(||); 2 — КО-2 (1)
Рис. 4. Спектр КЖ культуры Б. (егйокМа после 15 сут культивирования
Спектры целых клеток и их внешних структур 30-суточной культуры свидетельствуют об открытости системы. В спектрах, полученных в неполяризованном свете (рис. 5, а) с измерительным элементом из германия для внешних структур, отсутствуют полосы поглощения в области 1240 см-1, принадлежащие в основном нуклеиновым кислотам, и значительное поглощение в области 1740 см-1, за которое отвечают липиды. Спектры, полученные
на КО-2 для целых клеток, имеют ярко выраженную полосу поглощения в области 1240 см-1, что подтверждает то, что ведется послойный анализ клетки без ее разрушения. Появляется слабая полоса в диапазоне 1450 см-1 и сильная полоса — 1400 см-1 во внешних структурах, а для целых клеток — наоборот: сильная полоса в диапазоне 1450 см-1, слабая — 1400 см-1,
что свидетельствует, по-видимому, об обмене информацией клетками со средой. В поляризованном свете (рис. 5, б) по появившимся изменениям в полосах поглощения 1660 см-1 и 1550 см-1 можно объяснить значительные изменения отдельных составляющих внешних слоев клетки. Ди-хроичные отношения для а1 и а2 внешних структур близки к 2, а для клеток — отличаются от 2 и имеют прямо противоположное направление: а1 больше 2, а а2* — меньше. Если сопоставить эти данные с данными 5-су-точной культуры, то наблюдается прямо противоположное направление векторов. Это характеризует функционирование системы, т.е. изменение ее физиологического состояния.
После 30 сут культивирования в спектрах КЖ продолжается некоторое снижение интенсивности
,-1
Рис. 5. Спектры клеток культуры Б. (вгйокМа после 30 сут культивирования. а. Неполяризованный свет: 1 — КО-2; 2 — Ое. б. Поляризованный свет: 1 — Ко-2 (| |); 2 — КО-2 ( )
морфоструктурными изменениями клеток (начавшийся лизис). Полосы, ответственные за содержание липидных компонентов, значительно сильнее для целых клеток, чем для внешних структур, что, вероятно, также свидетельствует о тех же изменениях. Спектры, полученные в поляризованном свете (рис. 7, б), также свидетельствуют о деструкции _ клеток, и характерная для внешних слоев поло-
полосы поглощения в области 1300 см-1 и сниже- са 1375 см-1 отсутствует, по появляется полоса
ние четко выраженной полосы в области 1600 см-1 что объясняется, по-видимому, начинающимся замедлением роста, обеднением питательной среды и уменьшением выделяемых в среду продуктов метаболизма (рис. 6).
Рис. 6. Спектр КЖ культуры Б. кгйок^а после 30 сут культивирования
Спектры, полученные в неполяризованном свете (рис. 7, а) для целых клеток и их внешних структур после 50 суток культивирования, показывают, что поглощения в области 1550 см-1 существенно искажены. Это, по-видимому, объясняется
в области 1340 см-1 и 1400 см-1 (для параллельно поляризованного света).
После 50 суток культивирования в наших условиях в культуре водорослей резко возрастает количество лизированных клеток. В спектрах КЖ в области 1600 см-1 вновь усиливается полоса поглощения (рис. 8). Максимальное увеличение ее интенсивности происходит за счет содержимого разрушенных клеток и наблюдается отсутствие дихроизма в связи с изотропным состоянием системы.
В процессе работы у клеток разного возраста были обнаружены существенные различия в спектрах поглощения в области 1660 см-1 и 1550 см-1, которые принадлежат белковым компонентам. Расчет дихроичных отношений свидетельствует о структурных и биохимических изменениях, происходящих во внешних слоях клеток. Получены данные об изменениях, происходящих в целых, не разрушенных клетках, их внешних структурах, меняющемся биохимическом составе и пространственной организации макромолекул важнейших биополимеров в процессе культивирования микроводорослей. Степень пространственно-временной организации структур клеток, через которые осуществляется взаимодействие со средой обитания, характеризует изменения живой системы в зависимости от этапа развития и от характера взаимодействия со средой обитания.
Рис. 7. Спектры клеток культуры Л. егИо1в&а после 50 сут культивирования. а. Неполяризхованный свет: 1 — КО-2; 2 — Ое. б. Поляризованный свет: 1 — Ко-2(||); 2 — КО-2 ( )
Рис. 8. Спектр КЖ культуры Б. tertiolecta после 50 сут культивирования
В спектрах КЖ в процессе культивирования наблюдались значительные различия, что свидетель-
ствует об изменении состава ее компонентов. Интенсивность роста культуры, а следовательно, и свойства КЖ имели и сезонные колебания, что также влияло на изменение спектров (Асланян, Королев, 2007). Кроме того, изменялась во времени и концентрация присутствующих в КЖ веществ, что видно по меняющимся соотношениям отдельных полос поглощения в исследуемом диапазоне.
Рассматривая КЖ как среду обитания микроводорослей, можно считать, что она в известной мере может характеризовать степень временной организации поверхностных структур клеток, через которые осуществляется их взаимодействие со средой обитания. По нашему мнению, "открытость системы" — состояние периодическое, так же как и связанное с ним поступление в окружающую среду продуктов метаболизма.
Получены данные об изменениях, происходящих в неразрушенных клетках и их внешних слоях, а также о меняющейся характеристике культураль-ной жидкости в процессе роста одноклеточных зеленых водорослей.
Пространственно-временные закономерности процесса культивирования микроорганизмов на сегодняшний день изучены еще недостаточно, и есть основания полагать, что это направление исследований как в теоретической, так и в практической области даст новую ценную информацию.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Асланян Р.Р. 2004. Изменение реакционной способности культуральной жидкости морских одноклеточных зеленых водорослей Platymonas viridis и Dunaliella tertiolecta в процессе роста // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 4. 16—18.
Асланян Р.Р., Королев Ю.Н. 2007. Исследование роста культуры одноклеточных зеленых водорослей методом неинвазивного анализа // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 3. 13—16.
Гусев М.В., Живописцева И.В., Королев Ю.Н., Никитина К.А., Телегин Н.Л. 1984. Об использовании фагов в исследовании цианобак-терий // Биологические науки. № 1. 85—89.
Гусев М.В., Калабеков А.Л., Королев Ю.Н. 2003. Энтропийный подход при экспери-
ментальной оценке живых систем // Синергетика. Т. 5. М. С. 261—276.
Гусев М.В., Королев Ю.Н. 2004. О взаимосвязи эволюции живых систем и их открытости // Синергетика. Т. 7. М. С. 150—169.
Гусев М.В., Селях И.О., Королев Ю.Н., Семенова Л.Р., Савельев И.Б. 2004. Неинва-зивные исследования белковой компоненты клеток красных морских водорослей класса Cyanidiophycae // Вестн. Моск. ун-та. Сер. Биология. № 4. 3—6.
Королев Ю.Н., Малахов Ю.И., Калабеков А . Л . 2002. Использование методов спектрометрии МНПВО для анализа биологических объектов // Измерительные технологии. № 8. 6.
Королев Ю.Н., Эль-Регистан Г.И., Коз- рактеристики анабиотических цистоподобных форм Валов а А.Н., Дуда В.И. 1986. Спектральные ха- сШш сегеш // Микробиология. № 4. 652—655.
Поступила в редакцию 19.01.09
CULTURES OF MICROORGANISMS, AS ACTIVE "MECHANISM" OF INFORMATION INTERACTION
R.R. Aslanyan, A.F. Lebedeva, E.S. Babusenko, S.U. Koroleva, U.N. Korolev
On the changing of on environment viable organisms answered by apprropriate reaction shows the degree of "openness". Changes of biochemical composition and spatial orientation of the major biopolymers of cells and cultures liquid of greeen algae by method of noninvasive analysis had been shown.
Key words: algae, noninvasive analysis, cultures liquid.
Сведения об авторах
Асланян Рубен Рачикович — канд. биол. наук, вед. науч. сотр. кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ. Тел. 939-41-69; e-mail: [email protected]
Лебедева Александра Федоровна — канд. биол. наук, доц. кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ. Тел. 939-41-69; e-mail: [email protected]
Бабусенко Елена Сергеевна — канд. биол. наук, доц. кафедры биотехнологии РХТУ им. Д.И. Менделеева; e-mail: [email protected]
Королева Светлана Юрьевна — соискатель, инженер 2-й категории кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ. Тел. 939-41-69; e-mail: [email protected]
Королев Юрий Николаевич — докт. биол. наук, доц. кафедры физиологии микроорганизмов биологического факультета МГУ. Тел. 939-41-69; e-mail: [email protected]
