Культивирование Leuconostoc mesenteroides на мелассе с целью получения декстрана Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

Биотехнология

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ Ьеисопов^с теьеп1его{(1еь НА МЕЛАССЕ С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ ДЕКСТРАНА

Т. А. Ведяшкина, В. В. Ревин, Е. А. Шувалова,

Н. Ф. Паршуткина

В настоящее время в связи с высокой ток- глубинного культивирования служила мелас-сичностью и стоимостью основных клеевых са, разведенная водой. Оптическую плотность

компонентов, используемых для склеивания различных изделий, разрабатываются адгезивные материалы на основе экологически безопасных биокомпонентов, содержащие такие

исследуемых образцов определяли на спектрофотометре СФ-46 «Ломо» (Россия).

Для выращивания и поддержания культуры гаезея^вгог^ея использовали сахарозосо-

биополимеры, как полисахариды и белковые держащую среду, описанную в регламенте

тупать полисахарид

соединения.

Одним из таких компонентов может выс-

— декстран, обладающий выраженными адгезивными свойствами. Биосинтез декстрана и его свойства зависят от ряда физико-химических факторов, состава среды и штамма-продуцента. Условия синтеза декстрана отработаны в основном в производстве плазмозаменителей. Получение технического декстрана с использованием пищевого сырья в качестве питательной среды как адгезивного материала в настоящее время изучено мало.

Ценный побочный продукт сахарной промышленности — меласса — имеет богатый качественный и количественный состав. Большое содержание сахарозы, позволяет использовать ее для культивирования продуцента декстрана Иеисопо5(ос тезеп(его1с1е8. Поэтому целью работы являлось получение адгезивных материалов из отходов свеклосахарной промышленности путем микробиологического синтеза.

В работе использовали штамм Ьеисопо81ос

тв8еМего1с1е8 ВКМ 2713-Д. Субстратом для

производства полиглюкина на основе декстрана [7]. В качестве инокулята использовали суспензию суточной биомассы бактерии, выращенной на среде Долса [10]. Мелассу разводили водой до необходимой концентрации сахарозы (рН 6,75).

Культивирование гаезе/г/егог^ез в экспериментах по оптимизации условий культи-

О

вирования проводили в меласснои среде, варьируя содержание сахарозы, исходный рН культивирования, содержание М£Б04, скорости перемешивания. Культивирование проводили как в статических условиях, так и при перемешивании в течение 2—5 сут в зависимости от скорости образования декстрана. Количество биомассы определяли весовым методом. /Содержание - декстрана определяли весовым методом после двойного осаждения 96 % этанолом [2]. Содержание белка в культураль-ной жидкости определяли по методу Бред-форд, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин [9].

Оптимизация условий синтеза декстрана микроорганизмом Ь. те8е1йе-го{йг8

© Т. А. Ведяшкина, В. В. Ревин, Е. А. Шувалова, Н. Ф. Паршуткина, 2008

в средах иа основе мелассы. В промышленности гагзел/егои/ез культивируют для получения клинических декстранов на минеральной среде с содержанием сахарозы 10— 30 %. При использовании декстранов для технических целей, например в качестве био-адгезива, целесообразнее для синтеза декстра-на использовать вторичное сырье, такое как меласса. Были проведены исследования по оптимизации условий синтеза декстрана в средах, содержащих мелассу, в качестве единственного компонента питательной среды. Для этого изучали влияние концентрации сахарозы мелассы, витаминов и ионов магния, рН среды и скорости перемешивания.

Влияние концентрации мелассы на образование декстрана микроорганизмом Ь. теяепЬегoid.es. При культивировании микроорганизмов на регламентированной среде с сахарозой максимальное количество декстрана (49 г / л) было получено на 4-е сутки роста (рис. 1). В экспериментах с

использованием среды Долса декстран образовывался уже на 2-е сутки роста, и его выход был на 17 % выше по сравнению с регламентированной средой, составил 68,7 г / л. Выращивание теьеМего'ьЛеь показало, что концентрация сахарозы мелассы в питательных средах 5,0—17,5 % приводит к увеличению образования декстрана до 56,8 г / л.

Однако более высокая концентрация мелассы — 20—22,5 % начинала подавлять биосинтез декстрана. Уменьшение

выхода

декстрана на средах с высокой концентраци-

80 -

70 -

60 ■

X се 50 -

Си

н О 40 -

«

О 30 -

1=1

20 -

10 -

0 -

ей мелассы, возможно, связано с наличием в составе мелассы веществ, ингибирующих ферменты, участвующих в образовании полисахарида, или с ингибированием синтеза конечным продуктом — декстраном.

Влияние рН среды на основе мелассы на образование декстрана. В ряде работ было выяснено, что оптимальное значение рН для развития теяе/г/егои/ея возможно в достаточно широких пределах от 5 до 8, однако ферментативная реакция протекает при рН 5,2—5,6 [5]. Поэтому представляет интерес выявить оптимальный рН среды на основе мелассы. Исходное значение рН питательных сред, используемых для изучения продуцента декстрана и особенностей его образования, составляет 6,8—6,9. Полученные результаты представлены на рис. 2. Оптимальной величиной рН для синтеза декстрана культурой те5еп1его1йе8, так же как и в случае с контрольным вариантом, является рН 6,75. При этом выход декстрана на данной среде на 15 % выше, чем в контрольной.

Дальнейшее увеличение рН до 7—8 при-

водит к резкому снижению синтеза декстрана. Таким образом, рН 6,75 является оптимальным и может быть рекомендован для культивирования теьеМегоьйев на среде с мелассой в качестве единственного источника питания.

Влияние режима перемешивания на образование декстрана. те$еп1его1йе5, являясь аэротолерантным, обладает способностью образовывать декстран как в перемеши-

Е

5,0 7,5 10,0 12,5

Регламентированная среда

15,0 17,5 20,0 22,5

Сахароза, % Среда Долса □мелассная

Рисунок 1

Влияние концентрации сахарозы мелассы на образование декстрана

X cd О.

Й

о t=t

5,0

6,0 6,3

6,5

6,8 7,0

8,0

рН

сахароза □ меласса

Рисунок 2

Влияние рН на образование технического декстрана в средах на основе мелассы

г/л™ л 60 -50 -40 -30 -20 -

10 -

0

А

0

i

50

100

=Е

150

200

250

об/мин

Регламентированная среда Среда Долса □ мелассная

Рисунок 3

Влияние скорости перемешивания на образование декстрана L. mesenteroides

ваемых, так и в стационарных условиях. Однако имеются отдельные сведения о том, что в условиях аэрации ускоряется процесс ферментации.

Учитывая эти данные мы проводили культивирование на круговой качалке при 50, 100, 150, 200 и 250 об / мин в течение 4 сут. Ис-

При использовании среды с дрожжевым экстрактом разница в накоплении декстрана при статических условиях и при 200 об / мин не превышала 15 %. Выход декстрана при культивировании на среде с мелассой в статических условиях составил 11,3 г / л. При переходе к динамическим условиям про-

пользование в регламентированной среде в исходит увеличение образования декстрана в качестве источника азота хлорида аммония и низких концентраций пептона (0,02—0,03 %)

приводило к тому, что максимум накопления декстрана наблюдался позже и по количественным значениям был меньше, чем при применении среды с дрожжевым экстрактом. Анализируя данные рис. 3, можно отметить, что изменение состава среды приводит также к изменению характера зависимости выхода декстрана от режима перемешивания.

опытной и в регламентированной средах.

В целом зависимость количества синтезированного декстрана теБеМего'ьйез от числа оборотов качалки на обеих средах име-

U

ла сходный характер: при увеличении скорости перемешивания на 50 об / мин выход декстрана увеличивался в среднем на 10 г / л. При 200 об / мин количество декстрана достигло максимума (52,31 г / л на мелассной среде). Дальнейшее увеличение скорости пе-

ремешивания до 250 об / мин приводит к подавлению синтеза декстрана.

По литературным данным, витамины: тиамин, никотиновая кислота и пантотенат кальция — являются необходимыми факторами роста для лейконостока [1; 4; 8; 11]. Однако для мелассной среды влияние витаминов на выход декстрана неизвестно. Поэтому было изучено влияние вышеуказанных витаминов на биосинтез декстрана бактерией L. mesenteroides.

При внесении витаминов в количестве 0,5 мг / л декстран начинал образовываться во всех средах на 2-е сутки, но в отличие от контроля, наблюдался более продолжительный процесс ферментации. Максимальный выход декстрана в контрольной среде составил 62,8 г / л на 4-е сутки, в то время как на среде с пантотенатом кальция он достиг 69,5 г / л на 5-е сутки, а на среде с никотиновой кислотой — 66,7 г / л на 6-е сутки. Тиамин также способствовал продлению процесса синтеза декстрана — выход продукта в этом случае составил 64,1 г / л на 5-е сутки (рис. 5).

Повышение концентрации витаминов до 1 мг / л привело к увеличению синтеза декстрана, особенно на среде с пантотенатом кальция, в этом случае наблюдался максимальный выход, который составил 74,3 г / л на 5-е сутки.

Меньшее количество декстрана образовывалось в присутствии никотиновой кислоты — 71,5 г / л на 6-е сутки т. е. снова наблюдается более продолжительный процесс ферментации.

Исходя из наших данных, можно заключить, что витамины увеличивают выход декстрана, и наибольшее его количество наблюдается в средах, содержащих 1 мг / л пантотената кальция и никотиновой кислоты.

Совместное влияние ионов Mg2+ и рН ] на выход декстрана. С учеётом важного влияния ионов магния на структуру декстрана [6; 12] и, соответственно, на его свойства было изучено влияние ионов Mg2+ на синтез декстрана и определение оптимальной концентрации MgS04 при варьировании исходного значения рН для максимального синтеза технического декстрана культурой

Leuconostoc.

В варианте с рН 6,5 выход декстрана на контрольной среде был на 18,5 % меньше, чем в опытных. При сравнении количества декст-

рана, полученного на питательных средах с различными концентрациями М§Б04, можно сказать, что с увеличением количества М^Б04 в питательной среде от 0,01 до 0,06 % выход технического декстрана остается на одинаковом уровне.

Увеличение рН до 6,75 позволило повысить выход экзополисахарида, однако в этом случае с ростом концентрации соли М^Б04 с 0,01 до 0,06 % происходило снижение количества декстрана. Максимальное декстранооб-разование наблюдалось при росте

га^ея/его^ез в питательной среде с содержанием сульфата магния 0,02 %. В этом случае количество синтезированного декстрана было на 20,5 % выше, чем при использовании М^Б04 в концентрации 0,06 %.

При увеличении рН среды до 7,0 оптимальная концентрация М£804 соответствует 0,04 %: выход декстрана в этом варианте на 23 % больше, чем на среде с 0,01 % содержанием MgS04, и на 35 % больше, чем в контрольной среде без добавления соли (рис. 4).

Дальнейшее увеличение количества М£$04 до 0,06 % (59,52 г/л) приводит к снижению декстранообразования. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что с увеличением значения рН среды культивирования возрастает оптимальная концентрация М£$04, необходимая для максимального выхода декстрана.

Влияние ионов на фракционный

состав декстрана. Известно, что декстраны, образуемые разными видами микробов и даже разными расами (штаммами) одного вида, не идентичны по своему строению [5].

Экзополисахарид, продуцируемый тевеМешйез штаммом СФ-4 и служащий для приготовления полиглюкина, имеет 93—94 % связей Ь — 1,6 и почти не разветвленную молекулу [3]. Известно также, что на структуру и выход технического декстрана сильное влияние оказывают ионы магния [6; 12; 13].

Представляло интерес изучить фракционный состав технического декстрана, синтезированного в средах, содержащих мелассу и М^Б04. Методом переосаждения были получены три фракции: высокомолекулярная (ВМФ), среднемолекулярная (СМФ) и низкомолекулярная (НМФ).

При фракционировании декстрана, выделенного с мелассной среды, произошли потери

X а

о

и

и (=1

90

80

70

60

50 40

30

Контроль Тиамин (0,5 мг / л) Никотиновая кислота (0,5 мг / л) Пантотенат кальция (0,5 мг / л) Тиамин (1 мг/л) Никотиновая кислота(1 мг/л) Пантотенат кальция (1 мг/л)

2

3

4

5

6

сутки

Рисунок 4

Динамика образования декстрана в средах с добавлением витаминов

ОО

ЧО

%

СМ

т

ВМФ

СМФ

НМФ

контроль меласса

□ 0,01 % сульфат магния

0,02 % сульфат магния □ 0,04 % сульфат магния

Ш 0,06% сульфат магния Рисунок 5. Фракционный состав технического

декстрана

Рисунок 5

Фракционный состав технического декстрана

(около 19 %), тогда как в контроле общий выход фракций составил 100 %. При росте на среде с мелассой ВМФ составила 53,6 %, что в 1,5 раза меньше, чем в контроле — 78,18 %. СМФ при росте на мелассе составила 24,83 % это в 1,3 раза больше по сравнению с контролем. НМФ в опытной пробе составила 2,5 %, как и в контроле.

Полученный в ходе работы на мелассной питательной среде с различным количеством соли М^Б04 (от 0,01 до 0,06 %) технический декстран также фракционировали (рис. 5).

В вариантах сред с концентрацией MgS04 0,02 и 0,04 % доля ВМФ составила 57,5 % и 59,3 % соответственно. Это превышает контроль на 7—10 %.

Количество ВМФ в среде с минимальным содержанием ионов М^2+ практически не отличимо от контроля и составляет 54,2 %. На среде с максимальным содержанием М^Б04 получили минимальное количество ВМФ — 50,5 %. Добавление М£504 привело к снижению СМФ по сравнению с контролем на 43,0 %. С увеличением концентрации ионов

Mg2+ количество синтезируемой СМФ не ме- превышает количество НМФ в контроле.

няется.

Количество НМФ с увеличением концентрации М^Б04 в питательной среде снизилось с 7 до 4 %. Максимальное количество НМФ получили на среде с концентрацией М^304, равной 0,02 %, что практически в три раза

Таким образом, исходя из наших результатов, можно сделать вывод, что добавление соли М^2+ приводит к увеличению ВМФ и НМФ декстрана и снижает количество СМФ

Оптимальная

декстрана.

MgS04 — 0,02 %.

концентрация

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Блинов Н. П. Химическая микробиология/ Н. П. Блинов — М. : Высш. шк., 1989. 448 с.

2. Захаров Н. Я. Методы изучения микробных полисахаридов / Н. Я. Захаров, JI. В. Косенко. Киев : Наукова Думка, 1982. 192 с.

3. Козинер В. Б. Механизм действия полиглюкина / В. Б. Козинер, Н. А. Федоров. М : Медицина, 1974. 190 с.

4. Пекин Б. Биосинтез декстранов штаммами Leuconostoc различного происхождения / Б. Пекич, Л. Вбрашки, М. Хаун // Прикладная биохимия и микробиология. 1991. Вып. 6. С. 27—31

5. Преображенская М. Е. Декстраны и декстраназы / М. Е. Преображенская / / Успехи биологической химии. 1975. Вып. 16. С. 214—235.

6. Промышленная микробиология / 3. А. Аркадьева, А. М. Безбородое, И. Н. Блохина и [др.]. М. : Высш. школа, 1989. 688 с.

7. Регламент культивирования Leuconostoc mesenteroides в производстве полиглюкина на основе декстранов. Саранск, 1979. 350 с.

8. Роуз Э. Химическая микробиология / Э. Роуз М. : Мир, 1971. 294 с.

9. Bradford М. М. A rapid and sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein — Dye Birding / M. M Bradford / / Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248—254.

10. Characterization of the different dextransucrase activities excreted in glucose, fructose, or sucrose medium by Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 / M. Dols, M. Remaud-Simeon, R. M. Willemot, M. Vignon, P. Monsan // Appl. and Environ. Microbiol. 1998. Vol. 64, № 4. P. 1298—1302.

11. Foucaud C. Development of a chemically defined medium for the growth of Leuconostoc mesenteroides / C. Foucaud, A. Francois, J. Richard // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 301—304.

12. Gerirain-Alpettaz V. Identification and characterization of an oligopeptide transport system in Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides CNRZ 1463. / V. Germain-Alpettaz, C. Foucaud-Scheunemann// Lett Appl Microbiol. 2002. V. 35, № 1. P. 68—73.

13. Goyal A. Effect of certain nutrients on the production of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F./ A. Goyal, S.S. Katiyar // J. Basic Microbiol. 1997. Vol. 37, № 3. P. 197—204.

14. Holzapfer W. H. The genus Leuconostoc. / W. H. Holzapfer, U. Scillinger // The Procariotes. New-York : Springer Verlag, 1992. V. 2. P. 1508—1534.

f/оступила 04.02.08.