CC BY
88
УДК 582:577
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ IN VITRO, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И БИОХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ HOMOBASIDIOMYCETIDAE, ОБРАЗУЮЩИХ ЭКТОМИКОРИЗУ С ХВОЙНЫМИ
О.Б. Вайшля, А.А. Ведерникова
Т омский государственный университет 634050 Томск, пр. Ленина, 36; e-mail: [email protected]
Изучены некоторые виды родов Amanita, Boletus, Cortinarius, Suillus, Tricholoma. Проведено выделение в чистую культуру, идентификация по макро- и микропризнакам, последовательностям 5,8S р-ДНК, исследованы особенности роста и биохимического состава при культивировании in vitro.
Ключевые слова: Homobasidiomycetidae, эктомикориза, культивирование in vitro
Genuses of Amanita, Boletus, Cortinarius, Suillus, Tricholoma were studied. Cultures from fruit body, identification by macro-, micromorphological characteristics and DNA sequences were obtained. Peculiarities of growth, biochemical composition of cultures were analyzed.
Key words: Homobasidiomycetidae, ectomycorrhiza, in vitro culture
ВВЕДЕНИЕ
Интерес к феномену симбиоза корней растений с грибами-макромицетами не угасает с описания Франком в 1885 году практически всех типов EcM - эктомикориз (Roman et al., 2005; Agerer, 2008). Известно, что 8000 видов высших растений и 7000 -10000 видов грибов планеты образуют EcM, которая рассматривается как реципрокный муту а-лизм/паразитизм, зависящий от генетических и эк о-логических факторов (Tedersoo, 2007). Обязательная микотрофность хвойных как основных лесоо б-разующих пород фитоценозов бореальной зоны обусловлена участием эктомикоризных грибов в круговороте биогенных элементов, а также спосо б-ностью EcM оптимизировать метаболизм растений, усиливать минеральное питание и усто йчивость к засухе, засолению, тяжелым металлам, патогенам (Smith and Read, 1997). В случае мутуалистических отношений EcM-грибы получают от растений 1050 % органического углерода и становятся конкурентноспособными в почве, а растения имеют во з-можность пользоваться коммуникационной по д-земной сетью из мицелия EcM-грибов и корневых систем разных видов деревьев, по которой передв и-гаются различные метаболиты, вода, источники энергии, кофакторы, витамины, гормоны, антиби о-тики, токсины и, возможно, генетическая информ а-ция.
Изучение экологии и физиологии EсM сосредоточено в основном в Европе, Северной Америке и Австралии (Smith and Read, 1997). В России различными аспектами EсM занимались многие исследователи: Возняковская Ю.М., Худяков Я.П., Шубин В.И., Чумак Н.Ф., Ахромейко А.И., Лобанов Н.В., Гельцер Ф.Ю., Ванин С.И., Зерова М.Я.,
*Работа поддержана грантом № 10-2006 конкурса технологических инновационных проектов по приоритетным направлениям экономики Т омской о бласти
Селиванов И.А., Еропкин К.И., Шемаханова Н.М., Красовская И.В., Частухин В.Я., Катенин В.Е., Саляев Р.К., Иванова Р.Н., Коротков Г.П., Семенова Л.А., Мишустин Е.Н., Пушкинская О.И., Каратыгин И.В. и другие. В настоящее время те или иные аспекты EсM изучают Шубин В.И. - в Карелии, Коваленко А.Е., Иванов Д.М. - в Санкт-Петербурге, Воронина Е.Ю. - в Москве, Творож-никова Т.А. - в Сыктывкаре, Веселкин Д.В. - в Екатеринбурге, Шкараба Е.М. и Бойко Т.А. - в Перми. Насколько нам известно, на терр итории Сибири различные виды EсM хвойных изучает только Д.В. Веселкин, а также эстонские ученые -но EcM, образуемую грибами рода Tomentella (Koljalg, 1996). Целью нашей работы являлось введение в культуру Amanita muscaria (L.: Fr) Hook; Amanita pantherina (Fr.) Secr.; Amanita porphyria (Alb. & Schw. ex Fr.); Boletus betulicola (Vasil ’kov) Pilat & Dermek; Boletus pin ophyllus (Pilat & Dermek); Cortinarius caninus (Fr.) Fr.; Suillus bo-vinus (Linnaeus: Fr.) O. Kuntze; Suillus luteus (Fries) S. F. Gray, Nat.; Suillus sibiricus (Singer) Singer; Suillus variegatus (Sw.) Kuntze; Tricholoma portento-sum (Fr.) Quel, изучение особенностей роста, молекулярная идентификация и определение соде ржания глюкозы, белка, фитогормонов и флавоно и-дов в культуральной жидкости.
Культивирование in vitro. Плодовые тела EcM-грибов собирали в бруснично-лишайниковых, зе-леномошно-лишайниковых, зеленомошных сосняках правобережной части реки Обь в Томской о б-ласти. Определение было проведено Н.Н. Агаф о-новой, исходные штаммы хранятся в коллекцио н-ном фонде «Mycota» Томского университета. Для получения изолята плодовое тело надрезали в нижней части ножки вдоль волокон прокаленным скальпелем и затем расщепляли в напра влении разреза вместе со шляпкой. Из участка перехода ножки в шляпку вырезали кусочки трамы длиной несколько миллиметров и помещали на агариз о-
ванную питательную среду, разлитую косым слоем в пробирки. Через 14 суток культивирования при +24 °С отбирали пробирки с растущим грибным мицелием без посторонней микрофлоры и выращивали биомассу, идентифицировали по в и-довым макро- и микропризнакам. Прописи сред культивирования, красителей приводятся в книге Kreisel (1987).
Идентификация. Из одной пробы каждого штамма засевали чашки Петри с разными видами сред в трех повторностях. Через 5 суток изучали макроморфологические характеристики (Hutchinson, 1991) - скорость роста, структуру и цвет колоний, пигментацию агара, запах; микроморфол о-гические признаки - пряжки, морфологическую дифференциацию и толщину гиф (Рис. 1 -А). Выделение и очистку ДНК проводили с помощью наборов «Quiagen» (Германия), ПЦР и секвениро-вание - по Von Clapp (1996). Для амплификации области ITS1-5.8S-ITS2 (Internal Transcribed Spacer) рибосомальной ДНК использовали общий для грибов праймер ITS1F
(5 CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA 3’) и специфичный для базидиомицетов праймер ITS4B (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC 3’). Полученные последовательности сравнивали с сиквенсами б азы данных UNITE в программе BLAST.
Биохимический состав. Содержание белка в культуральной жидкости определяли с Кумасси-G250, глюкозы - с феррицианидом калия, флаво-ноидов - с AlCl3, фитогормоны - иммунофермент-ным методом с помощью наборов «Olchemim» (Чехия). Индивидуальные флавоноиды разделяли хроматографией на бумаге «FN-11» в системе растворителей бутанол:уксусная кислота:вода (4:1:2). Спектры флавоноидов прописывали на спектроф о-тометре «UV-1601 РС» (Shimadzu, Япония).
В данной публикации мы приводим результаты исследования некоторых культур. Все изуче н-ные виды хорошо росли на твердых питательных средах, однако, в зависимости от состава среды, характеристики роста различались. Так, при ро сте на средах BA, MEA, PDA Suillus bovinus образует белый высокий воздушный мицелий, гифы спут а-ны и растут во всех направлениях. Колонии белокремовые, с краями желтовато -белого цвета, по
мере культивирования приобретающие роз овато-кремовую окраску. На поверхности воздушного мицелия после месячного роста часто наблюдаю т-ся экссудаты в виде желто-коричневых капель. Выделяет в среду пигмент желто -коричневого или темно-коричневого цвета. Культура же Amanita pantherina образует на средах BA, MEA и PDA колонии, очень различающиеся по характеру роста и пигментации (рис. 1-Б). В жидкой культуре глубинное культивирование было возможным для Suillus (образуют шарики из гиф), у Amanita наблюдали только поверхностный рост. Динамику роста грибов в жидкой кул ьтуре изучали на среде «сусло-агар» и среде «Худякова-Возняковской», строя кривые роста по уменьшению содержания глюкозы и увеличению водорастворимого белка. Показана их обратная корреляция друг с другом.
В природных условиях визуально весьма з а-труднительно выяснить, какие именно виды гр и-бов являются микориз ообразующими для той или иной древесной породы. Мицелии разных видов ЕсМ-грибов могут хорошо развиваться под землей и перекрываться, но при этом мицелий одного ЕсМ-вида с помощью вторичных метаболитов может подавлять плодоношение других видов. Не всегда, даже часто посещая определенное место в лесу, можно застать момент плодоношения опр е-деленного вида гриба. Кроме того, известно, что около 50 % плодовых тел в лесных ценозах пре д-ставлено таким массовым родом, как Cortinarius, однако только 5 % мицелия этих грибов обнаруживается в составе EcM. И наоборот, грибы рода Tomentella имеют крошечные плодовые тела, а в 60 % эктомикориз грибной компонент представлен мицелием именно этого рода. Не смотря на то, что, что грибы родов Cortinarius, Tricholoma, Suiluus образуют очень специфичную эктомикор и-зу, важно знать вид гриба-микоризообразователя для того или иного вида хвойного дерева. В кач е-стве примера молекулярной идентификации ЕсМ-грибов приводим сиквенс 5,8 S р-ДНК длиной 695 нктд того образца Cortinarius, вид которого без ДНК-анализа определить было затруднительно, это оказался Cortinarius caninus (рис.2). Сиквенс передан в Genbank NCBI, где ему присвоен номер депонирования 1041618.
Рисунок 1 - Изучение морфологических признаков Cortinarius caninus (а) и особенностей роста Amanita pantherina на средах (б): сусло-агаре BA, мальтозном экстракте MEA, картофельно-декстрозном агаре PDA
б
а
TAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCAT
TATTGAAATAAACCTGATGGGTTGCTGCTGGTTCT TTAATGAACATGTGCGCACTTG
TCATCTTTATATCTCCACCTGTGCACCTTTTGTAGACCTGGACAAGTTTCTTAATGCT
AGCATTGAGGTTTTGGGATTGACTTTGTCTCTCCTTATGTCTCCAGATCTATGTTTAT
TCATATACCCTAATGTATGTTATAGAATGTAATAAAGTGGGCCTTTGTGCCTATAAC
ACTATACAACTTTCAGCAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCG
AAATGCGTAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCA
CCTTGCGCTCCTTGGTATTCCGAGGAGCATGCCTGTTTGAGTGTCATTAATATATCAA
TCTCTTAAGCTTTTGCTTGTTGAGTGTTGGATGTGGGGGCCTTTTTGCTGGTCTTTTA
AAAGAGATCAGCTCCCCTAAAATGTATTAGCGGAACATTTTGTTGACCGTTCATTGG
TGTGATAATTATCTACGCTATTGACGTGAG GCAGTTCAGCTTCTAACAGTCCATTGA
CTTGGACAGTTTTTCATTAATGTGACCTCAAATCAGGTAGGAC-
TACCCGCTGAACTTAAGCATA
б
а
Рисунок 2 - Некоторые этапы молекулярной идентификации Cortinarшs canmus: а - проверка чистоты амплифицированного методом ПЦР участка 1Т81-5.88-1Т82 р-ДНК; б - идентификация полученной последовательности в международном банке данных
Последовательности 5,8Б р-ДНК и плодового тела, и культуры оказались идентичны, что свид е-тельствует о чистоте полученной культуры Согй-папиз саптш. Для БиШш Ъоутш таким же образом была подтверждена идентичность плодового тела, полученной из него культуры и мицелия гриба из ЕсМ, образованной после микоризации данным штаммом стерильных сеянцев сосны горной Ртш шоМапа.
В дополнение к классическим анатомоморфологическим описаниям ЕсМ-грибов очень ценными являются биохимические характеристики чистых культур, хотя это искусственное и стресс о-вое состояние для грибов-микоризообразователей. Растительные флавоноиды и гормоны вовлечены в самые разнообразные растительно -микробные взаимоотношения, в частности, в очень низких концентрациях рутин и зеатин индуцируют ветвл е-ние и рост гиф эктомикоризных грибов (Та§и,
2002). Грибные гифы также могут продуцировать ризосферные сигналы ауксиновой природы, напр и-мер, ИУК - морфогенетический сигнал для увеличения скорости роста корешков и образования новых меристем для молодых боковых корней, кот о-рые и колонизирует гриб. Биологически активные вещества были измерены в середине log-фазы кривой роста. В 10- дневной культуре Suillus sibiricus на среде Худякова-Возняковской мы обнаружили три индивидуальных цитокинина, ИУК и, к нашему удивлению, флавоноиды (табл. 1). В среде Худяко-ва-Возняковской фитогормоны отсутствовали. Интересно отметить, что б ольшая часть флавоноидов культур, судя по цвету пятен в ультрафиолете, относится к классу агликонов. Например, в культуре Amanita pantherina обнаружено 2 агликона с rf=0,53 и rf=0,85, спиртовый экстракт последнего имеет 3 максимума в спектре поглощения: 244 нм, 258 нм и 281 нм.
Таблица 1 - Содержание фитогормонов и флавоноидов в 10-дневной культуре Suillus sibiricus_______________________
гг г л л , Индолилуксусная ,
1рансзеатинрибозид, Изопентениладенозин, Дигидрозеатинрибозид, Сумма флаво-
фМ фМ пМ ”та’ нодов, мкг/мл
18+13 267+12 21 ±1,5 35+17 52+29
Поскольку в культурах всех штаммов уровни гормонов и флавоноидов различались - и между видами, и в пределах одного вида, вероятно, это отражает биохимическую стратегию образов ания микориз с конкретным типом хозяина - подобно тому, как это происходит в случае других раст и-тельно-микробных взаимоотношений, таких как Rhizobium или эндомикориза (Zeppa et al., 2005).
Изученные морфологические и биохимич еские особенности введенных нами в культуру эктомик о-ризообразующих грибов позволили оформить па спорт того или иного штамма, необходимый для регистрации в коллекции, и депонировать их под н о-мерами: Suillus sibiricus (6) - LE (BIN) 2178; Corti-narius variicolor (14) - LE (BIN) 2179; Suillus luteus (34) - LE (BIN) 2180; Suillus bovines (38) - LE (BIN) 2181; Amanita porphyria (69) - LE (BIN) 2182; Amanita pantherina (70) - LE (BIN) 2183.
Авторы выражают глубочайшую признатель-
ность куратору коллекции культур базидиом ицетов Ботанического института им. В.П. Комарова РАН Н.В. Псурцевой за помощь в освоении мет одик культивирования и за депонирование изученных культур.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Agerer, R. (ed.). Colour Atlas of Ectomycorrhizae. Ei nhorn-Verlag, Schwabisch Gmund. - 1996-2008. - V. I - VI. Hutchinson L.J. Description and identification of cu ltures of ectomycorrhizal fungi found in North America // Myco-taxon, 1991. - V.XLII. - P.387-504.
Koljalg Urmas. Tomentella (Basidiomycota) and related ge n-era in Temperate Eurasia / Oslo. - Fugiflora. - 1996. -213 p.
Kreisel H., Schauer F. Methoden des mycologischen Labor a-toriums / 1.Aufl. - Jena:Gustav Fisher Verl. - 1987. -181 S.
Roman M., Claveria V., Miguel M. A revision of the descri p-
tions of ectomycorrhizas published since 1961 // Myco logy research. The British Mycological Society. UK, 2005. - T.109 (10). - P. 1063 - 1104.
Smith S.E., Read D.J. Mycorrhizal Symbiosis. - London: Academic Press Limited. - 1997. - 514p.
Tagu D., Lapeyrie F., Martin F. The ectomycorrhizal symbi o-sis: genetics and development // Plant and Soil, 2002.-V.244- P.97-105.
Tedersoo Leho. Ectomycorrhizal fungi: diversity and community structure in Estonia, Seyshelles and Australia /
Dissertationes Biologicae Universitatis Ta rtuensis.-Tartu Ulikooli Kirjastus.- 2007.- 54 p.
Von J.P. Clapp. Species diagnostics protocols / Humana Press. - Veroffentlicht. - 1996. - 416 S.
S. Zeppa, D. Sisti, R. Pierleoni, L. Potenza, M. Guescini, L. Vallorani, V. Stocchi. Tilia platyphyllos Scop.-Tuber brumale Vittad. vs. T. platyphyllos Scop.-T. borchii Vit-tad. ectomycorrhizal systems: a comparison of structural and functional traits // Plant Physiology and Biochemistry. 2005. № 43. P. 709-716.
Поступила в редакцию 28 января 2009 г. Принята к печати 13 марта 2009 г.
