CC BY
150
УДК 630.86.582.477.6
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ХВОЙНЫХ В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Ж.А. Плынская, Е.Н. Аёшина, Н.А. Величко
ГОУ ВПО «Сибирский государственный технологич еский университет» 660049 Красноярск, пр. Мира, 82; e-mail: [email protected]
Традиционные способы переработки лекарственного сырья не обеспечивают высокие потребительские сво й-ства производимой продукции. В целях совершенствования использования ресурсов лекарственных растений края необходимо применять меры к внедрению современных технологий перер аботки сырья, ориентированных на выпуск экологически чистой продукции с высокими потребительскими качествами. Одной из таких технол о-гий является культура клеток и тканей растений in vitro, которая, кроме того, рассматривается как нетрадицио н-ный метод охраны лекарственных растений. Целью данной работы явилось введение в культуру in vitro эфедры односемянной (Ephedra monosperma СЛ. Meyer) и можжевельника сибирского (Juniperus sibirica), исследование химического состава интактного растения и каллу сной ткани этих хвойных.
Ключевые слова: культивирование, культура клеток, каллус, регуляторы роста, биологически активные вещества
Traditional ways of processing of medicinal raw material do not provide high consumer properties of made produ c-tion. With a view of pe rfection of use of resources of herbs of territory, it is necessary to apply measures to introduction of modern technologies of processing of the raw material, focused on release of non -polluting production with high co n-sumer qualities. One of such technol ogies is the culture of cells and fabrics of plants in vitro, which besides it is cons idered as a no conventional method of protection of herbs. The purpose of the given work was introduction in culture in vitro Ephedra monosperma C.A. Meyer and a Juniperus sibirica, research of chemical compound intact plants these co n-iferous.
Key words: cultivating, culture of cells, callus, regulators of growth, biologically active substances
ВВЕДЕНИЕ
С использованием метода культивирования тканей и органов растений в настоящее время со з-дан ряд клеточных технологий, позволяющих пол у-чать ценные вторичные продукты метаболизма ра с-тений, такие, как гликозиды, алкалоиды, некоторые другие биологически активные вещества, имеющие широкое применение в качестве лекарственных препаратов, пищевых красителей, ароматизаторов и др. (Грандберг, 1987; Гринкевич, 1991).
Преимуществом создаваемых клеточных культур по сравнению с традиционным растительным сырьем (дикорастущие или выращиваемые на пла н-тациях растения) является:
- получение продукта независимо от вне ш-них климатических, почвенных условий и возмо ж-ность культивирования клеток растений;
- оптимизация и стандартизация условий выращивания.
Культивируемые клетки и ткани могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях, а также онтоген е-за, генетики, растительной вирусологии и др. Пр о-стота клеточных моделей, возможность быстро п о-лучать достаточную биологическую массу в асе п-тических, контролируемых по многим параметрам условиях выращивания является преимуществами такого моделирования (Рубцов, 1971; Машковский, 1978; Гаммерман, 1990).
Применение методов культуры изолированных органов и тканей in vitro открывает большие перспективы для массового воспроизводства и сохр а-
нения ценного генофонда древесных и травянистых растительных форм с помощью клонального микроразмножения. За последние десять лет различными биотехнологическими лабораториями вв о-дятся в культуру многие виды растений. Кроме т ого, создаются коллекции для их дальнейшего тиражирования, поскольку при клональном микроразмножении появляется возможность круглогодичн ого воспроизводства растений в требуемых колич е-ствах для целей интродукции, оздоровления и юв е-нилизации растительного материала. Таким образом, проблема сохранения генофонда может быть решена с помощью биотехнологических подходов (Муравьёва, 1983; Минаева, 1991; Полевой, 1978).
Настоящая работа посвящена изучению во з-можности введения в асептическую культуру Ephe-dra monosperma C.A. Meyer и Juniperus sibirica.
Ephedra monosperma C.A. Meyer (эфедра односемянная) относится к семейству хвойниковых (Ephedraceae). Представляет собой кустарник выс о-той до 30 см. Цветет во второй половине мая - первой половине июня, семена созревают в конце авг уста. Место произрастания - сухие каменистые склоны, каменные степи (Муравьёва, 1983).
Jniperus sibirica (можжевельник сибирский) представлен семейством кипарисовых
(Cupressaceae F.W.Neger). Двудомный, густоветвистый, низкорослый, стелющийся кустарник. Побеги легко укореняются, они невыраженно трехгранные с укороченными междоузлиями, кора буроватая, хвоя игольчатая, серповидная, прижатая к ветвям, узколанцетная, колючая. Шишкоягоды 2-3 семян-ные, шаровидные, до 12 мм в поперечнике, темно
Хвойные бореальной зоны, XXV, № 1 -2, 2008
синего или черного цвета, семена светло-бурые, трехгранные, на спинке сетчато -морщинистые, длиной 4-5 мм (Минаева, 1991).
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ КУЛЬТУРЫ
При работе с культурами клеток необходимо вести контроль роста и жизнеспособности культуры. При культивировании каллусной ткани для одного измерения обычно используют от 3 до 10 п о-вторностей (пробирок с растущим эксплантом).
В работе при проведении оценки роста культ у-ры использовали независимую выборку по 10 пр о-бирок для обсчёта средних экспериментальных значений каждой точки на вариантах среды. Для оценки роста каллусной культуры применяли вес о-вой метод, взвешивая на аналитических весах извлечённый из пробирки пинцетом каллус. Измерения производились каждые 4 дня (Бутенко, 1971; Катаева, 1980).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Введение в культуру in vitro Ephedra monosperma СЛ. Meyer и Juniperus sibiriсa. Обязательным условием для микроклонального размножения я в-ляется использование объектов, полностью с охраняющих генетическую стабильность. Этому условию удовлетворяют молодые побеги (8-12 мм) и пазушные почки стеблевого происхождения (5 -7 мм).
На начальном этапе важно было подобрать оптимальные условия для стерилизации эксплантов Ephedra monosperma СЛ. Meyer и Juniperus sibiriсa. В результате эксперимента было установлено, что наиболее приемлемым стерилизующим агентом для Juniperus sibirica оказался 0,1 % раствор диацида с добавлением твина-80 (1-2 капли на 1 л воды). А для стерилизации Ephedra monosperma СЛ. Meyer была более оптимальна двухступенчатая стерил и-зация. На первой ступени в роли стерилизующего агента использовали 0,1 % раствор KMnO4, а на второй ступени 0,1 % раствор диацида с добавлен и-ем твина-80 (1-2 капли на 1 л воды). Стерилизация
при этих условиях составила 97 %. Стерильные побеги вводили на агаризованные питательные ср еды с минеральным составом по Murashige and Skoog (1962), Schenk and Hildebrandt (1972), Uata (1939), Knop (1865) и Sierlis (1964) без добавления регуляторов роста. Полученные результаты эксп е-римента показали, что наиболее благоприятной средой для культивирования эксплантов оказалась питательная среда, содержащая соли по Murashige and Skoog (MS) с добавлением 30 г/л сахарозы и витаминов: пиридоксина, тиамина хлорида и ниа-цина в количестве по 1мг/л (Бутенко, 1971; Катаева, 1980; Гутман, 1980).
Известно, что наиболее важными компонент а-ми питательной среды, определяющими каллусог е-нез, являются регуляторы роста. Для культивиров а-ния Ephedra monosperma СЛ. Meyer и Juniperus sibirica в условиях in vitro были использованы регуляторы роста.
Каллусогенез инициировали из молодых побегов Ephedra monosperma СЛ. Meyer и Juniperus sibi-rica на средах с различными концентрациями 2,4 -Д (2,4-Дихлорфенокси-уксусная кислота), а-НУК (а-Нафтилуксусная кислота), 6 -БАП (6-Бензиламинопурин) и КИН (6-Фуфуриламинопу-рин (кинетин)). Присутствие в питательной среде экзогенного регулятора 2,4-Д оказало наибольшее влияние на процесс инициации каллусогенеза можжевельника сибирского и эфедры односемя н-ной. Образование каллусной ткани эфедры однос е-мянной происходило на средах с присутствием а-НУК и 6-БАП, чего не наблюдалось на эксплантах можжевельника сибирского. Полученные результ а-ты свидетельствуют о том, что культуру можж е-вельника можно отнести к ауксинозависимой, а культуру эфедры односемянной как к ауксинозав и-симой, так и цитокининзависимой.
Представляло интерес сравнения химического состава интактного растения и каллусной ткани Ephedra monosperma СЛ. Meyer и Juniperus sibirica, полученной при культивировании на питательной среде Murashige and Skoog.
Сравнение химического состава интактного растения и каллусной ткани Ephedra monosperma СЛ. Meyer и Juniperus sibirica приведено в таблице 1.
Таблица 1 - Групповой химический состав интактного растения и каллусной ткани Ephedra monosperma С.А. Meyer и Juniperus sibirica_
Содержание компонента, % к а.с.м.
Ephedra monosperma C.A.Meyer
Наименование компонента
Juniperus sibirica
Интактное растение (одревесневший _стебль)_
Каллусная ткань
Интактное растение (хвоя)
Каллусная ткань
Легкогидролизуемые полисахариды
Трудногидролизуемые полисахариды
Лигноподобные вещ ества Экстрактивные вещества Зольные компоненты
26,50±0,05
15,76±0,02
35,80±0,02 16,15±0,05 7,40±0,04
28,18±0,07
14,03±0,04
20,11±0,02 28,45±0,04 9,95±0,03
13,90±0,08
24,27±0,01
19,13±0,08 37,46±0,07 4,77±0,06
12,46±0,10
23,82±0,14
22,41±0,34 36,52±0,35 4,50±0,12
Из результатов таблицы 1 следует, что на и-большую часть в каллусной ткани Ephedra monosperma С.Л. Meyer в отличие от интактного растения
составляют экстрактивные вещества 28,45 %, зольные компоненты 9,95 %, легкогидролизуемые полисахариды 28,18 %. А каллусная ткань Juniperus
sibirica наиболее богата лигноподобными веществами 22,41 %, в отличие от интактного растения. По другим компонентам группового состава хвоя и каллусная ткань Juniperus sibirica незначительно отличается.
Наибольшую ценность в каллусной ткани и и н-тактном растении представляют биологически а к-тивные вещества. Содержание некоторых биологически активных веществ Ephedra monosperma C.A. Meyer и Juniperus sibirica приведено в таблице 2.
Таблица 2 - Содержание биологически активных веществ в интактном растении и каллусной ткани Ephedra monosperma C.A. Meyer и Juniperus sibirica_
Содержание компонента, % к абсолютно сухой массе
Ephedra monosperma C.A. Meyer Juniperus sibirica
Наименование компонента Интактное растение (одревесневший стебль) Каллусная ткань Интактное растение (хвоя) Каллусная ткань
Сапонины 4,205±0,04 2,410±0,05 0,310±0,09 0,190±0,08
Флавоноиды 0,021±0,04 0,050±0,04 0,028±0,02 0,135±0,02
Алкалоиды 0,041 ±0,08 1,128±0,03 0,290±0,01 0,710±0,06
Витамин Р 0,910±0,06 1,614±0,01 4,680±0,06 5,520±0,05
Витамин С 0,001±0,02 0,002±0,09 21,780±0,08 11,520±0,04
Дубильные вещества 1,871±0,08 1,993±0,05 5,400±0,06 6,780±0,08
Из таблицы 2 следует, в одревесневших стеблях Ephedra monosperma C.A. Meyer алкалоиды найдены в небольших количествах, и поэтому использ о-вать их для приготовления лекарственных средств на основе алкалоидов неэффективно. Однако они характеризуются высоким содержанием сапонинов 4,205 %, вследствие чего могут найти применение в парфюмерной и текстильной промышленности. В каллусной ткани Ephedra monosperma C.A. Meyer содержание алкалоидов 1,128 %, это во много раз больше, чем в итактном растении. Также каллусная ткань богата витамином Р и дубильными веществ а-ми и флавоноидами.
Каллусная ткань Juniperus sibirica по отношению к интактному растению содержит значител ь-ное количество флавоноидов 0,135%, алкалоидов 0,710 %, витамин Р 5,520 % и дубильных веществ 6,780 %.
ВЫВОДЫ
Исследования показали, что обе культуры Ephedra monosperma C.A. Meyer и Juniperus sibirica успешно введены в культуру in vitro. Результаты по введению в культуру in vitro свидетельствуют о том, что культуру можжевельника можно отнести к ауксинозависимой, а культуру эфедры односемя н-ной как к ауксинозависимой, так и цитокининзави-симой.
Проведенные исследования по содержанию биологическиактивных веществ показали, что ка л-лусная ткань Ephedra monosperma C.A. Meyer и
Juniperus sibirica являются перспективным объектом для биотехнологии и могут быть рекомендов а-ны в качестве потенциального сырья для получения биологически активных в еществ.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
Бутенко, Р.Г. Культура тканей и клеток растений [Текст] /
Р. Г. Бутенко, - М.: Знание, 1971. - 46 с. Грандберг, И.И. Органическая химия [Текст] / И.И.
Грандберг.- М.: Высш. шк., 1987.- 480 с. Гринкевич, Н.И. Лекарственные растения Текст] / Н.И.
Гринкевич. - М.: Высш. шк., 1991.- 420 с. Гутман, Г.С. Новый способ получения культуры тканей высших растений / Г.С. Гутман, Г.А. Ширяева // Растительные ресурсы.- 1980. - 16 N° 4. - С.601-606. Катаева, Н.В. Клональное размножение растений в культуре ткани / Н.В. Катаева, В.А. Аветисов // Культура клеток растений и биотехнология. - М.: Наука, 1980. - С.116-121.
Лекарственные растения: справ. пособие. 4 -е изд. [Текст] / А.Ф. Гаммерман, [и др.].- М.: Высш. шк., 1990.- 543 с. Машковский, М.Д. Лекарственные средства [Текст] / М.Д.
Машковский. - М.: Медицина, 1978.- Ч.1.-265 с. Минаева, В.Г. Лекарственные растения Сибири. 5 -е изд., перераб. и доп. [Текст] / В. Г. Минаева. - Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1991.-431 с. Муравьёва, Д.А. Тропические и субтропические лекарс т-венные растения [Текст] / Д.А. Муравьёва. - М.: Медицина, 1983.-336 с. Полевой, В.В. Физиология растений: учеб. для вузов
[Текст] / В.В. Полевой. - Л., 1978.- 382 с. Рубцов, М.В. Синтетические фармацевтические препараты [Текст] / М.В. Рубцов, А.Г. Байчиков.- М.: Медицина, 1971.- 320 с.
Поступила в редакцию 8 февраля 2008 г. Принята к печати 16 мая 2008 г.
