CC BY
86
УДК 616.351-006-089
В.И. Жуков, С.В. Перепадя, Ю.А. Винник, О.В. Зайцева, А.С. Моисеенко
ОКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБРАН У БОЛЬНЫХ РАКОМ ПРЯМОЙ КИШКИ
Харьковский национальный медицинский университет (г. Харьков)
Исследование выполнено в рамках приоритетной научно-технической темы МОЗ Украины «Розробка технології хромомоду-льованої радіохемотерапії іноперабельних хворих на рак шийки матки і прямої кишки» (№ держреєстрації 0104Ш00166 від 2008 р.) и является фрагментом диссертационной работы.
Вступление. Трансформация нормальной клетки в злокачественную сопровождается нарушением структурно-функционального состояния ее мембран и всех видов обмена веществ - жирового, водно-солевого, углеводного, белкового и нуклеинового, то есть нарушается баланс в системе структурнометаболические процессы - функция биологических мембран. Важную роль в формировании физико-химических представлений о механизмах данной трансформации сыграла гипотеза академика Н.М. Эммануэля о свободнорадикальной природе процессов, лежащих в основе развития канцерогенеза [14]. В настоящее время подробно изучены вопросы состояния перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной системы (АОС) в опухолевых и немалигнизированных тканях на различных моделях, показано значение свободных радикалов и продуктов ПОЛ в развитии мембранной патологии [3,5,8,13].
Актуальным представляется определение вклада разных видов реакций свободно радикального окисления (СРО) в этиологию наиболее распространенных и опасных заболеваний, в том числе онкологических, а также установление основных механизмов защитного действия антиоксидантных систем организма на различные звенья патологического процесса (этапы, стадии, фазы) и доказательство существования определенной направленности защитного влияния АОС на определенные молекулярные биоструктуры, в первую очередь, на главные из них - ядерный геном и биомембраны [1].
Целью работы явилось изучение свободнорадикальных процессов, ПОЛ и состояния АОС у больных колоректальным раком, а
также выявление особенностей структурнофункционального состояния мембран клеток крови для возможного использования в прогнозировании степени тяжести заболевания и эффективности адекватного лечения.
Объект и методы исследования. Изучены реакции свободнорадикальных процессов, перекисного окисления липидов, окислительной модификации белков и структурнофункциональное состояние мембран эритроцитов и лимфоцитов у больных (п=68) раком прямой кишки (РПК) в возрасте 35-78 лет с различными стадиями развития опухолевого процесса, что подтверждено клиническими и гистоморфологическими методами. В зависимости от стадии заболевания распределение больных было следующим: первая (I) стадия выявлена у 6 пациентов (4 мужчины, 2 женщины), вторая (II) - у 12 (7 мужчин, 5 женщин), третья (III) - у 33 (19 мужчин, 14 женщин) и четвертая (IV) - у 17 онкологических больных (11 мужчин, 6 женщин). Группу сравнения (п=21) представляли условно здоровые доноры аналогичного возраста и пола (12 мужчин, 9 женщин). Все больные находились на стационарном лечении в отделениях Харьковского областного онкологического центра. Реакции СРО, ПОЛ, компоненты АОС и структурно-функциональное состояние мембран изучали при поступлении больных в отделение перед проведением соответствующего лечения. О реакциях СРО в плазме крови судили по Н202 индуцируемой люминол-усиленной биохемилюминесценции сыворотки крови с использованием хемилюминометра ХЛМЦ 1-01. Содержание молекулярного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови определяли флуориметриче-ским методом по реакции с тиобарбитуровой кислотой [13]. Диеновые коньюгаты (ДК) исследовали спектрофотометрическим методом [8]. Активность каталазы определяли спектрофотометрическим методом по скорости утилизации Н202 из инкубационной среды в цветной реакции с молибдатом аммония [5]. Пероксидазная активность исследовалась по
скорости окисления п-фенилендиамина перекисью водорода [9,10]. Активность суперок-сиддисмутазы (СОД) крови изучалась спектрофотометрическим методом по степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) [4]. Оксидазная активность церулоплазмина (ЦП) определялась по методу Равина, сущность которого заключается в том, что бесцветная форма хромогена пара-фенилендиамина окисляется в окрашенную сине-фиолетовую форму (Хтах = 530 нм) [11]. Содержание в крови восстановленного глута-тиона (Г^Н) и сульфгидрильных групп ^Н-группы) определялось спектрофотометрическим методом с реактивом Эллмана. Сущность данного метода основана на применении специфического тиолового реагента - 5,5-дитиобис-нитробензойной кислоты (реактив Эллмана), которая в реакции тиолдисульфидного обмена легко восстанавливается SН-веществом, образуя окрашенный в желтый цвет продукт тиони-тробензоат, Хтах = 412 нм [12].
Структурно-функциональное состояние мембран - полярность микроокружения, текучесть, погруженность белков в липидный матрикс изучали по методу Ю.А. Владимирова и Г.Е. Добрецова [2,6,7]. О текучести плазматических мембран лимфоцитов и эритроцитов судили по коэффициенту эксимеризации пирена, представляющего собой отношение количества эксимеров пирена (Хисп = 470 нм) к количеству его мономеров (Хисп = 393 нм). Коэффициент эксимеризации пирена, изменяющийся пропорционально текучести, изучали в зоне белок-липидных контактов (Хвозб = 287 нм) и в липидном бислое (Хвозб = 334 нм). Интенсивность флуоресценции 1,8-АНС, изменяющейся обратно пропорционально поверхностному заряду мембраны лимфоцита, изучали с помощью микроскопа ЛЮМАМ-ИЗ (Хисп = 360 нм, Хисп = 490 нм). Полярность микроокружения зонда в мембране (Хвозб = 334 нм) оценивали по отношению флуоресценции зонда при X = 372 нм к флюоресценции при X = 393
исп исп
нм. О степени погруженности белков в липидный бислой судили по тушению флуоресценции ароматических аминокислот (тирозина и триптофана) в результате безизлучательно-го переноса энергии на молекулу пирена при X б = 282 нм [2].
возб •- л
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием методов вариаци-
онной статистики с оценкой достоверности различий по Стьюденту-Фишеру.
Результаты исследований и их обсуждение. Результаты изучения состояния оксидантно-антиоксидантных процессов у больных раком прямой кишки в зависимости от стадии заболевания отражены в табл.1. Выявлено существенное увеличение в сыворотке крови количества первичных продуктов СРО липидов, имеющих в структуре сопряженные диены, по сравнению с показателем референтной группы. При всех стадиях заболевания отмечалась прямая зависимость между тяжестью патологического процесса и содержанием в сыворотке крови ДК: при I, II, III и IV стадиях развития опухолевого процесса уровни ДК увеличены в 2,4; 2,8; 3,3 и 4,06 раза, соответственно. Сходная динамика содержания в сыворотке крови была присуща и конечному продукту ПОЛ - малоновому диальдегиду: наблюдалось увеличение концентрации в 2,6;
3,1; 3,3 и 3,6 раза.
Активация свободнорадикальных процессов и ПОЛ у больных с онкопатологией сопровождалась усилением ферментативной активности АОС защиты организма. Это подтверждалось повышением активности катала-зы, пероксидазы, супероксиддисмутазы и церулоплазмина, действие которых направлено на предотвращение повреждающего эффекта реакционноспособных форм кислорода (супе-роксидный анион-радикал (02-), гидроксильный ('ОН), алкоксильный ^О), пероксидный радикал ^ОО), перекись водорода (Н202), синглетный кислород (102), гипохлорная кислота (НОС1), оксид азота (ЫО), пероксинитрит (0Ы00-) и др.) [12,13].
Среди низкомолекулярных антиоксидантов наблюдалось снижение восстановленного глутатиона (Г^Н) в сыворотке крови в 1,3; 1,6; 2,2 и 2,6 раза соответственно при I; II; III и IV стадиях развития опухолевого процесса, что свидетельствует об ингибировании системы детоксикации цитотоксических радикалов у больных раком прямой кишки. Необходимо подчеркнуть, что от действия наиболее опасных гено- и цитотоксических радикалов 'ОН в организме нет ферментной защиты, и все функции по обезвреживанию этих частиц осуществляют низкомолекулярные антиоксиданты, среди которых ключевую роль играет глутатион [2,6,7].
Таблица 1
Состояние оксидантно-антиоксидантного гомеостаза у больных раком прямой кишки в зависимости от стадии заболевания
Показатели Группа наблюдения, М±т
Условно здоровые (п = 21) Больные РПК, стадия заболевания
I п=6 II п=12 III п=33 IV п=17
ДК (мкмоль/л) 50,4±9,7 120,3±10,8* 144,8±15,9* 163,7±12,5* 205,2±18,3*
МДА (мкмоль/л) 12,3±3,6 32,4±4,2* 38,6±5,3* 40,5±6,4* 44,6±5,7*
Каталаза (мкат/ гНв) 4,5±1,2 8,3±0,9* 9,6±0,7* 10,3±1,4* 12,7±2,6*
Пероксидаза (мкат/гНв) 12,5±2,8 17,2±1,4* 21,6±1,8* 23,5±2,3* 28,3±3,5*
Глутатионпе-роксидаза (мкат/ гНв) 6,2±0,5 4,3±0,4* 4,1±0,4* 3,4±0,5* 2,6±0,3*
СОД (мкат/мгНв) 0,37±0,1 0,88±0,1* 0,94±0,2* 1,15±0,2* 1,23±0,3*
ЦП (мкмоль/л) 2,6±0,8 4,7±0,5* 5,3±0,5* 6,1±0,5* 6,4±0,6*
Н2О2-индуцир. люминол-усиленная БХЛ ^ имп/сек) 768,3±147,6 549,7±48,4* 462,3±50,4* 345,6±52,3* 270,4±38,2*
Г-ЯН (моль/л) 2,2±0,4 1,7±0,2* 1,4±0,2* 1,2±0,3* 0,9±0,2*
ЯН-группы (ммоль/л) 14,5±2,7 15,9±1,3 22,6±1,8* 25,4±2,1* 28,3±2,5*
Примечание: * - различия с референтной группой «условно здоровые» достоверные, р<0,05.
На фоне снижения содержания в сыворотке крови глутатиона наблюдалось ингибирование активности фермента глутатион-пероксидазы. Так, при I, II, III и IV стадиях заболевания активность фермента снижалась соответственно в 1,4; 1,5; 1,8 и 2,4 раза по сравнению с группой условно здоровых пациентов, что неизбежно может приводить к образованию активных форм кислорода и развитию гипоксии тканей [6,7]. Концентрация свободных сульфгидрильных групп (ЯН-) существенно повышалась в сыворотке крови при II, III и IV стадиях онкопроцесса. По мнению многих авторов, это является следствием нарушения структурно-функционального состояния биомембран и тиолсодержащих макромолекул [2,6,7]. Выход в сыворотку крови свободных сульфгидрильных групп при деструктивных процессах, по всей видимости, является фактором гашения электронных возбужденных состояний и одной из ведущих причин снижения интенсивности Н2О2-индуцированной люминол-усиленной биохемилюминесценции. Ингибирование интенсивности сверхслабого свечения было наиболее высоким при IV стадии канцерогенеза - в 2,8 раза по сравнению с контролем. При этом отмечалось и увеличение
концентрации SН-групп в сыворотке крови более чем в 1,9 раза.
Изучение структурно-функционального состояния плазматических мембран клеток крови (лимфоциты, эритроциты) выявило значительное снижение их текучести в зонах белок-липидных контактов и липидном бислое у больных раком прямой кишки по сравнению с референтной группой условно здоровых (табл.2). Степень выраженности изменений текучести плазматических мембран клеток крови была взаимосвязана с тяжестью течения заболевания. Максимальное снижение текучести наблюдалось при IV стадии патологического процесса: у мембран лимфоцитов - в 1,91 раза; эритроцитов в 1,93 раза. Интенсивность флуоресценции 1,8 АНС в лимфоцитах, отражающая изменение поверхностного заряда плазматических мембран этих клеток, существенно уменьшалась у онкологических больных, что свидетельствует об гиперполяризации мембран и повышении отрицательного поверхностного заряда. В зависимости от стадии и тяжести развития канцерогенеза наблюдалось следующее снижение интенсивности флуоресценции: при I стадии - на 28%, III стадии - на 35%, IV стадии - на 47%.
Таблица 2
Текучесть плазматических мембран лимфоцитов и эритроцитов крови больных раком
прямой кишки (М±т)
Группа наблюдения Лимфоциты Эритроциты
Белок-липидные контакты Липидный бислой Белок-липидные контакты Липидный бислой
Условно здоровые 3,18±0,12 3,26±0,08 2,98±0,12 2,89±0,13
Больные: I стадия 2,23±0,16* 2,40±0,14* 2,15±0,17* 2,30±0,22*
II стадия 1,84±0,11* 2,08±0,17* 1,86±0,14* 1,75±0,16*
III стадия 1,73±0,06* 1,74±0,07* 1,62±0,13* 1,68±0,11*
IV стадия 1,67±0,09* 1,64±0,08* 1,54±0,09* 1,56±0,07*
Примечание: * - различия с группой «условно здоровые» достоверные, р<0,05.
Изучение многими авторами структурнофункционального состояния мембран клеток крови выявило снижение их текучести при ишемической болезни сердца, атеросклерозе, инфаркте миокарда, сахарном диабете, термической травме, интоксикациях и др. [2,6,7]. Это дает основание полагать, что обнаруженные нами изменения текучести плазматических мембран отражают неспецифическую компоненту патогенеза опухолевого роста. Анализ изменения структурных показателей мембран свидетельствует об увеличении их жесткости, повышении ригидности и отрицательного заряда на поверхности плазматической мембраны, что препятствует адсорбции на ней анионного зонда 1,8АНС. Структурное состояние липидного бислоя определяет процессы формирования мембран, гемолиз эритроцитов и разрушение плазматических мембран других клеток. Такое изменение динамического состояния мембран может повлечь за собой изменение активности мембрано-связанных ферментов, нарушить функционирование мембранных транспортных и сигнальных систем, рецепцию различных соединений, межклеточные и адгезивные взаимодействия. Выявленное нами изменение физико-химического состояния липидного матрикса обусловливает переход клетки на новый метаболический уровень и отражает дефектность иммунной системы у онкологических больных, что является одной из характерных черт данной патологии. Значительное повышение вязкости плазматической мембраны приводит к нарушению связей между клетками, развитию микроциркуляторной и иммунной деструкции, утяжеляющих состояние больных [2].
Выводы. Таким образом, результаты исследования обнаружили нарушение кооперативного взаимодействия оксидантно-антиоксидантного гомеостаза у больных раком прямой кишки, а также физико-химических свойств плазматических мембран, которые являются важным
патогенетическим фактором развития канцерогенеза. Прогностически неблагоприятными показателями при оценке степени тяжести заболевания и эффективности лечения являются снижение интенсивности Н202-индуцированной люминол-усиленной биохемилюминесценции сыворотки крови и повышение концентрации свободных сульфгидрильных групп. Оптимизация комплексного патогенетического лечения больных раком прямой кишки должна быть направлена на нормализацию оксидантно-антиоксидантного гомеостаза и физикохимических свойств цитоплазматических мембран.
Перспективы дальнейших исследований.
Предполагается изучить интенсивность свободнорадикальных процессов, перекисного окисления липидов и окислительной модификации белков с использованием Н2О2-индуцированной FеСl3- и люминол-усиленной биохемилюминесценции и фосфоресценции сыворотки крови у больных раком толстого кишечника.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бєленічев І.Ф. Антиоксидантна система захисту організму (огляд) / І.Ф. Бєленічев, Є.Л. Левицький, Ю.І. Губський [та ін.] // Современные проблемы токсикологии. - 2002.-№3. - С. 24-31.
2. Владимиров Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран / Ю.А. Владимиров, ГЕ. До-брецов. - М.: Наука, 1980. - 320 с.
3. Гаврилов Б.В. СФ-метрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови / Б.В. Гаврилов, М.И. Мишкорудная // Лаб. дело. - 1983.-№3. - С. 33-36.
4. Гуревич В.С. Сравнительный анализ двух методов определения СОД / В.С. Гуревич, К.Н. Конторщиков, Л.В. Ша-тилина // Лаб. дело. - 1990.-№4. - С. 44-47.
5. Дубинина Е.Е. Методы определения активности ката-лазы / Е.Е. Дубинина, Л.Ф. Ефимова, Л.Н. Сафронова // Лаб. дело. - 1988.-№8. - С. 16-19.
6. Зайцева О.В. Состояние свободнорадикальных процессов, перекисного окисления липидов и белков при псориазе / О.В. Зайцева, В.И. Жуков, Е.А. Броше // Ек-сперим. і клін. медицина. - 2002,-№4. - С. 86-89.
7. Зайцева О.В. Структурно-функциональное состояние цитоплазматических мембран при субхроническом токсическом воздействии на организм теплокровных жи-
вотных оксиэтилированного ксилита Л-655-2-100 / О.В. Зайцева, В.А. Телегин, В.И. Жуков и др. // Експериментальна і клінічна медицина. - 2007.-№3. - С. 65-68.
8. Косухин А.Б. Экстракция липидов смесью гептан-изопропанол для определения диеновых коньюгатов /
A.Б. Косухин, Б.С. Ахметова // Лаб. дело. - 1987.-№5. -С. 335-337.
9. Ломинский А.В. Определение активности ферментов фибринолитической системы с использованием фибриногена, конъюгированного с пероксидазой / А.В. Ломинский, Г.А. Афанасенко, Е.В. Гудкова // Лаб. дело. - 1991.-№11. - С. 27-31.
10. Меин В.М. Простой и специфический метод определения активности глутатионпероксидазы в эритроцитах /
B.М. Меин // Лаб. дело. - 1986.-№12. - С. 724-727.
11. Мошков К.А. Определение ферментативной активности и иммунореактивности церулоплазмина в сыворотке крови человека / К.А. Мошков // Лаб. дело. - 1985.-№7. - С. 390-395.
12. Практикум по биохимии / Под. ред. С.Е. Северина. Т.А. Соловьевой. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - С. 160-161.
13. Федорова Т.К. Реакция с тиобарбитуровой кислотой для определения малонового диальдегида в крови методом флюориметрии / Т.К. Федорова, Т.С. Коршунова, Э.Т. Ларская // Лаб. дело. - 1983.-№3. - С. 25-28.
14. Эммануэль Н.М., Цепные реакции./ Н.М. Эммануэль, Г.Е. Заиков, В.А. Крицман. - М.: Наука, 1989. - 328 с.
УДК 616.351-006-089
ОКСИДАНТНО-АНТИОКСИДАНТНІ ВЗАЄМОДІЇ ТА СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНИЙ СТАН ПЛАЗМАТИЧНИХ МЕМБРАН У ХВОРИХ НА РАК ПРЯМОЇ КИШКИ Жуков В.І., Перепадя С.В., Віннік Ю.О., Зайцева О.В., Моісеєнко А.С.
Резюме. У хворих (n=68) на рак прямої кишки з різними стадіями (I-IV) розвитку пухлинного процесу проведено дослідження реакцій вільно радикальних процесів, перекисно-го окиснення ліпідів, окиснювальної модифікації білків та структурно-функціонального стану мембран еритроцитів і лімфоцитів. Встановлено порушення кооперативної взаємодії оксидантно-антиоксидатного гомеостазу, а також фізико-хімічних властивостей плазматичних мембран. Прогностично несприятливими показниками при оцінці ступеня важкості захворювання і ефективності лікування є зниження інтенсивності Н2О2-індукованої люмінал-підсиленої біохемілюмінесценції сироватки крові й зріст концентрації вільних сульфгідрильних груп.
Ключові слова: рак прямої кишки, оксидантно-антиоксидантний гомеостаз, мембрани еритроцитів і лімфоцитів.
UDC 616.351-006-089
OXIDIZING-ANTIOXIDIZING INTERACTIONS and STRUCTURAL -FUNCTIONAL STATE of PLASMATIC MEMBRANES in PATIENTS RECEIVING COLORECTAL CANCER Zhukov V.I., Perepadya S.V., Vinnik Ju.A., Zaytseva O.V., Moiseenko A.S.
Summary. In patients (n=68) receiving colorectal cancer with different stages (I-IV) of the illness it were investigated reactions of free-radical processes, peroxidal oxidation of lipids, oxidizing modification of proteins and structural-functional state of erythrocytes and lymphocytes membranes. It is determined breach of cooperative interaction of oxidizing-antioxidizing homeostasis, and also changes of plasmatic membranes physics-chemical properties. In estimate of severity of disease and efficacy treatment prognostic unfavourable indices are such as lowering of intensity of blood serum H2O2-induction luminol-intensified biochemiluminescence and growth of free sulphohydratic groups concentration.
Key words: colorectal cancer, oxidizing-antioxidizing homeostasis, erythrocytes and lymphocytes membranes.
Стаття надійшла 18.12.2009 р.
l20
