CC BY
77
Оригинальные исследования
29
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Криоконсервированные мультипотентные мезенхимные стромальные клетки стимулируют репаративный хондрогенез в дегенеративно измененном межпозвонковом диске
М.С. Юхта, Н.А. Волкова, Е.П. Жуликова, Е.И. Гончарук
Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, Украина
Cryopreserved multipotent mesenchymal stromal cells stimulate reparative chondrogenesis in degenerated intervertebral disc
M. S. Iukhta, N.A. Volkova, Zhulikova E.P., E.I. Goncharuk
Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of Ukraine NAS, Kharkov, Ukraine
Альтернативой традиционному лечению дегенеративных изменений межпозвонковых дисков является клеточная терапия мультипотентными мезенхимными стромальными клетками (ММСК).
Целью работы была оценка терапевтического потенциала криоконсервированных культур аллогенных ММСК костного мозга при данной патологии. Крысам со смоделированным компрессионным дегенеративно-дистрофическим повреждением межпозвонкового диска СоУ1-У11 на коллагеновой губке в зону дефекта вводили по 0,5х 106 нативных или криоконсервированных клеток, в том числе меченных РКН-26 клеток. Контрольные группы были представлены животными с естественным ходом восстановительного процесса (без применения терапевтических методов) и введением физиологического раствора. На 30-е сут. после терапии проводили гистоморфометрическое исследование и люминесцентную микроскопию срезов межпозвонковых дисков СоУ1-У11.
В контрольных группах животных отмечался крайне низкий регенеративный потенциал. На фоне клеточной терапии наблюдалась тенденция к репарации линейных дефектов, фрагментаций пучков коллагеновых волокон фиброзного кольца, более выраженная в случае применения нативной культуры ММСК. Применение криоконсервированной культуры ММСК сопровождалось увеличением количества хон-дроцитов дорсальной части фиброзного кольца на единицу площади среза межпозвонкового диска СоУ1-У11 в 1,25 раз относительно модельных значений. Высота фиброзного кольца при этом увеличивалась на 12,5±3,3%, а денситометрический показатель хрящевой ткани — на 64±5,7% относительно модельных показателей.
При люминесцентной микроскопии криостатных срезов межпозвонковых дисков СоУ1-У11 на 30-е сут. после введения меченых нативных или криоконсервированных ММСК в наружных отделах фиброзного кольца и по его краю наблюдали свечение в красном диапазоне спектра в виде округлых включений и конгломератов, что свидетельствовало о выживаемости и миграции в диск трансплантированных и (или) их дочерних клеток.
Полученные нами данные свидетельствуют о стимулирующем эффекте криоконсервированной суспензии ММСК при дегенеративно-дистрофических повреждениях межпозвонковых дисков.
Ключевые слова: межпозвонковый диск, дегенеративно-дистрофическое повреждение, хрящевая ткань, мультипотентные мезенхимные стромальные клетки, криоконсервирование, клеточная терапия.
e-mail: Е-mail: [email protected]
The choice object for cell therapy of degenerative changes of the intervertebral discs is a cryopreserved multipotent mesenchymal stromal cells (MMSC). The research aim was to evaluate a therapeutic potential of cryopreserved allogenic marrow-derived MMSC in this pathology. Rats with modeled compressive degenerative damage of the intervertebral disc CcVI-VII were introduced by 0.5x10B native or cryopreserved as well as PKH-26-labeled cells on a collagen sponge in the defect area. Animals with spontaneous recovery and administration of saline were served as a control. Histomorphometric study and fluorescent microscopy of intervertebral disc sections was performed on the 30th day after treatment.
There was extremely low regenerative potential in the control groups of animals. Histologically after cell therapy, there was tendency to repair of cracks, fissures, collagen fiber fragmentations of the fibrous ring, which was more pronounced in the case of the native MMSC culture application. The cryopreserved MMSC administration was accompanied by increasing in the fibrochondrocyte number of the dorsal annulus per unit area of the intervertebral disc CcVI-VII slice at 1.25 times relative to the model values. At the same time the fibrous ring height increased by 12.5±3.3%, and densitometric index of cartilaginous tissue — by 64±5.7% relative to the model values.
The luminescence in the red range of the spectrum in the form of drops and conglomerates, which was localized in outer parts of fibrous ring, was detected by fluorescent microscopy of intervertebral disc cryostat sections on the 30 day after introduction of labeled native or cryopreserved MMSC, that indicated the safety and partial migration of transplanted and/ or their daughter cells in the intervertebral disc CcVI-VII.
Our data showed a stimulating effect of native and cryopreserved marrow-derived MMSC suspension in degenerative intervertebral disc damages.
Key words: intervertebral disk, degenerative damage, cartilaginous tissue, multipotent mesenchymal stromal cells, cryopreservation, cell therapy.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
30
Оригинальные исследования
В МПД дегенеративные изменения наступают значительно раньше, чем в костных и мышечных структурах. Минимальные их проявления обнаруживают в возрасте 11—16 лет [1]. В дальнейшем они лишь прогрессируют, вызывая болевой синдром в области туловища и конечностей в среднем к 35— 45 годам [2].
Проблема лечения дорсопатий, в частности, обусловленных дегенеративно-дистрофическими изменениями МПД, еще далека до полного разрешения. В настоящее время наряду с совершенствованием уже существующих методов лечения ведется поиск новых подходов к терапии данной патологии. Учитывая, что наиболее значимыми клеточными и биохимическими изменениями, связанными с дегенерацией МПД, является снижение в нем численной плотности хондроцитов — клеток, синтезирующих компоненты внеклеточного матрикса хрящевой ткани, — можно предположить, что клеточная терапия при этой патологии должна показать достаточно высокую клиническую эффективность [3]. Перспективным «терапевтическим» типом клеток в данном случае являются мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), которые уже хорошо «зарекомендовали себя» в исследованиях в рамках травматологии и ортопедии. Некоторые экспериментальные исследования in vitro показали, что ММСК способны при определенных условиях приобретать фенотип клеток фиброзного кольца (ФК) [4] и пуль-позного ядра (ПЯ) [5]. Разработанные на сегодня протоколы криоконсервирования ММСК костного мозга обеспечивают высокое качество сохраненного клеточного препарата, что позволяет применять его в любой нужный для лечения момент.
Таким образом, исследования выполнимости и эффективности применения криоконсервированных ММСК (КрММСК) при дегенеративно-дистрофических повреждениях хрящевой ткани МПД in vivo являются актуальными.
Материал и методы
Целью работы являлась экспериментальная оценка репаративного потенциала аллогенных КрММСК костного мозга при дегенеративно-дистрофическом повреждении хрящевой ткани МПД.
ММСК выделяли из резецированных фрагментов бедренной кости крыс (n = 7, массой 100—150 г) путем вымывания костного мозга раствором Хенкса с последующим пропусканием через иглы уменьшающегося диаметра. Полученную суспензию центрифугировали при 1500 об/мин (834 g) в течение 5 мин., осадок ресуспендировали и высевали с плотностью 103 кл/см2. Культивирование клеток проводили по методу, обеспечивающему адгезию стромальной фракции к культуральному пластику с последующим удалением фракции неадгезиро-вавших клеток. Клетки культивировали в питательной среде IMDM (Sigma, США), содержащей 10% эмбриональной сыворотки (ЭС) крупного рогатого скота (HyClone, США), гентамицин (150 мкг/мл; Фармак, Украина) и амфотерицин Б (10 мкг/мл; Sigma, США). В работе были использованы стандартные условия культивирования (37°С, 5% СО2, 95% влажности) в СО2-инкубаторе (Sanyo, Япония). Смену питательной среды проводили каждые
3-и сут. Клетки культивировали в течение 14 сут. до достижения 75% конфлюентности монослоя, после
чего их использовали в виде суспензии нативных ММСК.
Для криоконсервирования суспензии ММСК использовали ростовую среду с добавлением криопротектора ДМСО (ПанЭко, Россия) и ЭС в конечных концентрациях 10% и 20% соответственно. Криоконсервирование проводили по 2-этапной программе (1°С/мин до -80°С с последующим погружением в жидкий азот) [6]. Образцы хранили в условиях низкотемпературного банка не менее 3 мес. Размораживание суспензий ММСК проводили на водяной бане (37°С) до достижения жидкой фазы с последующим удалением криопротектора путем медленного добавления к суспензии клеток раствора Хенкса 1:9 (РАА, Австрия) и центрифугирования. Целостность мембран КрММСК определяли с использованием теста на включение трипанового синего (Sigma-Aldrich, США). Для определения пролиферативного потенциала клетки высевали на 6-луночные планшеты (РАА, Австрия) с плотностью 1х105 кл/лунку. Динамику прироста клеток оценивали каждые 2 сут. на протяжении 17 сут. [7]. Контролем для определения влияния криоконсервирования на пролиферативный потенциал и целостность мембран ММСК были культуры нативных клеток.
Исследование in vivo было выполнено на 49 кры-сах-самцах массой 300—350 г. У всех животных моделировалось компрессионное дегенеративнодистрофическое повреждение МПД путем формирования лордоза хвостового отдела позвоночника и его фиксации в таком положении в течение 60 сут. [8]. По достижению указанного срока действие компрессии у всех животных прекращали. У животных контрольной группы I (n = 7) заживление проходило «самопроизвольно» — без каких-либо терапевтических вмешательств. Животным контрольной группы II (n = 14) в область дефекта МПД СоУ|_У|| вводили коллагеновую губку Gelaspon® (Ankerpharm, Германия) размером 0,8х0,8х0,5 см, пропитанную 0,1 мл физиологического раствора. Животным экспериментальных групп III (n = 7) и IV (n = 7) аналогичным способом в зону дефекта вводили по 0,5х10в аллогенных нативных или КрММСК в 0,1 мл раствора Хенкса (РАА, Австрия) на коллагеновой губке, соответственно. В ряде случаев для визуализации трансплантированных клеток in vivo их предварительно метили флуоресцентным красителем РКН-26 (Sigma-Aldrich, США). Окрашивание клеток флюоресцентным красителем РКН-26 проводили согласно инструкции фирмы производителя [9].
Животных выводили из эксперимента на 30-е сут. после операции. Кроме того, в эксперименте использовали здоровых животных аналогичной массы и возраста без моделирования повреждения МПД (интактные животные), а также с моделированным повреждением (на сроке 60 сут.), но без каких-либо терапевтических воздействий. Оценку результатов проводили с помощью рентгенологического, гистоморфометрического и люминесцентного методов.
Компьютерную томографию (КТ) проводили на рентгеновском спиральном компьютерном томографе General electric CT/e Dual (Германия) 3 животным из каждой группы, введенным в наркоз. Технические параметры сканирования — срезы в сагиттальной плоскости, толщина среза 0,1 мм; шаг 1 мм, 120 кВ, 100 мАс. Компьютерную обработку полученных изо-
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
Оригинальные исследования
31
бражений проводили с помощью программного обеспечения eFilm (TM) Lite (TM) и Syngo fastView. Оценивали плотность дорсальной части ФК МПД Сом_уи в единицах Хаунсфилда (HU).
Для гистоморфометрического исследования экс-плантировали часть позвоночника на уровне Со^ и изготавливали целлоидиновые срезы по стандартной методике [10] с окраской обзорными красителями (гематоксилином и эозином), использовали микроскоп Carl Zeiss (Германия) с цифровой фотокамерой Canon EOS 30D. При помощи морфометрической сетки и окуляр-микрометра по ранее опубликованному методу [11] оценивали высоту ФК и численную плотность клеток дорсальной части ФК МПД Сом_уи, степень разволокнения и фрагментации коллагеновых волокон, наличие линейных дефектов и участков с пониженной численнойи плотностью и (или) отсутствием хондроцитов в ФК, целостность границы ФК/ПЯ. Высоту определяли по конечным элементам ФК на уровне наиболее приближенных друг к другу поверхностей тел выше и ниже расположенных позвонков. Численную плотность клеток определяли как среднее арифметическое измерений во внешнем, центральном и внутреннем отделах дорсальной части ФК путем подсчета количества ядер на единице площади среза (0,102 мм2) с последующим пересчетом на 1 мм2. При определении степени разволокнения и фрагментации коллагеновых волокон, распространенности линейных дефектов, участков с пониженной плотностью и (или) отсутствием хондро-цитов оценивалась удельная площадь, занимаемая патологическим элементом.
Детекцию трансплантированных клеток проводили в криостатных срезах МПД Со^^ толщиной 7 мкм с помощью люминесцентного микроскопа (LOMO МИКМЕД-2, Россия). Гашение аутолюминесценции проводили путем 30-минутной инкубации образцов с 0,3 М раствором глицина (Merck, Германия). По-
лученные результаты фиксировали фотографированием.
Все манипуляции с животными осуществляли в соответствии с международными требованиями гуманного обращения с лабораторными животными [12].
Сатирическую обработку полученных данных проводили с помощью компьютерных программ Statistica 8.0, Microsoft Excel с использованием непараметрических критериев. Результаты представлены в виде средних арифметических и стандартных ошибок средних (M±m), критическое значение уровня значимости принималось равным 0,05.
Результаты
Жизнеспособность ММСК после криоконсервирования составляла 82,1±5,2%, в контроле 98,4±3,2% клеток имели неповрежденную мембрану. При исследовании ростовых характеристик КрММСК на начальных этапах культивирования наблюдали снижение способности клеток к адгезии и последующей пролиферации по сравнению с неконсервированными образцами. Через 5 сут. культивирования количество клеток in vitro по сравнению с контролем было меньше на 30,5±6,2%. На 17-е сут. в культурах КрММСК прирост клеток стабилизировался, однако был меньше на 23,2±5,1%, чем в контроле.
При исследовании гистологических препаратов МПД CVI-VII интактных животных патологических изменений выявлено не было. ФК состояло из радиальных пластин коллагеновых волокон, вдоль которых располагались хондроциты (рис. 1А). Последние представляли собой фибробластоподобные вытянутые клетки с плотными овоидными ядрами (рис. 2А).
Гистологическая картина МПД животных контрольных групп I и II (см. рис.1В и Г) существенно не отличалась от исходного состояния МПД при смоделированном повреждении (см. рис.1Б).
Рис. 1. Межпозвонковый диск крысы: А - интактные животные; Б - модельная группа (животные на 60-е сут. моделирования компрессии); В - контрольная группа I (без терапевтических вмешательств); Г - контрольная группа II (введение коллагеновой губки с физиологическим раствором); Д - экспериментальная группа III (введение нативных ММСК на носителе); Е - группа IV (введение крММСК на носителе) :1 - линейные дефекты; 2 - расслоения коллагеновых фолокон; 3 - ацеллюлярные участки фиброзного кольца; 4 - фрагментированные коллагеновые волокна.
Окраска: гематоксилин, эозин.
Ув.: А, В, Г х125; Б, Д, Е х100
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
32
Оригинальные исследования
Рис. 2. Фиброзное кольцо межпозвонкового диска крысы: А - интактные животные; Б - модельная группа (животные на 60-е сут. моделирования компрессии); В - контрольная группа I (без терапевтических вмешательств);
Г - контрольная группа II (введение коллагеновой губки с физиологическим раствором); Д - экспериментальная группа III (введение нативных ММСК на носителе); Е - группа IV (введение крММСК на носителе);
1 - линейные дефекты; 2 - расслоения коллагеновых фолокон; 3 - ацеллюлярные участки фиброзного кольца;
4 - фрагментированные коллагеновые волокна.
Окраска: гематоксилин, эозин. Ув.: А-В, Е х200; Г х240; Д х300
В структуре МПД CoVI-VII определялись признаки дегенеративно-дистрофического повреждения хрящевой ткани в виде разволокнения, расслоения и фрагментации коллагеновых волокон, снижения плотности хондроцитов, нечеткости контуров границы между ФК и ПЯ, образования центральных линейных дефектов, окруженных ацеллюлярными участками ФК. Гетероморфные хондроциты располагались поодиночке или образовывали изогенные группы. В непосредственной близости к линейным дефектам ФК наряду с характерными для этого типа хрящевой ткани клетками встречались крупные хон-дроциты со сферическими ядрами, окруженными широким ободком цитоплазмы (см. рис. 2В и Г). Такая «трансформация» хондроцитов на фоне резкого снижения численной плотности клеток свидетельствует о напряженности восстановительных процессов на данном участке ФК [13].
При микроскопическом исследовании гистологических препаратов МПД Сом_от животных III группы на 30-е сут. после введения нативных ММСК определялось частичное восстановление его структуры (см. рис. 1Д). Наблюдалась репарация линейных дефектов, фрагментаций пучков коллагеновых волокон, становилась более четкой граница между ФК и ПЯ. При этом фибробластоподобные клетки с плотными овоидными ядрами располагались не только по ходу коллагеновых волокон, но и густо пронизывали их толщу, что свидетельствовало о высокой интенсивности репаративных процессов (см. рис. 2Д).
Применение суспензии КрММСК так же способствовало репаративному хондрогенезу в МПД Со^_ VII, но эффект был менее выражен при сравнении с использованием нативных ММСК. На 30-е сут. отмечалась тенденция к нормализации гистологического строения ФК МПД Сом_от (см. рис. 1Е): снижение степени разволокнения коллагеновых волокон, значительное сокращение площади, занимаемой линейными дефектами, улучшение контуров границы между ФК и ПЯ. Клеточная популяция ФК, так же как и в случае применения нативных
ММСК, была представлена некрупными фибробластоподобными клетками с овоидными ядрами и узким ободком цитоплазмы. При этом клетки располагались преимущественно вдоль коллагеновых волокон, лишь в отдельных участках пронизывая их толщу (см. рис. 2Е).
Для объективной оценки выявленных качественных изменений были проведены количественные измерения высоты, численной плотности хондроцитов и денситометрической плотности хрящевой ткани дорсальной части ФК МПД Сом_от, результаты которых представлены в таблице.
Согласно полученным данным, на фоне терапии КрММСК высота дорсальной части ФК МПД Со^_ VII увеличивалась на 12,5±3,3%, численная плотность хондроцитов — на 26±2,9%, а денситометрический показатель хрящевой ткани — на 64±5,7% относительно модельных значений. Введение же нативных ММСК сопровождалось увеличением численной плотности клеток хрящевой ткани диска в 3,5 раза, высоты ФК МПД Сом_от на 25±4,1%, а денситометрической плотности — на 91 ±7,3%, при этом в группах контроля тенденция к восстановлению исследуемых показателей отсутствовала вовсе (табл.).
При люминесцентной микроскопии криостатных срезов МПД Со^и животных, которым были трансплантированы меченные РКН-26клетки, на 30-е сут. наблюдалось свечение в красном диапазоне спектра, которое было четким в виде вкраплений и конгломератов и локализовалось в наружных отделах ФК и по его краю. При этом в случае применения КрММСК определялось меньшее количество люми-несцирующих элементов. Отличие между нативной и криоконсервированной популяциями клеток состояло также и в интенсивности люминесценции, которая была более выражена в МПД животных, перенесших терапию нативными ММСК. При микроскопическом исследовании криостатных срезов МПД контрольных животных с введением физиологического раствора свечение не определялось, что исключало аутолюминесценцию.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
Оригинальные исследования
33
Высота, численная плотность хондроцитов (ЧПХ) и рентгенологическая плотность хрящевой ткани дорсальной части ФК МПД Сот-им на 30-е сут. исследования
Группа Высота ФК, мм ЧПХ, 1/мм2 КТ-плотность, HU
И 1,13±0,020 1121±26,97 62±15,7
М 0,56±0,047 395±31,25 -180±24,7
I 0,55±0,034 369±30,21 -146±37,9
II 0,57±0,032 400±46,44 -214±45,9
III 0,7±0,0320* 1389±39,40** -17±11,9**
IV 0,63±0,036 497±36,62** -64±12,5**
Примечание: И — интактные животные; М — модельная группа (животные на 60-е сут. после моделирования повреждения); ФК — фиброзное кольцо; * — разница статистически значима при сравнении с модельной группой; ** — разница статистически значима при сравнении с модельной группой, контрольными группами I и II.
Обсуждение
На сегодняшний день из литературных источников известно, что в зависимости от степени дегенеративных изменений в МПД трансплантация ММСК может оказывать стабилизирующее действие, останавливая прогрессию патологического процесса без индукции репаративного процесса [14]. Но следует отметить, что в подобных исследованиях введение ММСК осуществлялось в виде суспензии инъекционным способом, что, возможно, не позволяло клеткам в полной мере проявить свой терапевтический потенциал [15].
Наши исследования in vivo показали, что локальное введение КрММСК оказывает стимулирующий эффект на процессы регенерации в дегенеративно измененной хрящевой ткани МПД, качественно влияя на их течение. Так, если в ФК животных с естественным ходом репаративного процесса и введением физиологического раствора преобладал «синтетический компонент» регенерации, то в группах с трансплантацией ММСК — пролиферативный. Наиболее выраженный стимулирующий эффект введение КрММСК оказывало на численную плотность хондроцитов и денситометрический показатель хрящевой ткани, в меньшей степени влияя на высоту ФК МПД СоУ|_уи. Это может быть обусловлено отсутствием прямой корреляции между исследуемыми показателями и требует дальнейшего изучения на более отдаленных сроках наблюдения.
Репаративный эффект ММСК при дегенеративно-дистрофическом повреждении хрящевой ткани МПД, по-видимому, как и в случае суставного хряща, обусловлен как паракринной, так и митотической активностью трансплантированных клеток. ММСК в процессе культивирования синтезируют широкий спектр цитокинов и хемокинов, в том числе и одни из самых мощных антиапоптотических, анаболических
ЛИТЕРАТУРА:
1. Boos N., Weissbach S., Rohrbach H. et al. Classification of age-related changes in lumbar intervertebral discs: 2002 Volvo Award in Basic Science. Spine 2002; 27:2631—44.
2. Hoy D., Brooks P., Blythc F. et al. The epidemiology of low back pain. Best Pract. Res. Clin. Rheumat. 2010; 24:769—81.
3. Hohaus C., Ganey T.M., Minkus Y. et al. Cell transplantation in lumbar spine disc degeneration disease. Eur. Spine J. 2008; 17:492—503.
4. Visage C.L., Kim S.W., Tateno K. et al. Interaction of human mesenchymal stem cells with disc cells: changes in extracellular matrix biosynthesis. Spine 2006; 31:2036—42.
и митогенных стимуляторов хондрорепарации — инсулиноподобный фактор роста-1 и трансформирующий фактор роста b [16, 17].
Выживаемость трансплантированных ММСК и их миграцию в поврежденную хрящевую ткань МПД наглядно показывают эксперименты с использованием предварительно меченных флуоресцентным красителем РКН-26 клеток. Результаты люминесцентной микроскопии согласуются с данными работ по исследованию выживаемости трансплантированных в МПД аллогенных ММСК в пределах срока наблюдения [14, 18]. Более низкая интенсивность люминесценции и меньшее количество светящихся элементов в случае введения криоконсервированных клеток могут быть связаны со снижением их пролиферативной активности после цикла замораживания-размораживания. Тем не менее, по данным гистоморфометрических и КТ-исследований КрММСК сохраняют способность стимулировать репаративный процесс в дегенеративно измененной хрящевой ткани МПД.
Выводы
Терапия аллогенными КрММСК костного мозга оказала стимулирующий эффект на репаративный хондрогенез в дегенеративно измененном МПД. После местного введения на трехмерном носителе как нативные, так и крММСК выживают до 30 сут. в зоне трансплантации и частично мигрируют в хрящевую ткань диска. Однако полученные нами результаты указывают на меньшую выраженность положительного эффекта КрММСК по сравнению с нативными клетками.
Благодарности
Авторы выражают благодарность и хранят память об инициаторе и вдохновителе этой работы акад. НАНУ Грищенко В.И.
5. Richardson S., Walker R., Parker S. et al. Differentiation of human mesenchymal stem cells to nucleus pulposus cells using a novel co-culture technique. Euro. Cells Mat. 2005; 10 (II):56.
6. Mamidi M.K., Nathan K.G., Singh G. et al. Comparative
cellular and molecular analyses of pooled bone marrow multipotent mesenchymal stromal cells during continues passaging and after successive cryopreservation. J. Cell Biochem. 2012; 113:
3153-64.
7. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.: Мир; 1983.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
34
Оригинальные исследования
8. Pazzaglia U.E., Andrini L., Di Nucci A. The effects of mechanical forces on bones and joints. Experimental study on the rat tail. J. Bone Joint Surg. Br. 1997; 79: 1024-30.
9. Wallace P.K., Muirhead K.A. Cell tracking 2007: a proliferation of probes and applications. Immunol. Invest. 2007; 36:527-61.
10. Волкова О.В., Елецкий Ю.К. Основы гистологии с гистологической техникой. М.: Медицина; 1982.
11. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина; 1990.
12. Council of Europe [France]. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific purposes. Strasbourg,18.III.1986, http://conventions.coe. int/treaty/en/Treaties/Word/123.doc.
13. Ирьянов Ю.М., Силантьева Т.А. Современные представления о гистологических аспектах репаративной регенерации костной ткани [обзор литературы). Клеточные источники репаративного остеогенеза. Гетерогенность клеточной популяции в области травматического повреждения кости. Гений ортопедии 2007; 2:111-16.
14. Ho G., Leung V.Y.L., Cheung K.M. C. Effect of severity of intervertebral disc injury on mesenchymal stem cell-based regeneration. Connect. Tiss. Res. 2008; 49:15-21.
15. Michalek A.J., Buckley M.R., Bonassar L.J. et al. The effects of needle puncture injury on microscale shear strain in the intervertebral disc annulus fibrosus. The Spine J. 2010; 10: 1098-105.
16. Salazar K.D., Lankford S.M., Brody A.R. Mesenchymal stem cells produce Wnt isoforms and TGF- b1 that mediate proliferation and procollagen expression by lung fibroblasts. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2009; 297: L1002-11.
17. Togel F., Hu Z., Weiss K. et al. Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure through differentiation-independent mechanisms. Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2005; 289: F31-42.
18. Hiyama A., Mochida J., Iwashina T. Transplantation of mesenchymal stem cells in a canine disc degeneration model. J. Orthop. Res. 2008; 26(5):589-600.
Поступила 21.05.13
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 2, 2013
