CC BY
76
39. Mozdzanowska K. et al. Induction of influenza type A virus-specific resistance by immunization of mice with a synthetic multiple antigenic peptide vaccine that contains ectodomains of matrix protein 2 // Vaccine. - 2003. - Vol. 21. - P. 2616-2626.
40. NeirynckS. et al. A universal influenza a vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein // Nat. Med. - 1999. - Vol. 5. - P. 157-163.
41. Okuda Kenji, Atsushi Ihata, Setsuko Watebe et al. Protective immunity against influenza A virus induced by immunization with DNA plasmid containing influenza M gene // Vaccine. - 2001. - Vol. 19. - P 36813691.
42. Okuno Y., Isegawa Y, Sasano F, Ueda S. A common neutralizing epitope conserved between the hemagglutinin of influenza A virus HI and H2 strains // J. Virol. - 1993. - Vol. 67. - P 2552-2558.
43. Pan C., Jiang S. E14-F55 combination in protein: a putative molecular determinant responsible for swine-origin influenza A virus transmission in humans // PLoS Curr. - 2009. - Vol. 1. - RRN 1044.
44. PersingD. H., Coler R. N., Lacy M. J. et al. Taking toll:lipid A mimetics as adjuvants and immunomodulators // Trends Microbiol. - 2002. - Vol. 10. - P. 32-37.
45. Prabhu N., PrabakaranM., HoH. T. et al. Momoclonal antibodies against the fusion peptide of hemagglutinin protect mice from lethal influenza A virus H5N1 infection // J. Virol. - 2009. - Vol. 83. - P 2553-2562.
46. Sagava H., Oshima A., Kato J. et al. The immunological activity of adeletion mutant of influenza virus hemagglutinin lacking the globular region // J. Gen. Virol. - 1996. - Vol. 77. - P 1483-1487.
47. Takeda K., Kaisho T., Akira S. Toll-like receptors // Annu. Rev. Immunol. - 2003. - Vol. 21. - P. 1440-1447.
48. Tamura S., Tammoto T., Kurata T. Mechanisms of broad cross-protection provided by influenza virus infection and their application to vaccines // Jpn. J. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 58. - P. 195-207.
49. Tompkins S. M., Zhao Z. S., Lo C.-Y. et al. Matrix protein 2 vaccination and protection against influenza viruses, including sybtype H5N1 // Emerg. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 13. - P. 426-434.
50. Tong-Ming Fu, Grimm Karen M., Citron Michael P., Freed Daniel C. Comparative immunogenicity evaluations of influenza A virus M2 peptide as recombinant virus like particle or conjugate vaccines in mice and monkeys // Vaccine. - 2009. - Vol. 27. - P. 1440-1447.
51. Wanli L., Peng Z., Jian D., Ying-Hua C. Sequence comparison between the extracellular domain of M2 protein human and avian influenza A virus provides new information for bivalent influenza vaccine design // Microb. Infect. - 2005. - Vol. 7. - P. 171-177.
52. Wu F, Huang J., Yuan X. et al. Characterization of immunity induced by M2e of influenza virus // Vaccine. - 2007. - Vol. 25. - P. 8868-8873.
53. Zharikova D., Mozdzanowska K., Feng G. et al. Influenza type A virus escape mutants emerge in vivo in the presence of antibody to the ectodomain of matrix protein 2 // J. Virol. - 2005. - Vol. 79. - P. 66446654.
54. http://www.clinicaltrial.gov.
Поступила 28.12.10
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.98:578.832.1]-06:616.24-02]-078
Д. К. Львов1, М. Ю. Щелканов1, Н. В. Бовин2, Н. А. Малышев3, А. Г. Чучалин4, Л. В. Колобухина1, А. Г. Прили-пов1, В. С. Богданова1, С. В. Альховский1, Е. И. Самохвалов1, И. Т. Федякина1, Е. И. Бурцева1, П. Г. Дерябин1, М. М. Журавлева1, Е. С. Шевченко1, В. В. Лаврищева1, Д. Н. Львов1, Е. С. Прошина1, Н. С. Стариков2, Т. Н. Морозова1, М. В. Базарова3, Т. А. Григорьева1, И. М. Кириллов1, Е. В. Шидловская1, Е. И. Келли3, В. Е. Маликов3, К. Б. Яшкулов5, В. Ю. Ананьев6, Н. И. Баранов6, В. Н. Гореликов6, О. В. Цой6, Ю. А. Гарбуз7, В. И. Резник7, Л. И. Иванов8, И. Ю. Феделеш9, Р. А. Пономаренко10, Е. А. Сахарова9, Г. Б. Лебедев9, А. И. Маслов10
корреляция между рецепторной специфичностью штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1) pdm09, изолированных в 2009-2011 гг., структурой рецепторсвязывающего сайта и вероятностью развития летальной первичной вирусной пневмонии
'ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России, Москва; 2Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва; 3Инфекционная клиническая больница № 1 Департамента здравоохранения, Москва; 4ФГУ НИИ пульмонологии ФМБА России, Москва; ^Управление Роспотребнадзора по Республике Калмыкия, Элиста;
6ФБУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Приморском крае, Владивосток; 7ФБУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Хабаровском крае, Хабаровск; 8ФБУЗ Хабаровская противочумная станция; 9ФБУЗ Центр гигиены и эпидемиологии в Чукотском автономном округе,
Анадырь; 10ГУЗ Чукотская окружная больница, Анадырь
Изучена рецепторная специфичность (РС) штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09, депонированных в государственную коллекцию вирусов Рф при фгу нии вирусологии им. Д. и. Ивановского Минздравсоцразвития России в эпидсезонах 2009-2010 и 2010-2011 гг., по отношению к панели из 9 сиа-логликополимеров (СГП). Штаммы были разделены на 3 группы в зависимости от значения предложенного нами параметра W3/6, равного отношению суммы реактивностей к неразветвленным а2-3-СГП к сумме реактивностей к неразветвленным а2-6-СГП: W3/6 < 1,0; 1,0 < W3/6 < 1,5; W3/6 > 1,5. В группе W3/6 > 1,5 преобладает а2-3-РС, сопровождаясь высокой частотой летальных первичных вирусных пневмоний (ЛПВП) (60,0%) и аминокислотных замен в рецепторсвязывающем сайте (РСС) НА1 (80,0%): D222{G, N} и Q3223R. Группа 1,0 < W3/6 < 1,5 характеризуется смешанной а2-3/а2-6-РС с частотами ЛПВП и аминокислотных замен в РСС НА1 29,7 и 40,5% (D222{G, N, V} и Q223R) соответственно. В группе W3/6 < 1,0 преобладает а2-6-РС, отсутствуют ЛПВП и лишь в 6,0% случаев встречались аминокислотные замены в РСС НА1 (D222{G, Е}). Число штаммов с повышенной специфичностью к а2-3-сиалозидам возросло в эпидсезоне 2010-2011 гг. по сравнению с предыдущим. При дальнейшем их распространении среди населения может увеличиться число случаев тяжелых первичных вирусных пневмоний с возможными летальными исходами, что, однако, может сопровождаться снижением способности мутантов к воздушно-капельной передаче.
Ключевые слова: вирус, грипп, пневмония, летальность, клеточный рецептор, рецепторсвязывающий сайт, гемагглютинин, сиаловая кислота, сиалозид, олигосахарид
Контактная информация:
Львов Дмитрий Константинович, акад. РАМН, дир. ин-та; e-mail: dk_lvov@mail.ru
14
Correlation between the receptor specificity of pandemic influenza A (H1 N1)pdm09 virus strains isolated in 2009-2011 and the structure of the receptor-binding site and the probability of fatal primary viral pneumonia
D. K. Lvov1, M. Yu. Shchelkanov1, N. V. Bovin2, N. A. Malyshev3, A. G. Chuchalin4, L. V. Kolobukhina1,
A. G. Prilipov1, V. S. Bogdanova1, S. V. Alkhovsky1, E. I. Samokhvalov1, I. T. Fedyakina1, E. I. Burtseva1,
P. G. Deryabin1, M. M. Zhuravleva1, E. S. Shevchenko1, V. V. Lavrishcheva1, D. N. Lvov1, E. S. Proshina1,
N. S. Starikov2, T. N. Morozova1, M. V. Bazarova3, T. A. Grigoryeva1, I. M. Kirillov1, E. V. Shidlovskaya1,
E. I. Kelli3, V. E. Malikov3, K. B. Yashkulov5, V. Yu. Ananyev6, N. I. Baranov6, V. N. Gorelikov6, O. V. Tsoi6, Yu. A. Garbuz7, V. Ya. Reznik7, L. I. Ivanov8, I. Yu. Fedelesh9, R. A. Ponomarenko10, E. A. Sakharova9,
G. B. Lebedev9, A. I. Maslov10
1D. I. Ivanovsky Research Institute of Virology, Ministry of Health and Social Development of Russia; 2M. M. Shemyakin and Yu. A. Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences; 3Clinical Infectious Diseases Hospital One, Healthcare Department, Moscow; 4Research Institute of Pulmonology, Federal Biomedical Agency, Moscow; 5Board of the Russian Inspectorate for the Protection of Consumer Rights and Human Welfare in the Republic of Kalmykia, a2-3-Elista; 6Center for Hygiene and Epidemiology in the Primorye Territory, Vladivostok; 7Center for Hygiene and Epidemiology in the Khabarovsk Territory; Khabarovsk; 8Khabarovsk Antiplague Station, 9Center for Hygiene and Epidemiology in the Chukotka Autonomous Okrug, Anadyr; 10Chukotka District Hospital, Anadyr
The receptor specificity (Rs) of pandemic influenza a (H 1Щ) pdm09 virus strains deposited into the state Collection of viruses of the Russian Federation, D. i. ivanovsky research institute of virology, Ministry of health and social Development of Russia, in the 2009-2010 and 2010-2011epidemic seasons to a panel of 9 sialoglycopolymers (sGP). the strains were divided into 3 groups according to the W.^ index proposed by the authors, which was equal to the amount of reactivities to unbranched a2-3-SGP to that of reactivities to unbranched al-6-SGP: W3/6 < 1.0; 1.0 < W3/6 < 1.5. The W.,6 < 1.5 group showed a predominance of a2-3-RS, attended by the high incidence of fatal primary viral pneumonias (FPVP) (60.0%) and amino acid replacements in the HA1 receptor-binding site (RBS) (80.0%): D222{G, N}and Q223R. The 1.0 < W3/6 < 1.5 group was characterized by mixed a2-3/a2-6-RS with the incidence of FPVP (29.7%) and amino acid replacements in the HA1 RBS (40.5%) (D222{G, N, V}and Q223), respectively. in the W3/6 < 1.0 group, a2-6-RS was prevalent, FPVPs were absent and amino acid replacements in HA1 RBS (D222{G, E}) were seen only in 6.0% of cases. The number of strains with increased specificity to a2-3-sialosides increased in the 2010-2011 epidemic season as compared to the previous season. With their further spread among the population, there may be a rise in cases of severe primary viral pneumonias with possible fatal outcomes, which can be, however, accompanied by a decrease in the capacity of mutants to air-dropwise transmission.
Key words: virus, influenza, pneumonia, mortality, cell receptor, receptor-binding site, hemagglutinin, sialic acid, sialoside, oligosaccharide
В середине 70-х годов прошлого века было показано, что штаммы вируса гриппа А различаются по способности связываться с терминальными сиаловыми кислотами, образующими различные типы ковалентных связей с последующими моносахаридными звеньями [16]. Связывание вируса гриппа А с рецептором и его адсорбция на поверхности клетки-мишени начинается c взаимодействия первой субъединицы гемагглютинина (НА1) с остатком сиаловой, или Л-ацетилнейраминовой, кислоты (Neu5Ac - Л-acetylneuraminic acid), которая представляет собой минимально необходимый элемент рецептора [16, 18]. Neu5Ac является наиболее часто встречающимся терминальным остатком кислых полисахаридов в составе ганглиозидов и гликопротеинов. Впоследствии выяснилось, что стратификация рецепторной специфичности (РС) имеет для вариантов вируса гриппа А более широкий и универсальный характер: эпидемическим штаммам свойственно повышенное сродство к терминальному №и5Аса2-6-дисахариду (сокращенно а2-6), а штаммам птичьего происхождения (в том числе изолируемым от других хозяев) - к №и5Аса2-6-дисахариду (сокращенно а2-6 и а2-3 соответственно) [10, 11, 14, 15].
Клетки эпителия верхних отделов респираторного тракта человека содержат в основном а2-6-сиалозиды, а нижних отделов - а2-3-сиалозиды. Поэтому эпидемические штаммы вирусов гриппа, имея а2-6-РС, легко репродуцируются в верхних отделах респираторного тракта человека, активно выделяются в окружающую среду и эффективно заражают других людей воздушно-капельным путем. Сиалозиды а2-3-типа обеспечивают возможность патологического процесса в бронхиолах и альвеолах с последующим развитием тяжелой первичной вирусной пневмонии и риском летального исхода [1, 3, 4, 7, 8].
Эпителиоциты свиней одновременно содержат и а2-6-, и а2-3-сиалозиды, поэтому в организме могут одновременно циркулировать и эпидемические, и птичьи варианты вируса гриппа А. Вследствие этого в свиных популяциях могут, во-первых, формироваться реассортанты человеческих и птичьих штаммов с новыми биологическими свойствами, во-вторых, - селектироваться штаммы со смешанной а2-6/а2-3-РС. Именно такую смешанную а2-6/а2-3-РС имели штаммы пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09*, обладая с самого начала распространения в человеческой популяции способностью к распространению воздушно-капельным путем и способностью поражать нижние отделы респираторного тракта
[1, 5, 21].
В динамике пандемии 2009-2010 гг., в России с момента изоляции первого пандемического штамма [2] число летальных случаев от быстро развивающихся первичных вирусных пневмоний резко увеличивалось начиная с ноября 2009 г. [3, 4]. Механизм возрастания вирулентности был описан в научной литературе: установлена связь между повышением вирулентности и аминокислотными заменами в рецепторсвязывающем сайте (РСС) НА1 [3, 4, 9, 12, 13, 17, 19, 20]. В эпидсезоне 2010-2011 гг. в Центре экологии и эпидемиологии гриппа (ЦЭЭГ) было продолжено изучение связи аминокислотных замен в РСС НА1, летальности и РС с помощью разработанного нами метода количественной оценки соотношения а2-3- и а2-3-РС [6]. Анализ полученных
*Для обозначения пандемического (2009-2010 гг.) варианта вируса гриппа А (H1N1), который ранее обозначался как А (H1N1) swl или А (H1N1) v, ВОЗ рекомендует использовать А (H1N1) pdm09 [http://www.who. int/influenza/gisrs_laboratory/terminology_ah1n1pdm09/].
15
Рецепторимитирующие олигосахариды, используемые для определения рецепторной специфичности штаммов вируса гриппа A (H1N1) pdm09
Тип
спец- ифич- Обозначение Химический состав
ности
2’-3’ 3'-SL 3'-sialyllactose: Neu5Acа2-3Galp1-4Glcp
3'-SLN 3'-sialyllactosamine: Neu5Acа2-3Galp1-4GlcNAcp
6-Su-3’-SLN 6-Su-3'-sialyllactosamine: Neu5Acа2-3Galp1-4(6-0-Su)GlcNAcp
SLe- Neu5Aа2-3Galp1-3(Fucа1-4)GlcNAcp
SLex Neu5Acа2-3Galp1-4 (Fucа1-3)GlcNAcp
SLec Neu5Acа2-3Galp1-3GlcNAcp
2'-6' 6'-SL 6'-sialyllactose: Neu5Acа2-6Galp1-4Glcp
6'-SLN 6'-sialyllactosamine: Neu5Acа2-6Galp1-4GlcNAcp
6-Su-6'-SLN 6-Su-6'-sialyllactosamine: Neu5Acа2-6Galp1-4(6-0-Su)GlcNAcp
результатов в сопоставлении с данными 2009-2010 гг. представлен в настоящей работе.
Материалы и методы
Молекулярно-генетическую дифференциальную диагностику пандемического гриппа А/НШ1 pdm09 проводили методом ОТ-ПЦР в вирусологических лабораториях региональных ФБУЗ Центры гигиены и эпидемиологии с использованием тест-системы «АмплиСенс Influenza virus A/H1-swine-FL» («ИнтерЛабСервис», Россия). Положительные образцы передавали в ЦЭЭГ, где положительный результат подтверждали методом ОТ-ПЦР с флюоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием универсальных праймеров и зонда, специфических для гена М вируса гриппа А, генов NP и Н1 пандемического вируса гриппа A/H1N1 pdm09 («Applied Biosystems», USA, № PN4441240C в соответствии с CDC protocol of real-time RT-PCR for influenza A(H1N1), 28 April 2009).
Изоляцию вируса выполняли из ОТ-ПЦР-положительных образцов методом биопробы путем заражения 9-10-дневных развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ), а также перевиваемой клеточной линии почки собаки (MDCK - Madin-Darby canine kidney) из Российской коллекции клеточных культур при ФГУ НИИ вирусологии им Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России по стандартным методикам [1-4].
Идентификацию штаммов осуществляли с помощью реакции торможения гемагглютинации. (РТГА) с набором референс-сывороток против штаммов A/swine/1976/1931 (Hsw1N1) (НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург); А/ California/04/2009 (HlN1) pdm09 (ФГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России, Москва); A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1) pdm09 (ФГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразви-тия России, Москва), а также к методом ОТ-ПЦР с флюоресцентной детекцией в режиме реального времени.
Амплификацию и секвенирование фрагментов гемагглютинина в первичных пробах проводили гнездовым методом с использованием кДНК, полученных при постановке ОТ-ПЦР в режиме реального времени. Первый раунд ПЦР выполняли с праймерами Unitail 5’-AGTCAGGCAGCAAAAGCAGG-3’ и Runitail 5’-AGAAAGGGAGTAGAAACAAGG-3’, второй раунд - с HA3F 5’-TGTAAAACGACGGCCAGTACRTGTTACCC AGGRGATTTC-3’ и HA3R 5’-CAGGAAACAGCTATGA CCTCTTTACCYACTRCTGTGAA-3’. Условия проведе-
Таблица 1 ния ПЦР для первого и второго раунда были одинаковы: (94°С х 20 с, 50°С х 30 с, 72°С х 1 мин) х 30 циклов, 72°С х 7 мин, хранение при 10°С. Первичную нуклеотидную последовательность фрагментов ПЦР определяли методом Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI Prism3130Avant («Applied Biosystems», США) согласно рекомендациям производителя. Анализ нуклеотидных и соответствующих им аминокислотных последовательностей выполняли с использованием пакета прикладных программ Lasergene («DNASTAR, Inc.», США).
Твердофазный сиалозидоферментный анализ (СФА) для оценки специфичности гемагглютинина вируса гриппа А по отношению к рецептор-имитирующим сиало-гликополимерам (СГП) проводили с применением вируссодержащей аллантоисной жидкости РКЭ или культуральной жидкости с титром в РГА 16 АЕ/мл и 9 (табл. 1) меченных биотином СГП («Lectinity Holding, Inc.», Москва) по методикам, описанным ранее [2-4, 10, 14, 15].
Разработан метод количественной оценки соотношения уровней а2-3- и а2-6-РС. Пусть S1, S ..., Sn - рецепторимитирующие СГП; d(S1), d(S2), ..., d(Sn) - оптические сигналы в СФА за вычетом фоновых значений. Упорядоченное множество (вектор) [d(Si)]i = . называется спектром рецепторной специфичности (СРС) данного штамма. Нормировка вида
d(SJ =
d(SJ
или евклидова нормировка, позволяет рассматривать нормированные векторы [<i(Si)]i = 1 n как элементы единого евклидова пространства, причем все векторы имеют единичную длину, а углы между ними являются мерой различия их компонентного состава, что позволяет проводить классификацию штаммов по профилю СРС независимо от экспериментальных погрешностей в каждом конкретном эксперименте [6].
Для анализа статистической связи между уровнем РС к а2-3/а2-6-сиалозидам, частотой мутаций в РСС и вероятностью летальной первичной вирусной пневмонии (ЛПВП) необходим скалярный параметр, который бы характеризовал соотношение а2-3- и а2-6-РС. С целью конструирования такого параметра мы провели факторный анализ результатов измерений СРС и установили, что наибольшие весовые коэффициенты информативности имеют 4 сиалозида: два, имеющие а2-3-связь (3’-SL и 3’-SLN), и два, имеющие а2-6-связь (6’-SL и 6’-SLN). Первая пара характеризует специфичность к клеточным рецепторам птиц, а также нижних отделов дыхательного тракта человека, вторая - верхних отделов дыхательного тракта человека. СГП 3’-SL, 3’-SLN, 6’-SL и 6’-SLN являются неразветвленными (см. табл. 1), и реактивность к ним отражает базовые особенности реактивности по отношению к терминальному дисахариду в смысле диффе-ренцировки а2-3/а2-6. В связи с этим нами был введен безразмерный параметр W3/6, который является отношением среднего значения для компонент СРС, относящихся к неразветвленным а2-3-СГП, к среднему значению для компонент СРС, относящихся к неразветвленным а2-6-СГП:
w = jl3(.y-SL) + d(3’-SLN)] d(3’-SL) + d{3’-SLN)
3,6“ t№’-SL) + d(6’-Smi = ^-SL)*d(fi'-SUf) '
Параметр W3/6 характеризует превышение а2-3-РС над
16
а
б
в
г
д е
Рис. 1. Характерные нормированные спектры рецепторной специфичности некоторых штаммов пандемического вируса гриппа А (H1N1)pdm09 от госпитализированных пациентов. Показаны значения W3/6 и аминокислотные остатки в позициях 222 и 223 НА1.
а2-6-РС: если W3/6 << 1, то доминирует а2-6-РС (свойственная сезонным эпидемическим штаммам); если W3/6 >> 1, то доминирует а2-3-РС (свойственная штаммам птичьего происхождения); если W3/6 ~ 1, то имеет место смешанная РС (свойственная штаммам пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09).
Результаты и обсуждение Характерные нормированные СРС по отношению к панели использованных СГП (см. табл. 1) представлены на рис. 1. Прототипный штамм A/Califomia/04/2009 (H1N1)pdm091, который был изолирован из назального смыва больного гриппом в Сан-Диего (США), взятого 30 марта 2009 г. (т. е. в самом начале пандемии), имеет РС по отношению и к а2-3-, и к а2-6-сиалозидам: компоненты СРС к 6’-SL и 6-Su-6’-SLN сравнимы с 3’-SL,
3’-SLN, 6-Su-3’-SLN и Sle3; компонента 6’-SLN, хотя и несколько понижена, но сравнима со Sle^ и Slec (рис. 1, а). Смешанный характер РС прототипного штамма, как и этимология термина «свиной» грипп2, связаны с тем, что пандемический вариант был сформирован в результате реассортации двух генотипов вируса гриппа A (H1N1), адаптированных к свиньям и длительное время циркулировавших среди них, - «американского» (ставшего источником сегментов РВ2, РВ1, РА, НА, NP
1Штамм А/СаНРогша/04/09 (H1N1) swl был передан 08.05.2009 из СDС (ID СDС 2009712047) в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ) РФ (удостоверение ГКВ 2446) при ФГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России.
2Аббревиатура «swl» расшифровывается как «swine-like», т. е. «подоб-
ный свиным [штаммам]».
17
Таблица 2
Корреляция между рецепторной специфичностью штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1)pdm09 от госпитализированных пациентов (2009-2011 гг.), структурой рецепторсвязывающего сайта НА1 и вероятностью развития летальной первичной вирусной пневмонии (ЛПВП)
Штаммы Преобладание а2-6-специфичности Преобладание а2-3-специфичности Итого
W3/6 < 1,0 1,0 < W3/6 < 1,5 1,5 < W3/6
Количество 67 37 25 129
От больных с ЛПВП 0 11 (29,7%) 15 (60,0%) 26 (20,2%)
< К х D222 ^ я н =§ о и Щ Q223 ^ D222Q223 G 2 (3,0%) 10 (27,0%) 9 (36,0%) 21 (16,3%)
N 0 3 (8,1%) 2 (8,0%) 5 (3,9%)
Е 4 (6,0%) 14 (37,8%) 11 (44,0%) 29 (22,5%)
2 (3,0%) 0 0 2 (1,6%)
V 0 1 (2,7%) 0 1 (0,8%)
R 0 2 (5,4%) 13 (52,0%) 15 (11,6%)
Любые замены 4 (6,0%) 15 (40,5%) 20 (80,0%) 39 (30,2%)
Примечание. Здесь и в табл. 3: D - аспарагиновая кислота; G - глицин; N - аспарагин; Е - глутаминовая кислота; V - валин; Q - глутамин; R - аргинин.
Таблица 3
Обнаружение аминокислотных замен в рецепторсвязывающем сайте гемагглютинина в штаммах от госпитализированных больных с летальным и благоприятным исходом заболевания (2009-2011)
Исход заболевания Обнаруженные замены в РСС НА1 Штаммы с заменами в РСС НА1
D222 Q223
G N Е V Итого R
n % n % n % n % n % n % n %
Летальный (26 пациентов) 13 50,0 4 15,4 0 0 1 3,8 18 69,2 8 30,8 23 88,5
Нелетальный (103 пациента) 8 7,8 1 1,0 2 1,9 0 0 71 10,7 7 6,8 16 15,5
и NS) и «евразийского» (ЛА и М) [1, 3]. Генотипическая схема реассортации имела следующий вид [8]: [С, D, Е, 1В, А, 2А, А, 1A] ®[F, G, I, 1С, F, 1F, F, 1Е] ^ [С, D, Е, 1B, А, 1F, F, 1А]. Вместе с тем в формировании указанных генотипов вируса гриппа А свиней большую роль сыграли штаммы, адаптированные как к птицам (которые являются природным резервуаром этого вируса), так и к людям (с которыми домашние свиньи тесно взаимодействуют) [21].
Смешанная а2-3/а2-6-РС пандемического вируса гриппа А (H1N1) pdm09 с самого начала указывала на возможность эволюции возбудителя в направлении селекции пневмотропных вариантов. Действительно, с середины августа 2009 г. в мире, по официальным данным, смертность выросла в 3 раза, достигнув в октябре 2009 г. более 1%, что на порядок выше в сравнении с сезонным гриппом. В ноябре 2009 г. - январе 2010 г. в ЦЭЭГ при ФГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоц-развития России были переданы на экспертизу более 80 материалов от умерших больных - во всех случаях смерть наступила от пневмонии без прижизненного этиологического диагноза, а следовательно, без ранней этиотропной терапии.
В 2009-2011 г. наивысшая смертность наблюдалась среди беременных и больных с сопутствующей патологией: преобладали болезни сердца и сосудов (36,2%), сахарный диабет (15,3%); хроническим алкоголизмом и метаболическим синдромом (ожирением) страдали 18,6 и 52,4% соответственно. При поступлении в отделение реанимации у всех пациентов с последующим летальным исходом имелись признаки полиорганной недостаточности и острого повреждения легких: гипертермия, гипоксемия, гипоксия, рентгенологически - двусторонняя диффузная инфильтрация. При
клиническом анализе крови выявлялись лейкопения и тромбоцитопения (у 33,3% пациентов), высокие значения лактатдегидрогеназы (ЛДГ), креатинфосфоки-назы (КФК), креатинина. Основной причиной смерти являлось развитие острого респираторного дистресссиндрома (ОРДС) и легочно-сердечной недостаточности.
Подобно другим исследователям, мы наблюдали 3 типа пневмоний, осложнявших течение пандемического гриппа: первичная вирусная пневмония развивалась в течение первых 5-7 сут заболевания, вторичная (вирусно-бактериальная, связанная главным образом со Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus и т. п.) -на 7-10-е сутки, третичная - после 10 сут болезни (ассоциированная с грамотрицательной бактериальной микрофлорой).
Первичная вирусная пневмония характеризуется выраженной интоксикацией, нередко - геморрагическими проявлениями (носовые кровотечения, прожилки крови в мокроте), быстрым нарастанием дыхательной недостаточности (чувство нехватки воздуха, одышка, усиление цианоза). При аускультации на вдохе определяются характерные крепитирующие хрипы. Двустороннее поражение легких и выраженная дыхательная недостаточность соответствуют острому повреждению легких (ОПЛ). Развивающийся ОРДС проявляется значительной артериальной гипоксемией и диффузными альвеолярными инфильтратами. При компьютернотомографическом исследовании обычно выявляют неравномерные утолщения межальвеолярных и межлобулярных перегородок («сетчатое легкое») и снижение прозрачности легочных полей по типу «матового стекла». Признаки активности бактериальной инфекции, как правило, обнаружить не удается. У большинства
18
больных отмечается лейкопения, тромбоцитопения, высокий уровень ЛДГ, КФК. Пневмония как осложнение гриппа является серьезной угрозой жизни пациента. Именно поэтому необходимо как можно более раннее применение этиотропных химиопрепаратов для предупреждения летальных исходов.
Штаммы, изолированные от больных с ЛПВП, имели повышенную РС к а2-3-СГП (см. рис. 1, б—д) вследствие аминокислотных замен в РСС НА1: D222{G, N, Е}, Q223R (рис. 2, см. 2-ю полосу обложки, табл. 2). Вирус гриппа А, подобно другим РНК-содержащим вирусам, существует в форме популяции даже на уровне отдельного организма-хозяина, и сиквенс представляет лишь консенсусную последовательность такой популяции, внутри которой могут присутствовать минорные варианты с заменами, не отразившимися в сиквенсе, но эти варианты могут селектироваться при благоприятных для вирусной популяции условиях. На специфичность взаимодействия НА1 с СГП могут влиять не только аминокислотные замены непосредственно в РСС, но и аминокислотные замены в других доменах гемагглютинина, приводящие к изменению конформации и молекулярной динамики РСС. Кроме того, на доступность РСС для клеточного сиалозидного рецептора и его СГП-аналога могут влиять тонкие взаимодействия между гемагглютинином и нейраминидазой, активность ферментативного центра которой, хотя и инактивируется искусственно при постановке СФА, но стерические взаимодействия этой молекулы с гемаг-глютинином, способные повлиять на РС, полностью исключать нельзя. Наконец, следует учитывать возможное наличие у пациента индивидуальных факторов риска развития осложнений, а у вируса - иных факторов патогенности, помимо РС. На патогенность вируса влияет, по-видимому, именно РС гемагглютинина, но нельзя исключить наличие у пандемического вируса других, неизвестных пока, факторов патогенности, не связанных с РС.
Вычисляя для каждого штамма величину параметра W для каждой группы (W3/6 ^ 1,0 или 1,0 < W3/6 ^ 1,5 либо W3/6 > 1,5) определяли частоту интересующих аминокислотных замен и ЛПВП. Соответствующие данные представлены на рис. 2 и в табл. 2. Для группы W/6 ^ 1,0 отсутствуют случаи ЛПВП, в группе 1,0 < W3/6 ^ 1,5 их частота составляет 5,4%, а в группе W3/6 > 1,5 -почти на порядок выше (52%). Это согласуется с ранее полученными нами данными [5] по высоковирулентным штаммам гриппа А (R5N1) птиц, W3/6 > 2,5, что, по данным ВОЗ и научной литературы, сочетается у людей с тяжелой первичной вирусной пневмонией и 60% летальностью [www.who.int]. В нашем случае в группе W3/6 > 1,5 летальность также составляет 60%, тогда как в группах 1,0 < W3/6 ^ 1,5 и W3/6 ^ 1,0 - около 30 и 0% соответственно.
Возрастание а2-3-РС коррелирует с повышением частоты аминокислотных замен в РСС НА1: 6,0, 37,8 и 44,0% соответственно. Среди замен в 222-й позиции НА1 чаще всего (3,0, 27,0 и 36%) встречается замена на глицин (G, Gly), которая широко обсуждается в научной литературе как маркер повышения РС к а2-3-сиалозидам [3, 4, 11, 17, 20]. Замена D222 также была описана в связи с возникновением тяжелых форм гриппа [9]. Замена D222E характерна для птичьих штаммов [10, 15, 18], однако встречается лишь в группе W3/6 < 1,0 (аналогичное наблюдение о связи D222E с нелетальными случаями гриппа А (НШ1 )pdm09 приведено в работе [19]): по-видимому, эта замена слишком «радикальна» и не способствует репродукции в клетках млекопитающих. Аминокислотная замена Q223R и ее влияние на возрастание а2-3-РС и вероятности ЛПВП описаны
нами впервые, при этом указанная замена значима, так как отрицательно заряженный аминокислотный остаток замещается положительно заряженным. По нашим данным, среди штаммов, выделенных от больных с ЛПВП, в 88,5% случаев обнаружены аминокислотные замены в РСС НА1, причем в 69,2% замены обнаружены в D222 (в основном на G) и в 30,8% - в Q223. Среди штаммов от больных с благополучным исходом мутации в РСС НА1 имели место лишь в 15,5% случаев: в сайте D222 - 10,7%, в сайте Q223 - в 6,8% (табл. 3). Ранее представленные нами данные относились к частоте обнаружения мутаций в РСС НА1 (около 1,0%) в первичных биологических материалах в основном от негоспитализированных больных [3, 4].
Для тех штаммов, которые были изолированы из различных участков респираторного тракта (бронхов, трахеи, легкого), имеет место соотношение W3/6 (бронхи) < W3/6 (трахея) < W3/6 (легкое), что отражает возрастающую положительную селекцию вируса в направлении а2-3-РС при движении вниз по респираторному тракту человека. Например, у погибших больных с Чукотки в пробах из носоглотки найден немутировавший пандемический вирус (D222), в трахее-бронхах - смесь немутанта и мутанта (D222 + G222 + N222), а в легких - только мутанты (G222 + N222) с измененной РС. Это прямое подтверждение на клиническом материале формирования мутантов с их последующей селекцией.
Вместе с тем повышение а2-3-РС, увеличивая возможности вируса поражать нижние отделы респираторного тракта, одновременно снижает его способность репродуцироваться в верхних отделах и передаваться воздушно-капельным путем. По мере развития пандемии число штаммов с повышенной специфичностью к а2-3-сиалозидам существенно возросло в эпидсезоне 20102011 гг. по сравнению с предыдущим (см. рис. 2). Их распространение среди населения может способствовать увеличению числа случаев первичных вирусных пневмоний. Все это диктует необходимость ранней специфической противовирусной терапии гриппа для предотвращения тяжелых осложнений и летальных исходов [3, 4, 7].
ЛИТЕРАТУРА
1. Грипп, вызванный новым пандемическим вирусом А/Н1Ш swl: клиника, диагностика, лечение: Метод. рекомендации / Львов Д. К., Малышев Н. А., Колобухина Л. В. и др. - М., 2009.
2. Львов Д. К., Бурцева Е. И., Принтов А. Г. и др. Изоляция 24.05.2009 и депонирование в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ № 2452 от 24.05.2009) первого штамма А/Мозссго/01/2009 (НШ1) swl, подобного свиному вирусу А(Н1Ш) от первого выявленного 21.05.2009 больного в г. Москве // Вопр. вирусол. - 2009. - Т. 54, №
5. - С. 10-14.
3. Львов Д. К., Бурцева Е. И., Принтов А. Г. и др. Возможная связь летальной пневмонии с мутациями пандемического вируса гриппа А/Н1Ш swl в рецепторсвязывающем сайте субъединицы НА1 гемагглютинина // Вопр. вирусол. - 2010. - Т. 55, № 4. - С. 4-9.
4. Львов Д. К., Яшкулов К. Б., Прилипав А. Г. и др. Обнаружение аминокислотных замен аспарагиновой кислоты на глицин и аспарагин в рецепторсвязывающем сайте гемагглютинина в вариантах пандемического вируса гриппа А Н1Ш swl от больных с летальным исходом и со среднетяжелой формой заболевания // Вопр. вирусол. - 2010. - Т. 55, № 3. - С. 15-18.
5. ПрошинаЕ. С., ЩелкановМ. Ю., ФедякинаИ. Т. и др. Рецепторная специфичность штаммов высоковирулентного вируса гриппа А (Н5Ш), изолированных на территории России (2005-2010) // Материалы IX науч.-практ. конф. «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, РФ, 6-7 октября 2011 г.). - М., 2011.
6. Стариков Н. С., Щелканов М. Ю., Бовин Н. В., Львов Д. К. Статистические подходы к обработке спектров рецепторной специфичности вирусов гриппа А // Материалы IX науч.-практ. конф. «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, РФ, 6-7 октября 2011 г.). - М., 2011.
7. Чучалин А. Г. Грипп: уроки пандемии (клинические аспекты) // Пульмонология. - 2010. - Приложение 1. - С. 3-8.
19
8. Щелканов М. Ю., Львов Д. К. Генотипическая структура рода Influenza A virus // Вестн. РАМН. - 2011. - № 5. - С. 19-23.
9. Balraj P, Sidek H., Suppiah J. et al. Molecular analysis of 2009 pandemic influenza A(H1N1) in Malaysia associated with mild and severe infections // Malays. J. Pathol. - 2011. - Vol. 33, № 1. - P. 7-12.
10. Gambaryan A. S., Tuzikov A. B., Piskarev V. E. et al. Specification of receptor-binding phenotypes of influenza virus isolates from different hosts using synthetic sialylglycopolymers: non-egg-adapted human HI and H3 influenza A and influenza B viruses share a common high binding affinity for 6’-sialyl(N-acetyllactosamine) // Virology. - 1997. -Vol. 232. - P. 345-350.
11. Glaser L., Stevens J., Zamarin D. et al. A single amino acid substitution in 1918 influenza virus hemagglutinin changes receptor binding specificity // J. Virol. - 2005. - Vol. 79, № 17. - P. 11533-11536.
12. Kilander A., RykkvinR., DudmanS. G., HungnesO. Observed association between the HA1 mutation D222G in the 2009 pandemic influenza A (H1N1) virus and severe clinical outcome, Norway 2009-2010 // Euro Survell. - 2010. - Vol. 15, № 9. - P. 19498.
13. Lvov D. K., Bovin N. V., Prilipov A. G. et al. HA1 receptor-binding site of influenza A (H1N1)v among patients with lethal and non- lethal pneumonia in Russia (2009-2011) // Proceedings of International Congress of International Union of Microbiological Societies (Sapporo, Japan; September, 2-16, 2011). - Sapporo, 2011. - VI-PO55-5.
14. Matrosovich M. N., Mochalova L. V., Marinina V. P. et al. Synthetic polymeric sialoside inhibitors of influenza virus receptor-binding activity // FEBS Lett. - 1990. - Vol. 272. - P. 209-212.
15. Matrosovich M., Tuzikov A., Bovin N. et al. Early alterations of the receptor-binding properties of HI, H2, and H3 avian influenza virus hemagglutinins after their introduction into mammals // J. Virol. - 2000. - Vol. 74, № 18. - P. 8502-8512.
16. Paulson J. C., Sadler J. E., Hill R. L. Restoration of specific myxovirus receptors to asialoervthrocytes by incorporation of sialic acid with pure sialyltransferases // J. Biol. Chem. - 1979. - Vol. 254, № 6. - P. 21202124.
17. PuzelliS., FacchiniM., SpagnoloD. et al. Transmission of hemagglutinin D222G mutant strain of pandemic (H1N1) 2009 virus // Emerg. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 16, № 5. - P. 863-865.
18. Rogers G. N., Paulson J. C., Daniels R. S. et al. Single amino acid substitutions in influenza haemagglutinin change receptor binding specificity // Nature. - 1983. - Vol. 304, № 5921. - P. 76-78.
19. Valli M. B., Selleri M., Meschi S. et al. Hemagglutinin 222 variants in pandemic (H1N1) 2009 virus // Emerg. Infect. Dis. - 2011. - Vol. 17, № 4. - P. 749-751.
20. WHO. Preliminary review of D222G amino acid substitution in haemagglutinin of pandemic influenza A (H1N1) 2009 viruses. - WHO Report. - 28 December 2009. - http://www.who.int/csr/resources/ publications/swineflu/hlnl_d222g/en/index.html.
21. Zimmer S. M., Burke D. S. Historical Perspective - Emergence of Influenza A (H1N1) viruses // N. Engl. J. Med. - 2009. - Vol. 361. - P. 279-285.
Поступила 29.09.11
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 616.98:578.832.1]-036.22
Е. И. Бурцева1, Д. К. Львов1, М. Ю. Щелканов1, Л. В.Колобухина1, А. Г. Прилипов1, С. В. Альховский1, В. В. Лаврищева1, Е. С. Шевченко1, И. Т. Федякина1, В. Т. Иванова1, Н. В. Белякова1, Е. С. Прошина1, Д. Д. Абрамов3, С. В. Трушакова1, Л. Н. Меркулова1, Р. В. Вартянян1, Л. Б. Кистенева1, Е. И. Самохвалов1, Т. А. Оскерко1, Е. Л. Феодоритова1, Э. В. Силуянова1, Е. А. Мукашева1, А. Л. Беляев1, В. Е. Маликов2, Н. А. Малышев2
Особенности социркуляции вирусов гриппа в постпандемический период 2010-2011 гг. по итогам деятельности Центра экологии и эпидемиологии гриппа ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России
'ФГБУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России; 21-я клиническая инфекционная больница;
3ЗАО НПО «ДНК-Технология», Москва
Представлены результаты мониторинга циркуляции вирусов гриппа в сезоне 2010-2011 гг., который охватывает 2-й год циркуляции пандемических штаммов A (H1N1)v, и их взаимодействия с сезонными штаммами A (H3N2) и В. В отличие от предыдущего сезона начало подъема заболеваемости регистрировали в январе 2011 г., максимальные показатели заболеваемости на большинстве сотрудничающих территорий были отмечены в период от 5-7 нед 2011 г. с последующим снижением до пороговых уровней к 11-й неделе 2011 г. Наиболее вовлеченными в эпидпроцесс были дети дошкольного и школьного возраста. Установлена циркуляция 3 штаммов вирусов гриппа - A (H1N1)v, A (H3N2) и В. Выявлены различия по долевому участию вирусов гриппа на отдельных территориях РФ. Детальное типирование выделенных штаммов определило соответствие подавляющего большинства из них вакцинным вирусам. Штаммы пандемического вируса гриппа A (H1N1)v сохранили чувствительность к озельтамивиру и были резистентными к ремантадину. Определено долевое участие возбудителей ОРВИ негриппозной этиологии: вирусов парагриппа - 11,9%, аденовирусов - 5,9%, РС-вирусной инфекции - 3,5%, микоплазмы пневмонии - 0,7%, что было сравнимо с предыдущими эпидемическими сезонами.
Ключевые слова: эпидемический сезон 2010-2011 гг., сезонные и пандемические штаммы вирусов гриппа, антигенные свойства, чувствительность к этиотропным препаратам
The specific features of the cocirculation of influenza viruses in the 2010-2011 postpandemic period according to the results of activities of the D. i. ivanovsky Research institute of Virology, Ministry of Health and Social Development of Russia
E. I. Burtseva1, D. K. Lvov1, M. Yu. Shchelkanov1, L. V. Kolobukhina1, A. G. Prilipov1, S. V. Alkhovsky1,
V. V. Lavrishcheva1, E. S. Shevchenko1, I. T. Fedyakina1, V. T. Ivanova1, N. V. Belyakova1,
E. S. Proshina1, D. D. Abramov3, S. V. Trushakova1, L. N. Merkulova1, R. V. Vartyanyan1, L. B. Kisteneva1, E. I. Samokhvalov1, T. A. Oskerko1, E. L. Feodoritova1, E. V. Siluyanova1, E. A. Mukasheva1, A. L. Belyaev1,
V. E. Malikov2, N. A. Malyshev2
Контактная информация:
Бурцева Елена Ивановна, д-р мед. наук; e-mail: Elena-burtseva@yandex.ru
20
