CC BY
28
МЕДИКО-БМОЛОГИНЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ
Короткие АФП14-20-подобные мотивы онкофетальных белков как возможные структурные маркеры их общих функций
А.А.Терентьев, Н.Т.Молдогазиева, И.М.Мохосоев
Российский государственный медицинский университет, кафедра биохимии лечебного факультета, Москва (зав. кафедрой - чл.-кор. РАМН, проф. А.А.Терентьев)
В первичной структуре факторов роста, белков клеточной адгезии и ряда других белков, обладающих онкофетальны-ми свойствами, нами обнаружены прямые и инвертированные мотивы, сходные с последовательностью LDSYQCT аль-фа-фетопротеина человека (а.о. 14-20). При этом часть аминокислотных остатков как прямых, так и инвертированных мотивов, названных АФП14_20-подобными мотивами, является высококонсервативной и может участвовать в связывании с рецептором. Прямые и инвертированные мотивы мозаичных, полифункциональных белков связаны консенсусным мотивом CXXGY/FXGX и обнаруживаются в составе их ЭФР-подобных модулей. Предполагается, что эти мотивы могут рассматриваться в качестве маркеров участия этих белков в регуляции эмбрионального развития и опухолевого роста. Ключевые слова: альфа-фетопротеин, эпидермальный фактор роста, рецептор ЭФР, прямые и инвертированные мотивы, онкофетальные белки
Short AFP14-20 motifs of oncofetal proteins as possible structural markers for their common functions
A.A.Terentiev, N.T.Moldogazieva, I.M.Mokhosoev
Russian State Medical University, Department of Biochemistry of Medical Faculty, Moscow (Head of the Department - Cor. Member of RAMS, Prof. A.A.Terentiev)
In this article we demonstrate that short sevenamino-acid residue motifs with high degree of similarity to the sequence LDSYQCT (residues 14-20) of human alpha-fetoprotein (AFP) are characteristic for a number of tumor-associated fetal proteins. In mosaic and multi-modular proteins such motifs, termed AFP14-20-like motifs, are localized within their EGF-like modules. Interestingly, AFP14-20-like motifs were found in the proteins not only in the direct, but also in the inverted form and they are linked with each other though consensus octapeptide CXXGY/FXGX. Here we suppose that short AFP14-20-like motifs are responsible for common functions of the proteins and may be considered as a signature of their participation in regulation of embryonic and tumor cell proliferation, differentiation, migration and survival.
Key words: alpha-fetoprotein, epidermal growth factor, receptor for EGF, direct and inverted motifs, oncofetal proteins
В течение последнего десятилетия накоплены данные, свидетельствующие о наличии ряда важных общих свойств у онкофетальных белков, к которым принадлежит аль-фа-фетопротеин (АФП), и полипептидных факторов роста. Во-первых, у этих двух групп негомологичных белков существует ряд общих структурных особенностей, например высокое содержание остатков цистеина, включая наличие сдвоенных ци-стеинов. Во-вторых, факторы роста, как и АФП, способны регулировать пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптоз эмбриональных и опухолевых клеток, т.е. они могут рассматриваться в качестве онкофетальных белков [1-3].
При сравнительном анализе первичных структур факторов роста и АФП ранее в составе последнего был обнаружен
Для корреспонденции:
Молдогазиева Нурбубу Тентиевна, кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии лечебного факультета Российского государственного медицинского университета Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1 Телефон: (495) 434-0588
Статья поступила 06.05.2008 г., принята к печати 25.02.2009 г.
структурный мотив, сходный с функционально важным участком эпидермального фактора роста (ЭФР) [4]. Последовательности LDSYQCT в составе АФП человека (аминокислотные остатки (а.о.) 14-20) и LDKYACN в составе ЭФР человека (а.о. 26-32) показали 57% идентичности и 86% общего сходства (с учетом консервативных замен а.о.) [5]. Последовательность LDKYACN в составе ЭФР человека содержит а.о., принимающие участие в связывании с рецептором. Исходя из этого можно предположить, что последовательность LDSYQCT в составе АФП также может являться частью его рецепторсвязывающего участка.
Длинные, содержащие от 25 до 40 а.о., ЭФР-подобные модули ранее были обнаружены в составе ряда мозаичных, мультимодульных белков, таких как факторы роста суперсемейства ЭФР, а также ряда мембранных белков, факторов коагуляции, ферментов и белков клеточной адгезии, участвующих в регуляции эмбрионального развития и опухолевого роста. Видимо, ЭФР-подобные модули этих белков играют роль сигналов, определяющих их участие в регуляции пролиферации и дифференцировки клеток [6].
А.А.Терентьев и др. / Вестник PTMy, 2009, №2, с. 65-6В
Факторы роста семейства ЭФР и их рецепторы. ЭФР
синтезируется в виде большой молекулы предшественника (препро-ЭФР), состоящей из 1207 а.о., из которой образуется зрелая молекула (53 а.о.). Примечательно, что в состав предшественника входят восемь ЭФР-подобных модулей и гидрофобный участок, расположенный у С-конца, благодаря которому он может существовать в виде гликозилированно-го мембранного белка [7].
Семейство эпидермального фактора роста, кроме самого ЭФР, включает TGF-a, амфирегулин, гепаринсвязывающий ЭФР-подобный фактор роста, бетацеллюлин, эпирегулин, томорегулин и различные изоформы неурегулинов (NRG-1, NRG-2, NRG-3 и NRG-4). Все члены этого семейства обладают общностью строения, а именно, их зрелые молекулы состоят примерно из 50-60 а.о. и содержат в своем составе шесть остатков цистеина, образующих три внутримолекулярные дисульфидные связи [8]. Дисульфидные мостики между С6-С20, С14-С31 и С33-С42 формируют три петли: А, В и С соответственно (рисунок). Факторы роста семейства ЭФР осуществляют свое действие с участием мембранного рецептора, который принадлежит к семейству рецепторов ErbB. У млекопитающих оно включает в себя четыре рецептора: ErbBI (обозначаемый также РЭФР или HER1), ErbB2 (HER2/Neu), ErbB3 (HER3) и ErbB4 (HER4). Рецепторы данного семейства состоят из внеклеточного лигандсвязы-вающего домена, единственного гидрофобного трансмембранного домена и внутриклеточного домена, обладающего тирозинкиназной активностью. Внеклеточный домен РЭФР человека состоит из 619 а.о. и подразделяется на четыре субдомена, обозначаемые I, II, III и IV.
Анализ кристаллической структуры комплекса ЭФР с его рецептором показывает, что в составе РЭФР можно выделить три участка взаимодействия с молекулой лиганда: участок 1 локализован в субдомене I рецептора, а участки 2 и 3 - в субдомене III рецептора. Петля B в составе ЭФР (а.о. 20-31) взаимодействует с участком 1, петля А (а.о. 6-19) и R41 в составе ЭФР взаимодействуют с участком 2, а С-концевая часть и R45 молекулы ЭФР - с участком 3 [9]. При этом наиболее важными для взаимодействия оказываются следующие а.о. в составе ЭФР:
1) в составе петли B - это М21, I23, L26 и А30, которые участвуют в гидрофобных взаимодействиях с участком 1 рецептора. Аминокислотный остаток N32 в составе ЭФР участвует в образовании водородных связей. Важность этих а.о. была подтверждена в экспериментах по мутагенезу ЭФР, показавших, что точечные замены этих а.о. приводят к уменьшению или потере связывающей способности;
2) а.о. Н10, Y13 и L15 в составе петли А участвуют в образовании гидрофобных связей между ЭФР и участком 2 рецептора;
3) третью группу составляют а.о, входящие в состав С-кон-цевого участка ЭФР: это L47, который участвует в образовании гидрофобных взаимодействий с а.о. участка 3 рецептора, а также R41, Q43 и R45, которые, видимо, участвуют в образовании водородных связей (рисунок).
Альфа-фетопротеин. Как и все секретируемые белки, АФП синтезируется в виде предшественника, из которого путем отщепления сигнального пептида в ходе процессинга образуется зрелая молекула, состоящая у человека из 591 а.о.
АФП является гликопротеидом с молекулярной массой около 69 кДа и содержанием углеводов до 3-5% (базы данных Swiss-Prot/TrEMBL, GenBаnk). АФП относится к белкам, богатым остатками цистеина, которые составляют 5,4% аминокислотных остатков в его составе, причем половина из них является сдвоенными цистеинами. Остатки цистеина, включая сдвоенные цистеины, характеризуются высокой степенью консервативности: они обнаруживаются в последовательностях всех белков семейства альбумина, к которому принадлежит АФП, и у всех биологических видов. С ис-
Таблица 1. Прямые и инвертированные АФП14_20-подобные мотивы белков, регулирующих эмбрио- и канцерогенез
Название белка и номера а.о. АФП14-20-подобных и консенсусного мотивов Аминокислотная последовательность прямых, инвертированных и консенсусных мотивов Шифр белка в базе данных Swiss-Prot / TrEMBL
ЭФР человека (а.о. 26-47) LDKYACN CVVGYIGE RCQYRDL P01133
ЭФР мыши (а.о. 26-47) TGF-a человека (а.о. 27-48) Бетацеллюлин человека (а.о. 57-78) LDSYTCN CVIGYSGD RCQTRDL EDKPACV CHSGYVGA RCEHADL EQTPSCV CDEGYIGA RCERVDL P01132 P01135 P35070
ГС-ЭФР человека (а.о. 88-109) LRIPSCH CLPGYHGQ RCHGLTL Q06175
Простагландин G/H синтаза-1 человека (а.о. 28-49) LDRYQCD C(T)RTGYSGP NCTIPGL P23219
Вирусный фактор роста человека (а.о. 45- 66) IDGMYCR CSHGYTGIRCQHVVL P20494
Эпиген человека (а.о. 48-69) LEKAICR CFTGYTGE RCEHLTL Q6UW88
Нейрогенный белок Notch (а.о. 720-741) INGYNCS CLAGYSGA NCQYKLN P07207
Лактадгерин человека (а.о. 27-48) FPSYTCT CLKGYAGN HCETKCV Q08431
Родственный кадерину опухолевый супрессор (а.о. 3989-4010) LDGAVCQ CDSGFRGE RCQSDID Q14517
Матрилин-2 человека (а.о. 357-378) DDSYTCE CLEGFRLA EDGKRCR 000339
Ламинин-2 (a-цепь) человека (а.о.1467-1489) LDDYRCT (A)CPRGYEGQ YCERCAP P24043
Фактор коагуляции VII человека (а.о. 65-86) LQSYICF CLPAFEGR NCETHKD P08709
Фактор коагуляции IX человека (а.о. 84-105) INSYECW CPFGFEGK NCELDVT P00740
Фактор коагуляции X человека (а.о. 65-86) Томорегулин человека (а.о. 68-89) Белок, подобный дельта-4 человека (а.о. 279-300) Полидом мыши: а) а.о.1270-1291 LGEYTCT CLEGFEGK NCELFTR GESYQNE CYLRQAAC KQQSEIL QRSYTCT CRPGYTGV DCELELS LASYRCT CVKGYMGV HCETDVN P00742 Q9UK5 Q9NR61 Q9ES77
б) а.о. 1384-1405 LNSYSCK CQPGFSGH RCETEQP Q9ES77
в) а.о. 4148-4269 NGSYVCS CNPPYTGD GKNCAEP Q9ES77
Сокращения: АФП - альфа-фетопротеин, ЭФР - эпидермальный фактор роста, TGF-a (transforming growth factor-a) - трансформирующий фактор роста-a, ГС-ЭФР - гепаринсвязывающий ЭФР. Нумерация а.о. дана для зрелых полипептидных цепей. Курсивом выделены мотивы, соответствующие консенсусному CXXGY/FXGX.
Короткие АФП14-20-подобные мотивы онкофетальных белков как возможные структурные маркеры их общих функций
Таблица 2. АФП14-2:-подобные мотивы трансформирующих факторов роста TGF-P человека
Названия белков и номера а.о. Аминокислотные составы Степень Доля консервативных Суммарное Шифр белка
в их АФП14-20-подобных мотивах АФП14-20-подобных мотивов идентичности замен а.о. сходство, % в базе данных
Swiss-Prot/ TrEMBL
АФП человека (а.о.14-20) TGF-p1 (а.о. 2-8) L D S Y Q C T L D T N Y C F 7/7 (100%) 3/7 (43%) 0/7 (0%) 3/7 (42%) 100 85 P02771 P01137
TGF-P1 (а.о. 54-60) L D T Q Y S K 2/7 (28%) 4/7 (57%) 85 P61812
TGF-P3 (а.о. 2-8) L D T N Y C F 3/7 (43%) 3/7 (42%) 85 P10600
Сокращения: АФП - альфа-фетопротеин, TGF-fi (transforming growth factor-в) - трансформирующий фактор роста-fí. Нумерация а.о. дана для зрелых молекул белков.
пользованием метода кругового дихроизма продемонстрировано, что вторичная структура АФП представлена, в основном, а-спиралью (до 65-67%) и не содержит р-складча-той структуры [10]. Пространственная организация АФП была изучена методом электронной микроскопии, который продемонстрировал существование и-образной структуры с тремя областями плотности масс: одна - на вершине и две -по краям молекулы. Таким образом, была показана трехдо-менная организация молекулы АФП. Домены I, II и III имеют сходную вторичную структуру и содержат 68, 55 и 71% а-спирали, соответственно, но отличаются параметрами третичной структуры. Домены I и III имеют жесткую, компактно упакованную третичную структуру и связаны между собой протеолитически лабильным, гибким доменом II. С-кон-цевая часть домена II содержит шарнирный участок, который придает всем остальным доменам подвижность и тем самым может способствовать взаимодействию АФП с лиган-дами или с другими белками.
Способность АФП стимулировать пролиферацию, диффе-ренцировку и апоптоз клеток, как эмбриональных, так и опухолевых, опосредуется рецепторами, существующими на их поверхности [11]. Однако строение рецептора для АФП, а также механизмы белок-рецепторного взаимодействия и передачи сигнала остаются неизученными.
Интенсивные исследования, осуществляемые в течение последнего десятилетия с целью выяснения биологической роли АФП и выявления его функционально важных участков, показали, что он является мультимодульным и полифункциональным белком. В составе АФП обнаружено более 20 коротких аминокислотных последовательностей, сходных
Петля А
/G - D - H* - S - L - P - C - E - S - D - S - N • C - L* - H - D - G - V - C - M* - Y*
Y*
N32
N-конец
1(971) Петля В
/С - A* - Y* - K - D - L*I - A - E - I*
С - V - V - G - Y
Г
E - G - I
Петля С
С - R*
\ Y - R* - D - L
- K - W - W - E - L - К 53 (1023) \
С-конец
Рисунок. Первичная структура ЭФР человека с картированием АФП14-20-подобных и консенсусного мотивов. Выделены мотивы, сходные с гептапептидом LDSYQCT АФП человека: прямой LDKYACN (а.о. 26-32) и инвертированный RCQYRDL (а.о. 41-47). Звездочкой (*) отмечены а.о., для которых показано участие в связывании с рецептором (РЭФР). N32 - шарнирный участок. Нумерация а.о. дана для зрелой молекулы, в скобках дана нумерация для полной полипептидной цепи.
с функционально важными участками ряда физиологически активных белков, в том числе полипептидных факторов роста. Часть из этих последовательностей получена путем химического синтеза в виде отдельных пептидных фрагментов и изучена в различных тестах биологической активности.
Одним из этих функционально важных участков является гептапептид LDSYQCT (а.о. 14-20), сходный с частью рецеп-торсвязывающего участка ЭФР человека (табл. 1). Этот геп-тапептид был получен методом химического синтеза на твердой фазе и изучен нами в различных тестах биологической активности. Выяснилось, что синтетический пептид способен регулировать пролиферацию лимфоцитов периферический крови человека, активационный апоптоз клеток больных инфекционным миокардитом и бронхиальной астмой, а также поглощение глюкозы эритроцитами больных сахарным диабетом.
Методами молекулярной динамики нами были также изучены конформационно-динамические свойства гептапепти-да LDSYQCT и его аналогов, полученных с помощью точечных замен аминокислотных остатков [12, 13]. Показана значительная консервативность конформационно-динамиче-ских свойств пептида при заменах Y17F, Y17S и D15E. Установлено, что замены C19A и S16V вызывают только локальные изменения в динамическом поведении пептида, а химическая модификация цистеина (С19) или димеризация пептида путем образования дисульфидной связи между остатками цистеина двух параллельных пептидных цепей, а также замены C19G, C19S, Q18E и D15N изменяют конформа-ционные возможности и динамическое поведение всех аминокислотных остатков. При этом наиболее существенные изменения происходят при заменах незаряженного аминокислотного остатка на заряженный и наоборот.
Обнаружение АФП^о-подобных мотивов в белках, ассоциированных с эмбрио- и канцерогенезом. Прямые АФПц-20-подобные мотивы. Как уже упоминалось ранее, нами в составе домена I АФП и петли В ЭФР человека обнаружены сходные структурные мотивы. Это последовательности LDSYQCT в составе АФП (а.о.14-20) и LDKYACN в составе ЭФР человека (а.о. 26-32). С использованием программы для локального выравнивания FASTA из базы данных первичных структур белков Swiss-Prot/TrEMBL нами были извлечены последовательности, содержащие аналогичные мотивы, обозначенные как АФПм-щ-подобные мотивы. Такие мотивы были обнаружены нами также в составе других факторов роста семейства ЭФР и в ЭФР-подобных модулях и их повторах в белках клеточной адгезии, некоторых мембранных белках, факторах коагуляции и ферментах, участвующих в регуляции эмбрио- и канцерогенеза (табл. 1). АФП14-20-подобные мотивы обнаружены также в составе трансформирующих факторов роста TGF-P1 и TGF-P2 чело-
А.А.Терентьев и др. / Вестник РГМУ, 2009, №2, с. 65-68
века (табл. 2). Следовательно, в составе этих неродственных и негомологичных белков обнаруживаются сходные мотивы, что указывает на существование структурных предпосылок для наличия у них общих функциональных свойств.
Инвертированнные АФП14-20-подобные мотивы. Структурные мотивы, сходные с АФПм_20-подобными, но уже в инвертированном виде, обнаруживаются в составе ряда белков семейства ЭФР и в составе ЭФР-подобных модулей и их повторах в ряде белков. При этом прямые и инвертированные мотивы оказываются связанными через октапептидный мотив, общая формула которого для разных последовательностей соответствует CXXGY/FXGX. Как продемонстрировано ниже, инвертированные мотивы так же, как и прямые, могут содержать а.о., необходимые для связывания с рецептором, т.е могут иметь важное функциональное значение.
Возможное функциональное значение АФП добных мотивов. На основании сравнения АФП^о-подоб-ных мотивов различных белков можно сделать предположение о том, что аминокислотные остатки в их составах также могут участвовать во взаимодействии с рецептором. Так, сравнение последовательностей LDSYQCT в составе АФП (а.о.14-20) и LDKYACN в составе ЭФР человека (а.о. 26-32) показывает, что а.о. L26 и А30 соответствуют L14 и Q18 в составе АФП человека, которые также способны участвовать в гидрофобных взаимодействиях с рецептором. А остатку N32 в составе ЭФР соответствует Т20 в составе АФП, гидро-ксильная группа которого может участвовать в образовании водородных связей.
Четыре из семи а.о. инвертированного АФП^о-подобно-го мотива RCQYRDL (а.о. 41-47) в составе ЭФР человека, а именно, R41, Q43, R45, L47, участвуют во взаимодействии с рецептором. Если сравнивать прямой и инвертированный мотивы ЭФР (LDKYACN и RCQYRDL), то L47 соответствует L26, Q43 соответствует А30, а R41 - N32 и боковые цепи этих а.о. участвуют в образовании гидрофобных или водородных взаимодействий. Видимо, взаимодействие ЭФР с его рецептором осуществляется, в основном, без участия СО- и NH-групп остова полипептидной цепи, т.е. направление полипептидной цепи не имеет значения. В этом случае можно предполагать, что инвертированные последовательности, обнаруженные в составе других факторов роста семейства ЭФР, также могут принимать участие в связывании с рецептором.
Возможно, короткие АФПм_20-подобные мотивы ответственны за наличие общих функций у онкофетальных белков и могут рассматриваться в качестве структурных маркеров белков, участвующих в регуляции пролиферации, диффе-ренцировки, миграции и апоптоза эмбриональных и опухолевых клеток.
Таким образом, альфа-фетопротеин, факторы роста суперсемейств ЭФР и TGF-b, а также ряд белков клеточной адгезии и миграции демонстрируют ряд сходных структурно-функциональных свойств, среди которых в первую очередь хотелось бы выделить наличие сходных пептидных мотивов, в том числе и в инвертированном виде. Наличие сходных гептапептидных мотивов создает структурные предпосылки для существования общих функциональных свойств у этих групп неродственных и негомологичных белков. Возможное
функциональное значение как прямых, так и инвертированных АФПм-20-подобных мотивов может заключаться в связывании с рецептором и опосредовании передачи сигнала внутрь клетки. При этом, вероятно, направление полипептидной цепи не имеет значения при взаимодействии аминокислотных остатков лиганда с рецептором.
Литература
1. Татаринов Ю.С. Содержание эмбриоспецифического альфа-глобулина в сыворотке крови плода человека, новорожденных и взрослых людей при первичном раке печени // Вопр. химии. - 1965. - T. 11. - C.20-24.
2. Abelev G.I. Alpha-fetoprotein in ontogenesis and its association with malignant tumors // Adv. Cancer Res. - 1971. - V.14. - P.295-358.
3. Favoni R.E., De Cupis A. The role of polypeptide growth factors in human carcinomas: new targets for a novel pharmacological approach // Pharmacol. Rev. -2000. - V.52. - №2. - P.179-206.
4. Терентьев А.А. Выявление гомологичных участков в первичных структурах альфа-фетопротеина, инсулина и некоторых факторов роста // Вестн. РГМУ. - 1997. - №3 . - C. 76-79.
5. Терентьев А.А., Молдогазиева Н.Т. Структурно-функциональное картирование альфа-фетопротеина //Биохимия. - 2006. - Т.71. - С.157-172.
6. Engel J. EGF-like domains in extracellular matrix proteins: localized signals for growth and differentiation? // FEBS Lett. - 1989. - V. 251. - P.1-7.
7. Brown P.M., Debanne M.T., Grothe S. et al. The extracellular domain of the epidermal growth factor receptor. Studies on the affinity and stoichiometry of binding, receptor dimerization and a binding-domain mutant // Eur. J. Biochem. -1994. - V. 225. - P.223-233.
8. Olayioye M.A., Neve R.M., Lane H.A., Hynes N.E. The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer // EMBO J. - 2000. - V. 19 - P.3159-3167.
9. Ogiso H., Ishitani R., Nureki 0. et al. Crystal structure of the complex of human epidermal growth factor and receptor extracellular domains // Cell. - 2002. -V.110. - P.775-787.
10. Luft A.J., Loscheider F.L. Structural analysis of human and bovine a-fetoprotein by electron microscopy, image processing and circular dichroism // Biochemistry. -1983. - V.22. - P.5971-5978.
11. Молдогазиева Н.Т., Терентьев А.А. Альфа-фетопротеин и факторы роста: структурно-функциональные взаимоотношения и аналогии // Успехи биол. хим. - 2006. - Т.46. - С. 99-148.
12. Молдогазиева Н.Т., Шайтан К.В., Терешкина К.Б., Антонов М.Ю., Терентьев А.А. Молекулярная динамика аналогов гептапептида LDSYQCT - фрагмента аль-фа-фетопротеина человека. Влияние диэлектрической проницаемости среды // Биофизика. - 2007.- Т.52 - С. 611-624.
13. Молдогазиева Н.Т., Терентьев А.А., Казимирский А.Н., Антонов М.Ю., Шайтан К.В. Конформационная динамика аналогов гептапептида LDSYQCT -фрагмента альфа-фетопротеина человека // Биохимия. - 2007. - Т.72. -С. 655-667.
Информация об авторах:
Терентьев Александр Александрович, член-корреспондент РАМН,
доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии
Российского государственного медицинского университета
Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1
Телефон: (495) 434-0588
E-mail: [email protected]
Мохосоев Иннокентий Маркович, кандидат биологических наук,
старший преподаватель кафедры биохимии Российского государственного
медицинского университета
Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, 1
Телефон: (495) 434-0588
E-mail: [email protected]
